專利名稱：時間分辨熒光乳膠微粒免疫層析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法屬于固相膜免疫測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于免疫層析試驗的固相膜的制備方法和用途，尤其是用作乳膠微?？焖贉y定方法的分離、捕獲手段。
背景技術(shù)：
近年來，提供可靠、即時的檢測結(jié)果是檢驗醫(yī)學(xué)發(fā)展方向之一。這種需求促使各種能在患者身邊進行的醫(yī)學(xué)檢驗(POCT)產(chǎn)品不斷推出。20世紀90年代初發(fā)展起來的金標記免疫測定技術(shù)，已在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，涉及的檢測項目包括感染性疾病抗原、抗體，腫瘤標志物，心肌標志物，激素和藥物的檢測。但早期的POCT檢測靈敏度較低，故僅用于檢測某些特殊情況下體液中含量較高的物質(zhì)，又因為是單份試劑，很難保證每一試劑的同一性，質(zhì)量控制有困難，因此一般只能用于定性試驗。但是，隨著新材料和制作工藝的改進，POCT的檢測靈敏度已有很大的改進，其中，采用新的標記技術(shù)功不可沒，尤其是熒光法和化學(xué)發(fā)光法結(jié)合以高分子納米微粒作為標記物，可使檢測靈敏度達到pg/ml水平。更重要的是，其檢測范圍能夠跨越4-5個數(shù)量級，可有效地克服比色測定方法中存在的鉤狀效應(yīng)[TarkkinenP，Palenius T，Lovgren TClin Chem，2002，48269]。如美國Biosite公司推出的Triage Meterplus便攜式熒光探測儀配以相應(yīng)的免疫測試卡，可供定量檢測一系列心血管疾病的標志物[Thomas J.Clark，Paul H.McPherson，Kenneth FPoint of Care，2002，142]。國內(nèi)POCT免疫測定試劑的研發(fā)多著重在金標免疫測定法的定性和半定量研究上，金標定量的POCT平臺研發(fā)正處于起步階段，對于熒光檢測方面的創(chuàng)新性產(chǎn)品尚屬空白。
另外，在提高免疫測定系統(tǒng)靈敏度方面，(鏈霉)親和素-生物素放大系統(tǒng)也可發(fā)揮重要作用。親和素(avidin)亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pI＝10.5；每分子能結(jié)合4分子的生物素，二者之間的親和常數(shù)(K)為1015L/mol，比抗原和抗體間的親和力(K＝105-11L/mol)至少高1萬倍。由于這兩種分子間的高親和力，使得它們形成的復(fù)合物在強烈的清洗條件、pH變化或其它化學(xué)變化都不會發(fā)生解離。鏈霉親和素(Streptavidin SA)是Streptomycesavidin菌在培養(yǎng)過程中分泌的蛋白質(zhì)。由4條相同的肽鏈構(gòu)成。每條多肽鏈均有一個生物素結(jié)合位點。與親和素相比，SA是一種偏酸性的蛋白質(zhì)(pI＝6.0)、并且不帶糖基，用其檢測抗原、抗體或核酸，非特異性吸附顯著減少，靈敏度相應(yīng)提高。自上世紀70年代中期以來，利用(鏈霉)親和素和生物素之間強親和作用、多價反應(yīng)性以及可被熒光素、酶等多種材料標記的特性，已發(fā)展和建立起了許多新的檢測方法和技術(shù)，早期(鏈霉)親和素-生物素系統(tǒng)主要用來增強檢測反應(yīng)的信號。80年代以后出現(xiàn)了將(鏈霉)親和素制成固相用于反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離。此類固相試劑有(鏈霉)親和素包被的96孔酶標板用于ELISA、(鏈霉)親和素包被的硝酸纖維素膜用于免疫層析試驗、鏈霉親和素包被的磁性微球用于先進的各種發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)。此類固相試劑的優(yōu)點是(1)(鏈霉)親和素和生物素之間的結(jié)合力接近共價結(jié)合力，比抗原抗體之間的結(jié)合力高出近百萬倍，具有高速、高效、特異且穩(wěn)定的特點，將該系統(tǒng)用作固相捕獲試劑，尤其適合于快速測定方法中反應(yīng)物的分離，有利于提高檢測靈敏度。(2)(鏈霉)親和素包被的膜是一種通用的固相，適用于不同的反應(yīng)體系，尤其對于一些珍貴的抗體或抗原來講，通過標記生物素后再與(鏈霉)親和素結(jié)合，可使用量大幅度減少，從而降低成本。(3)(鏈霉)親和素-生物素系統(tǒng)具有放大效應(yīng)，用作固相捕獲試劑，結(jié)合、分離反應(yīng)物的能力高，有利于建立定量測定的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種用于免疫層析試驗的膜載體，以及利用該膜建立一種適用于微粒標記、結(jié)合內(nèi)標質(zhì)控的時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法。
本發(fā)明目的通過下述方案實現(xiàn)一種用于免疫層析試驗的膜載體，采用(鏈霉)親和素-生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物固定于膜載體上，其中，用(鏈霉)親和素預(yù)包被Fusion5膜，使得生物素標記的抗體、抗原或這些抗體抗原與另一個帶有標記物的抗體或抗原形成的復(fù)合物結(jié)合到該膜上。
利用所述的一種用于免疫層析試驗的膜載體，建立一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，包括下述步驟生物素化抗體的制備、免疫時間分辯熒光微粒的制備，采用Fusion5膜，通過(鏈霉)親和素包被該膜，制備(鏈霉)親和素固相膜檢測線和質(zhì)控線，最后，采用雙抗體夾心法快速檢測抗原。
本發(fā)明制備的膜具有的特點和優(yōu)點是(a)采用Whaterman公司新推出的膜Fusion5，與免疫層析試驗中常用的固相膜為硝酸纖微素膜相比較，F(xiàn)usion5膜流速快，親水性好，十分有利于珠子的釋放，有利于降低本底。(b)采用(鏈霉)親和素-生物素系統(tǒng)間接捕獲抗體、抗原的技術(shù)，解決了Fusion5直接包被抗體、抗原效果差的問題，提高了檢測的靈敏度。
本發(fā)明采用Fusion5膜，通過(鏈霉)親和素包被該膜的方式，克服了Fusion5膜吸附抗體或抗原等蛋白差的缺陷，從而達到二個作用(1)分離熒光微粒標記的抗原抗體復(fù)合物與游離抗原和抗體的作用；(2)固化抗原，尤其是小分子量蛋白，起到內(nèi)標質(zhì)控及定量作用。


圖1為檢測線、質(zhì)控線示意2為時間分辯熒光微粒測定甲胎蛋白結(jié)果圖
具體實施例方式
本發(fā)明一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，包括下述步驟生物素化抗體的制備、免疫時間分辯熒光微粒的制備，采用Fusion5膜，通過(鏈霉)親和素包被該膜，制備(鏈霉)親和素固相膜檢測線和質(zhì)控線，最后采用雙抗體夾心法快速檢測抗原。具體步驟如下(1)生物素化抗體的制備單克隆抗體腹水提純采用辛酸法[徐肇華，陶義訓(xùn)，陳福平上海免疫學(xué)雜志1989；945]。生物素標記單克隆抗體方法[Ternynck T，Avramers SMethods in Enzymology1990；184469]，1mg/ml抗體溶液中以1∶100摩爾數(shù)之比加入活化長鏈生物素(NHS-LC-biotin)，混勻后室溫放置2小時，裝入透析袋對磷酸鹽緩沖液PBS，0.02mol/l，pH7.2透析48小時，加等體積甘油，-20℃儲存?zhèn)溆谩?br> (2)免疫時間分辯熒光微粒的制備采用共價包被法高分子聚苯乙烯微粒，直徑為100nm，內(nèi)部包埋銪鉻合物，具有時間分辨熒光的特征，微粒表面具有高密度功能團-COOH，取25mg微粒用MES緩沖液(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)，pH6.0，0.1mol/l，含0.1％ Tween20，洗滌二次后，配成2.5ml懸液，使微粒濃度為10mg/ml；取含10％6-氨基正乙酸的MES緩沖液120μl加入到上述微粒懸液中，置室溫，搖床搖15min，加入含10％碳化二亞胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)的MES緩沖液100μl，室溫搖1h，離心20min，棄上清，用MES洗2次后，制成10mg/ml的懸液，加5mg抗體2.0mg/ml，置室溫搖30min；加10％ EDC和NHS各10μl，室溫搖4h，加10％BSA緩沖液封閉過夜；離心，加2.5ml，含0.1％ Tween20、0.5％BSA的MES溶液，4℃貯存。
(3)(鏈霉)親和素固相膜檢測線的制備取3μl(鏈霉)親和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2PBS)點于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置2小時，取出與干燥劑放在一起，置4℃?zhèn)溆?，如圖1檢測線、質(zhì)控線示意圖所示。
(4)(鏈霉)親和素固相膜質(zhì)控線的制備取3μl(鏈霉)親和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)點于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置過夜，然后點生物素標記的抗原，37℃放置2小時，取出與干燥劑放在一起，置4℃?zhèn)溆茫鐖D1所示。
(5)雙抗體夾心法快速檢測抗原(Dip-stick法)微孔容器中加入20μl抗原標準品或待測血清樣品，然后加20μl生物素化抗抗體(約2μg/ml)及20μl另一抗體標記的熒光微粒。室溫放置5分鐘，插入(鏈霉)親和素包被的固相膜，待孔中的液體走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走過膜以后，上儀器檢測結(jié)果。
應(yīng)用例1時間分辯熒光乳膠微粒測定肌紅蛋白定量曲線微孔容器中分別加入20μl肌紅蛋白抗原標準品，濃度(ng/ml)分別為500、50、5、0.5、0，然后加20μl生物素化抗肌紅蛋白抗體，約2μg/ml及20μl包被有抗肌紅蛋白抗體標記的時間分辯熒光微粒，混勻后，放置室溫5分鐘，插入(鏈霉)親和素包被的固相膜，待孔中的液體走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走過膜以后，上熒光探測儀檢測結(jié)果。
肌紅蛋白定量檢測值

應(yīng)用例2時間分辯熒光乳膠微粒測定甲胎蛋白微孔容器中加入20μl甲胎蛋白抗原參考標準品，然后加20μl生物素化抗甲胎蛋白抗體(約2μg/ml)及20μl另一株抗甲胎蛋白抗體標記的時間分辯熒光微粒?；靹蚝?，放置室溫5分鐘，插入(鏈霉)親和素包被的固相膜，待孔中的液體走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走過膜以后，紫外燈下觀測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用于免疫層析試驗的膜載體，采用(鏈霉)親和素-生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物固定于膜載體上，其特征在于用(鏈霉)親和素預(yù)包被Fusion5膜，使得生物素標記的抗體、抗原或這些抗體抗原與另一個帶有標記物的抗體或抗原形成的復(fù)合物結(jié)合到該膜上。
2.利用權(quán)利要求1所述的用于免疫層析試驗的膜載體實現(xiàn)的一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，包括下述步驟生物素化抗體的制備、免疫時間分辯熒光微粒的制備，采用Fusion5膜，通過(鏈霉)親和素包被該膜，制備(鏈霉)親和素固相膜檢測線和質(zhì)控線，最后采用雙抗體夾心法快速檢測抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，其特征在于所述的生物素化抗體的制備單克隆抗體腹水提純采用辛酸法，生物素標記單克隆抗體方法，1mg/ml抗體溶液中以1∶100摩爾數(shù)之比加入活化長鏈生物素(NHS-LC-biotin)，混勻后室溫放置2小時，裝入透析袋對磷酸鹽緩沖液PBS，0.02mol/l，pH7.2透析48小時，加等體積甘油，-20℃儲存?zhèn)溆?；所述的免疫時間分辯熒光微粒的制備采用共價包被法高分子聚苯乙烯微粒，直徑為100nm，內(nèi)部包埋銪鉻合物，微粒表面具有高密度功能團-COOH，取25mg微粒用MES緩沖液(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)，pH6.0，0.1mol/l，含0.1％Tween20，洗滌二次后，配成2.5ml懸液，使微粒濃度為10mg/ml；取含10％6-氨基正乙酸的MES緩沖液120μl加入到上述微粒懸液中，置室溫，搖床搖15min，加入含10％碳化二亞胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)的MES緩沖液100μl，室溫搖1h，離心20min，棄上清，用MES洗2次后，制成10mg/ml的懸液，加5mg抗體2.0mg/ml，置室溫搖30min；加10％EDC和NHS各10μl，室溫搖4h，加10％BSA緩沖液封閉過夜；離心，加2.5ml，含0.1％Tween20、0.5％BSA的MES溶液，4℃貯存；所述的(鏈霉)親和素固相膜檢測線的制備取3μl(鏈霉)親和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)點于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置2小時，取出與干燥劑放在一起，置4℃?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，其特征在于所述的(鏈霉)親和素固相膜質(zhì)控線的制備取3μl(鏈霉)親和素(1mg/ml in 0.02mol/l，pH7.2 PBS)點于Fusion5膜(0.5×3cm)上，37℃放置過夜，然后點生物素標記的抗原，37℃放置2小時，取出與干燥劑放在一起，置4℃?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種時間分辯熒光乳膠微粒免疫層析方法，其特征在于所述的雙抗體夾心法快速檢測抗原(Dip-stick法)微孔容器中加入20μl抗原標準品或待測血清樣品，然后加20μl生物素化抗體2μg/ml及20μl另一抗體標記的熒光微粒，混勻，室溫放置5分鐘，插入(鏈霉)親和素包被的固相膜，待孔中的液體走光以后，孔中加60μl蒸溜水，完全走過膜以后檢測。
全文摘要
本發(fā)明時間分辨熒光乳膠微粒免疫層析方法屬于固相膜免疫測定技術(shù)領(lǐng)域，尤其是用作乳膠微?？焖贉y定方法的分離、捕獲手段。一種用于免疫層析試驗的膜載體，采用(鏈霉)親和素－生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物固定于膜載體上，其中，用(鏈霉)親和素預(yù)包被Fusion5膜，使得生物素標記的抗體、抗原或這些抗體抗原與另一個帶有標記物的抗體或抗原形成的復(fù)合物結(jié)合到該膜上。利用膜載體實現(xiàn)的一種時間分辨熒光乳膠微粒免疫層析方法，包括下述步驟生物素化抗體的制備、免疫時間分辨熒光微粒的制備，采用Fusion5膜，通過(鏈霉)親和素包被該膜，制備(鏈霉)親和素固相膜檢測線和質(zhì)控線，最后采用雙抗體夾心法快速檢測抗原。
文檔編號G01N21/64GK1818653SQ200610024639
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者鄭佐婭 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院