專利名稱：快速診斷家畜日本血吸蟲病試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速診斷家畜日本血吸蟲病免疫層析試紙條及其制備方法與對家畜(動物)體內(nèi)抗日本血吸蟲抗體的檢測。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人、畜健康的寄生蟲病，其易感動物包括人、牛、羊等家畜及野生動物，涉及40多種哺乳動物。家畜感染血吸蟲不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，更為重要的是，患病家畜還是人體血吸蟲病最主要的傳染源，因此做好家畜血吸蟲病的查治是控制和消滅血吸蟲病的關(guān)鍵。目前家畜日本血吸蟲病的診斷方法主要是糞檢等病原學(xué)檢測及IHA、ELISA、Dot-ELISA等免疫學(xué)檢測方法，這些方法或費(fèi)時費(fèi)力、或需要儀器設(shè)備，不適合在現(xiàn)場廣泛推廣使用。在快速診斷人體血吸蟲病方面，已有相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道，但這些技術(shù)大都以膠體標(biāo)記抗人抗體或SPA為基礎(chǔ)建立的，不能應(yīng)用與家畜特別是牛血吸蟲病的快速診斷。長期研究和實(shí)踐證明，在應(yīng)用已有免疫學(xué)診斷技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展一種新穎、快速、簡便、適合于基層的能診斷多種動物血吸蟲病的免疫學(xué)診斷方法，以適用于現(xiàn)場大規(guī)模篩查家畜日本血吸蟲病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，設(shè)計(jì)一種操作簡便、快速診斷家畜日本血吸蟲病試紙條。
本發(fā)明提供了一種快速診斷家畜日本血吸蟲病試紙條。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的以膠體金標(biāo)記日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)作為探針制備成金標(biāo)墊，分別將SEA抗原及抗SEA抗體包被NC膜作為檢測線及控制線研制出試紙條，通過免疫層析的方法檢測樣品中的抗SEA抗體。具體如下本發(fā)明所用材料如下日本血吸蟲(中國大陸株)由本實(shí)驗(yàn)室通過釘螺和新西蘭大白兔維持生活史循環(huán)。氯化金、檸檬酸三鈉、碳酸鉀、精密pH試紙為上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品；BSA，Amresco公司分裝產(chǎn)品；206佐劑為法國德比克公司Montanide ISA產(chǎn)品；高速低溫臺式離心機(jī)，Sigma公司生產(chǎn)；低溫凍干機(jī)，F(xiàn)TC公司產(chǎn)品；ZX1000噴膜機(jī)、XYZ3200噴點(diǎn)機(jī)，Biodot產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜(型號AE98FAST)，德國Schleicher& Schuell公司產(chǎn)品；玻璃纖維紙、吸水紙、雙面膠塑料底板基因公司產(chǎn)品。
日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的制備為利用蓋玻片法子新西蘭大白兔腹部感染2000～2500條日本血吸蟲尾蚴，感染后40-50天取兔肝，收集純化蟲卵，液氮/水浴條件下反復(fù)凍融數(shù)次，加適量磷酸鹽緩沖液(PBS)，經(jīng)研磨、超聲粉碎、低溫離心，取上清，經(jīng)去離子水透析去鹽后按CBB-SDS法測定濃度，分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 抗SEA抗體的制備將SEA抗原溶液與206佐劑比混合，以每次1mg劑量腿部肌肉注射免疫新西蘭白兔，免疫3次后，取血，用瓊脂雙向擴(kuò)散法檢測到抗體滴度，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶32以上時，剖殺兔子，收集并分離血清。用硫酸銨鹽析法純化抗體，PBS反復(fù)透析至無SO42-，CBB-SDS法測定濃度后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 膠體金探針的制備為采用檸檬酸鈉還原法制備15-40nm的膠體金，冷卻后用0.1-0.5M的碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH至值7.0～8.0；并取1mL用Tris[三(羥甲基)氨基甲烷]-HCl緩沖液稀釋至60-100ug/mL的SEA在磁力攪拌下逐滴加入調(diào)好pH值的10mL膠體金溶液中，攪拌5-20min后加入穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌5-20min，10000-15000rpm，4℃離心5-30min，棄上清，用穩(wěn)定劑重懸沉淀，同上法重復(fù)洗離3次后重懸至2mL，加10％的NaN3(終濃度為0.2％)后于4℃保存。
金標(biāo)墊制備的最佳條件為用均漿劑預(yù)處理玻璃纖維，干燥；將SEA-膠體金探針加于XYZ3200噴點(diǎn)機(jī)中以5-20uL/cm2噴于玻璃纖維上，低溫凍干，于鋁箔袋中密封，4℃～20℃保存?zhèn)溆谩?br> 硝酸纖維素反應(yīng)膜的最佳制備條件為用Tris-HCl緩沖液將SEA、抗SEA抗體稀釋至所需濃度，分別加于ZX1000噴膜機(jī)中以1uL/cm噴膜包被，20-40℃干燥5min，封閉液封閉30min后用Tris-HCl緩沖液漂洗3次，37烘干約30min，密封后于4℃～20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測試紙條的組裝為將吸水紙、包被好的NC膜、金標(biāo)墊、另一吸水玻璃纖維等按土圖1-3所示從上到下依次固定在雙面膠塑料底板上，用裁剪刀或切條機(jī)切成25×50mm的試紙條，將做好的試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封于4℃-20℃保存。
本發(fā)明家畜日本血吸蟲病診斷試紙條，其檢測程序?yàn)槿?0uL待測血清加在吸水玻璃纖維上(樣品端)，立即插入裝有緩沖液(pH7.4的0.01M Tris-HCl)的塑料酶標(biāo)小杯中(注意不要將金標(biāo)墊插入緩沖液中)，約10～15min后觀察結(jié)果。
本發(fā)明其檢測樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)紅色的為陽性，僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色的為陰性，兩條線均無紅色的為試紙條失效(圖4)。
本發(fā)明的效果是操作簡便快速、不需要特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)即可操作，能較好滿足廣大基層疫區(qū)的需要，如疫病監(jiān)測、化療靶畜群的篩選等，具有廣闊的市場前景和大范圍推廣應(yīng)用的價值。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)特異性強(qiáng)，敏感性高，安全性好，適用范圍廣泛。本發(fā)明試紙條以膠體金為標(biāo)記物制備而成，沒有聯(lián)苯二銨等有害物質(zhì)及放射性元素的參與，其安全性好；SEA為可溶性蛋白抗原，具有良好的抗原性，以膠體金標(biāo)記SEA抗原，利用雙抗原夾心的原理，能檢測多種動物(包括人)抗血吸蟲抗體，因此具有很高的特異性和敏感性，其應(yīng)用范圍十分廣泛。
(2)操作簡便快速。使用本發(fā)明試紙條診斷家畜日本血吸蟲病時，無需另配其它試劑，樣品無需特殊處理，按檢測程序在10～15min內(nèi)即可判診斷結(jié)果。
(3)結(jié)果判定形象、準(zhǔn)確、可靠。本發(fā)明試紙條以顯色有無為檢測判斷結(jié)果，即檢測線出現(xiàn)紅色的即為陽性，無色的即為陰性，結(jié)果判斷形象，背景清晰，準(zhǔn)確可靠，無人為操作誤差。
(4)成本低，投資少。本發(fā)明試紙條可批量生產(chǎn)，單人單份檢測，成本低廉，投資少，見效快。


圖1是日本血吸蟲病診斷試紙條側(cè)面示意圖，圖中1為PVC底板，2為樣品吸墊，3為金標(biāo)墊，4為檢測線(T線)，5為控制線(C線)，6為NC膜，7為吸收墊。樣品吸收墊為玻璃纖維紙，吸收墊為吸水紙。
圖2為試紙條功能區(qū)，包括樣品端，結(jié)果顯示區(qū)和標(biāo)簽端；圖中1為PVC底板，2為金標(biāo)墊，3為樣品吸收墊，4為吸收墊，5為控制線(C線)，6為檢測線(T線)，7為NC膜。
圖3是試紙條檢測結(jié)果判斷，圖中1為陽性結(jié)果，2為陰性結(jié)果，3為試紙條失效；圖4是試紙條綿羊、水牛、小白鼠、新西蘭白兔血清的檢測結(jié)果，圖中1、2為檢測綿羊陽性及陰性血清結(jié)果，3、4為檢測水牛陽性及陰性血清結(jié)果，5、6為檢測小白鼠陽性及陰性血清結(jié)果，7、8為檢測新西蘭白兔陽性及陰性血清結(jié)果。
具體實(shí)施例一根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，具體制備如下(1)日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的制備用蓋玻片法于新西蘭大白兔腹部感染2000～2500條日本血吸蟲尾蚴，于42天殺兔，取肝臟除去膽管、血管及結(jié)締組織，用4℃預(yù)冷的1％NaCl溶液洗凈血污，剪碎加600mL的PBS，勻漿器勻漿粉碎后，分別過40目、80目、120目、160目、200目分離篩，取篩下物再用260目尼龍篩集卵，沉渣用PBS稀釋后，3500rpm5min反復(fù)離心，棄去上清和上層肝泥，直至沉淀呈金黃色，顯微鏡下觀察至背景干凈為止，再以12000rpm離心30秒，吸去上層水溶液，下層蟲卵于液氮/自來水條件下反復(fù)凍融數(shù)次，加適量PBS，研磨，冰浴條件下超聲處理6次，每次30see，間隔2min，4□40 000g離心1hr，取上清液，用去離子水透析2天，每天換3次水。透析去鹽后的上清液即為純凈的SEA抗原，按CBB-SDS法測定其濃度，分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)抗SEA抗體的制備用SEA抗原與206佐劑按重量比1∶1混合，以每次1mg抗原劑量，腿部肌肉注射免疫新西蘭白兔，三免后耳靜脈采血，雙向瓊脂擴(kuò)散法測定抗體滴度，當(dāng)抗體滴度達(dá)到1∶32以上時剖殺兔子采血，收集并分離血清，用硫酸銨鹽析法純化，在4□PBS中透析至無NH4+或是無SO42-為止，CBB-SDS法測定濃度后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)緩沖液、封閉液、穩(wěn)定劑、均漿劑的配制0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 17.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，定容至1000ml，調(diào)pH至7.4)；0.01MTris-HCl緩沖液(1.414gTris溶于1000mL去離子水中，用HCl調(diào)pH至7.4)；封閉液(3g脫脂奶粉溶于100mL0.01M的Tris-HCl中)；穩(wěn)定劑(1gBSA中血清白蛋白溶于100mLTris-HCl中)；均漿劑(3g蔗糖溶于100mLTris-HCl中)。
(4)膠體金探針的制備采用檸檬酸鈉還原法制備40nm的膠體金。
取500uL1％的檸檬酸三鈉加入煮沸的0.005％氯金酸中，待溶液煮至酒紅色后繼續(xù)煮5min制備得到40nm的膠體金，冷卻后用0.2M的碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH至7.0～7.5；在磁力攪拌下于調(diào)好pH值的10mL膠體金溶液中逐滴加入1mL用pH7.4的0.01MTris-HCl稀釋至80ug/mL的SEA，攪拌10min后加入穩(wěn)定劑1mL，繼續(xù)攪拌10min，12000rpm，4℃離心20min，棄上清，穩(wěn)定劑重懸沉淀，同上法離心，反復(fù)洗離3次后加穩(wěn)定劑重懸至2mL，加10％的NaN3(終濃度為0.2％)后于4℃保存。
(5)金標(biāo)墊制備將玻璃纖維用均漿劑浸泡片刻，37℃干燥30min；將SEA-膠體金探針加于XYZ3200噴點(diǎn)機(jī)中以10uL/cm2噴于玻璃纖維上，低溫凍干，裝入鋁箔袋中密封，4℃～20℃保存?zhèn)溆谩?br> (6)NC膜的包被選用孔徑為5um，爬速為120～160sec/4cm的NC膜。用pH7.4的0.01M Tris-HCl溶液將SEA稀釋至1.5mg/mL、抗SEA抗體稀釋至3.2mg/mL，分別加于ZX1000噴膜機(jī)中以1uL/cm噴膜，37℃干燥5min，用含3％脫脂奶粉的封閉液封閉30min，并用0.01MTris-HCl洗脫液飄洗3次，37℃烘干30min，密封后裝入含干燥劑的鋁箔袋中密封，4～20℃保存?zhèn)溆谩?br> (7)試紙條的組裝將吸水紙、包被好的NC膜、金標(biāo)墊、另一吸水玻璃纖維從上到下依次固定在雙面膠塑料底板上，用裁剪刀或切條機(jī)切成25×50mm的試紙條，將做好的試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封于4～20℃保存。
(8)試紙條檢測操作程序取20uL待測血清加在試紙條樣品端，立即將樣品端插入裝有緩沖液(0.01MTris-HCl緩沖液)的塑料酶標(biāo)小杯中(注意不要將金標(biāo)墊插入緩沖液中)，約10～15min后觀察結(jié)果。
(9)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在將紙條插入塑料酶標(biāo)小杯中約10～15min后觀察，若在質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)紅色的為陽性，檢測線出現(xiàn)的紅色較深的為強(qiáng)陽性，紅色較淺的為弱陽性，僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色的而檢測線無紅色的為陰性，兩條線均無紅色的為試紙條失效，需重新檢測。
具體實(shí)施例二(1)用本發(fā)明制備的試紙條分別對綿羊、水牛、新西蘭白兔、小白鼠的陽性和陰性血清各5份進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性血清均在C線和T線均出現(xiàn)紅色條帶，陰性血清只在C線出現(xiàn)紅色帶(見圖4)，表明利用雙抗原夾心法制備的試紙條能檢測多種動物日本血吸蟲病。
(2)試紙條檢測的敏感性和特異性實(shí)驗(yàn)用本發(fā)明試紙條分別檢測107份人工攻擊感染的陽性綿羊血清、80份健健康綿羊血清，結(jié)果其敏感性和特異性分別為91.6％及87.5％。
(3)交叉反應(yīng)試驗(yàn)用本發(fā)明試紙條檢測24份肝片吸蟲病羊血清及18份錐蟲病牛血清，結(jié)果與肝片吸蟲的交叉反應(yīng)率為12.5％、與錐蟲無交叉反應(yīng)。
(4)用試紙條檢測現(xiàn)場感染水牛血清用試紙條檢測20份糞檢確診的疫區(qū)放牧水牛陽性血清及15份陰性血清，結(jié)果其陽性血清的符合率為100％，檢測15份陰性血清中有兩例為陽性。
(5)重復(fù)性試驗(yàn)用不同批次制作的試紙條重復(fù)檢測5次綿羊陰、陽性血清各5份，結(jié)果陽性、陰性符合率均為100％。
3.6檢測效果與帶蟲量的關(guān)系用本發(fā)明試紙條分別檢測帶蟲量為2、12、21、32、47、51、63、97、209、765條/頭的水牛血清各一份進(jìn)行檢測，結(jié)果帶蟲量為2、12、21、32條/頭的水牛血清顯示為陰性，帶蟲量為47和51條的血清顯示為弱陽性，帶蟲量為63以上的顯示為強(qiáng)陽性。
權(quán)利要求
1.一種診斷家畜日本血吸蟲病試紙條，其特征在于該試紙條是由抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原抗體和日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原包被硝酸纖維膜作為質(zhì)量控制線和檢測線，用膠體金標(biāo)記日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原，利用雙抗原夾心法制成。
2.一種如權(quán)利要求1所述診斷家畜日本血吸蟲病試紙條的制備方法，該方法包括下列步驟(1)40nm膠體金溶液的制備采用檸檬酸鈉還原法制備40nm的膠體金。(2)膠體金標(biāo)記日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的緩沖液體系及標(biāo)記過程待膠體金冷卻后，用0.1-0.5M的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至值7.0-～8.0；并取1mL用Tris-HCl緩沖液稀釋至60-100ug/mL的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原在磁力攪拌下逐滴加入調(diào)好pH值的10mL膠體金溶液中，攪拌5-20min后加入穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌5-20min，12000rpm，4℃離心5-30min，棄上清，用穩(wěn)定劑重懸沉淀，同上法重復(fù)洗離3次后重懸至2mL，加10％的NaN3，終濃度為0.2％，后于4℃保存；(3)金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維用均漿劑浸泡片刻，20-40℃干燥30min；將日本血吸蟲或溶性蟲卵抗原-膠體金探針以5-20uL/cm2噴于玻璃纖維上，低溫凍干；(4)NC膜的包被用pH7.0-7.5的0.01-0.1M Tris-HCl溶液稀釋日本血吸蟲或可性蟲卵抗原、抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原抗體，分別以1uL/cm噴膜，20-40℃干燥，用含1-5％脫脂奶粉的封閉液封閉30min，用0.01-0.1M Tris-HCl洗脫液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后裝入含干燥劑的鋁箔袋中密封，4～20℃保存?zhèn)溆茫?5)試紙條的組裝將吸水紙、包被好的硝酸纖維膜、金標(biāo)墊、與吸水玻璃纖維從上到下依次固定在雙面膠塑料底板上，用裁剪刀或切條機(jī)切成試紙條。
3.一種如權(quán)利要求1所述診斷家畜日本血吸蟲病試紙條用于診斷家畜日本血吸蟲病的檢測方法，其特征在于該方法為，將待測血清加在試紙條樣品端，立即將樣品端插入裝有緩沖液的塑料酶標(biāo)小杯中，不要將金標(biāo)墊插入緩沖液中，10～15min后觀察結(jié)果質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)紅色的為陽性，僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色的為陰性，兩條線均無紅色的為試紙條失效。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速診斷家畜日本血吸蟲病的試紙條。本發(fā)明的試紙條由抗SEA抗體和SEA包被硝酸纖維膜作為質(zhì)量控制線和檢測線，用膠體金標(biāo)記SEA抗原，利用雙抗原夾心法制成。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡便快速。制備成本低、適宜于規(guī)模型生產(chǎn)。
文檔編號G01N33/532GK101038289SQ200610024699
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者林矯矯, 彭運(yùn)潮, 柴春彥, 劉金明, 李 浩, 劉春艷, 傅志強(qiáng), 石耀軍, 陸珂, 胡述光 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所, 湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)校, 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室