專利名稱：D－二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床檢查領(lǐng)域，特別是可以在D-二聚體測定中使用的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
背景技術(shù)：
臨床檢查，特別是血液凝固-纖溶檢查領(lǐng)域中，已知有測定D-二聚體的方法。D-二聚體是血液凝固分子標(biāo)志物之一，通過對此的測定，對于獲得凝血、纖溶系統(tǒng)亢進(jìn)的各種栓塞癥或DIC(彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥)的診斷、上述疾病的病態(tài)把握或治療效果判斷等的指標(biāo)是重要的。
所謂D-二聚體(D-dimer)，是血液中的纖維蛋白原受凝血酶等的作用而凝固形成的聚合物——穩(wěn)定化纖維蛋白被纖溶酶之類的酶分解所得的纖維蛋白降解物，是DD/E級分和以此為基本單位的多聚體(XDP)的總稱。DD/E級分的多聚體包括DXD/YY級分(DD/E級分的3聚體)、YXY/DXXD級分(DD/E級分的5聚體)、DXXD/YXXY級分(DD/E級分的7聚體)等。
在臨床檢查領(lǐng)域中，一般來說，是采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者是使用精度管理用試劑以提高檢查可靠性。在D-二聚體的檢查中，由于是以人血漿作為檢體，希望所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者精度管理用試劑的反應(yīng)性與人血漿處于同樣程度。而且，由于優(yōu)選使得作為測定對象的檢體中的D-二聚體濃度處于定量點(diǎn)的范圍內(nèi)，為獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度，為了使得也可以測定含有高濃度的D-二聚體的檢體，很多情況下設(shè)定在正常值的上限以上。
以往，已知是把從人采取的血漿直接用作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者精度管理用試劑。這樣的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，雖然從反應(yīng)性相同這一方面是優(yōu)選的，但是D-二聚體的濃度不穩(wěn)定，或者其濃度低，對于獲得期望的標(biāo)準(zhǔn)曲線來說還不夠。此外，來自人的原料在穩(wěn)定供應(yīng)方面也存在問題。
栓塞癥患者血漿中的D-二聚體，以往據(jù)認(rèn)為是以分子量約23萬的DD/E級分為主成分，不過近年來逐步發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上是以DXD/YY級分、YXY/DXXD級分、DXXD/YXXY級分等分子量較高的多聚體為主成分的(參見非專利文獻(xiàn)1和2)。但是，根據(jù)以往的D-二聚體級分的純化方法(參見非專利文獻(xiàn)3和4)得到的D-二聚體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是較多含有DD/E級分的物質(zhì)，為適應(yīng)實(shí)際的栓塞癥患者的臨床舉動，希望獲得較多含有高分子量的多聚體的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
非專利文獻(xiàn)1Dempfle CE，Zips S，Ergul H，Heene DL；FibrinAssay Comparative Trial study group.The Fibrin AssayComparison Trial(FACT)evaluation of 23 quantitative D-dimerassays as basis for the development of D-dimer calibrators.FACTstudy group.Thromb Haemost.(2001)85671～678非專利文獻(xiàn)2Francis CW，Marder VJ，Martin SE；Plasmicdegradation of crosslinked fibrin.I.Structural analysis ofthe particulate clot and identification of new macromolecular-soluble complexes.Blood.1980 Sep；56(3)456～4非專利文獻(xiàn)3Gaffney PJ，Edgell T，Creighton-KempsfordLJ，Wheeler S，Tarelli E；Fibrin degradation product(FnDP)assaysanalysis of standardization issues and target antigensin plasma.Br J Haematol.1995 May；90(1)187～19非專利文獻(xiàn)4Olexa SA，Budzynski AZ；Primary solubleplasmic degradation product of human cross-linked fibrin.Isolation and stoichiometry of the(DD)E complex.Biochemistry.1979 Mar 20；18(6)991～995發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題

為此，本發(fā)明的目的在于提供與人血漿的反應(yīng)性達(dá)到同等程度的較多含有高分子量的D-二聚體的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
解決課題的方法本發(fā)明是含有如下的纖維蛋白降解物的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，含有的分子量50萬以上的纖維蛋白降解物的量，在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，占總峰面積的70％以上。
本說明書中，所謂“纖維蛋白降解物”，是纖維蛋白被酶作用所得的降解物，包括DD級分、DD/E級分(分子量約23萬)、DXD/YY級分(DD/E級分的3聚體)、YXY/DXXD級分(DD/E級分的5聚體)、DXXD/YXXY級分(DD/E級分的7聚體)之類的多聚體。
發(fā)明的效果本發(fā)明可以提供與栓塞癥患者的臨床舉動相一致的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和D-二聚體測定用精度管理試劑，可以提高DIC或深部靜脈血栓/肺栓塞癥(DVT/PE)的診斷靈敏度和特異性。


圖1圖1所示為在獲得本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的級分步驟中凝膠過濾層析的280nm波長下的圖示。
圖2圖2所示為本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的凝膠過濾層析中280mm的波長下的圖示。
圖3圖3所示為使用本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和來自DIC患者的血漿，通過膠乳凝聚法測定D-二聚體量時的結(jié)果。
圖4圖4所示為本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與來自栓塞癥患者的血漿進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包含在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，分子量50萬以上的纖維蛋白降解物占總峰面積的70％以上、優(yōu)選75％以上、更優(yōu)選80％以上的纖維蛋白降解物。
作為分子量50萬以上的纖維蛋白降解物，例如可舉出DXD/YY級分、YXY/DXXD級分、DXXD/YXXY級分等，但不限于此。另外，這樣的纖維蛋白降解物的分子量上限不特別限定，通常為200萬左右。
上述通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析的條件如下。
柱Sephacryl S-300HR(Amersham Pharmacia Biotech公司制)、1.6×70cm洗脫液含有0.1M NaCl的50mM Tris-醋酸緩沖液、pH7.1流速＝0.375mL/分檢測波長280nm流分容量1.5mL峰面積計算Peak Fit軟件本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以通過包括以可分解纖維蛋白的酶作用于纖維蛋白的步驟(以下稱為分解步驟)和所得的纖維蛋白降解物使用凝膠過濾層析級分的步驟(以下稱為級分步驟)的方法得到。
作為原料所使用的纖維蛋白，可以使用市售品，也可以由纖維蛋白原加以制備?；蛘?，也可以采用從纖維蛋白的氨基酸序列出發(fā)通過基因工程方法而制備者。作為由纖維蛋白原制備的方法，可以舉出將含有純化纖維蛋白原的溶液用凝血酶、XIII因子和鈣鹽作用的方法。該方法所得的纖維蛋白為凝膠狀，可以直接用于分解步驟，也可以用冷凍干燥法等去除水分，再粉碎，將成為粉末形狀的纖維蛋白用于分解步驟。
作為可分解纖維蛋白的酶，優(yōu)選纖溶酶、尿激酶和彈性蛋白酶，也可以使用其中的2種以上的組合。
分解步驟中纖維蛋白和酶的混合比，優(yōu)選纖維蛋白每1mg混合1～100mU的酶、更優(yōu)選1～75mU、再優(yōu)選5～50mU、特別優(yōu)選10～20mU。
分解步驟中，纖維蛋白與酶的反應(yīng)時間，優(yōu)選1～24小時左右，更優(yōu)選4～10小時左右。反應(yīng)溫度可以根據(jù)所用的酶的最適溫度而適當(dāng)選擇，在使用纖溶酶、尿激酶和彈性蛋白酶的情況下，優(yōu)選為約37℃。
在上述分解步驟的最終階段，優(yōu)選終止分解反應(yīng)。作為終止分解反應(yīng)的方法，只要是可以抑制酶活性的方法，沒有特別限定，例如可以舉出向反應(yīng)體系中添加酶抑制劑的方法。作為優(yōu)選的酶抑制劑，可以舉出抑肽酶。
級分步驟中，作為凝膠過濾層析中所用的凝膠粒子，只要是蛋白質(zhì)分離中通常所用者，就不特別限定，優(yōu)選排阻限為分子量104～106者，特別優(yōu)選Sephacryl S-300HR(Amersham Pharmacia Biotech公司)。
凝膠過濾層析中所用的洗脫溶劑，可以根據(jù)柱的種類適當(dāng)選擇，在使用上述的Sephacryl S-300HR的情況下，可以使用pH6～9左右的緩沖液，例如可舉出Tris-醋酸緩沖液。
將所得的洗脫液以一定量的流分級分，通過在280nm波長下測定各流分的吸光度、確認(rèn)流分中所含的蛋白質(zhì)的分子量、分離高分子量的級分，可以獲得期望的纖維蛋白降解物。確認(rèn)蛋白質(zhì)分子量的方法，只要是迄今公知的方法，則不特別限定，例如可舉出非變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法、凝膠過濾層析法等。
所得的纖維蛋白降解物中的D-二聚體收率優(yōu)選在30％以上，更優(yōu)選40％以上、特別優(yōu)選在50％以上。
本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可以以如上所得的纖維蛋白降解物本身、或者通過用適當(dāng)?shù)南♂屢合♂尅⒒蛘邼饪s，將濃度適當(dāng)調(diào)整而使用。此外，如上所得的纖維蛋白降解物也可以進(jìn)行冷凍干燥，在使用時添加緩沖液而使用。
本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以含有緩沖液、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(例如牛血清白蛋白(BSA)等)、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑(例如疊氮化鈉、抗生素等)等。
作為緩沖液，優(yōu)選在pH5～10、優(yōu)選在pH6～9具有緩沖作用者，可以舉出磷酸緩沖液、咪唑緩沖液、三乙醇胺-鹽酸、GOOD緩沖液等。作為GOOD緩沖液，可以舉出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPS0、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等各種緩沖液。特別優(yōu)選Tris。
本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在D-二聚體的測定中，可以作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者精度管理用試劑中的任一種而使用。
D-二聚體的測定法，只要是本領(lǐng)域通常所用的方法，沒有特別限制，可以舉出膠乳凝聚法、ELISA等。
實(shí)施例以下舉出實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例中使用以下的測定方法。
蛋白質(zhì)濃度測定通過在280nm下測定吸光度，用生理鹽水將蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度稀釋為100～700μg/mL，可以使用吸光度法(系數(shù)1.37；《初步重組蛋白質(zhì)純化手冊》(はじめての組換え蛋白質(zhì)の精製ハンドブツク)、Amersham Pharmacia Biotech出版)、Lowry法(Bio-Rad公司制試劑盒，Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，Randall RJ.Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem(1951)193265～275)或者Bradford法(Bio-Rad公司制試劑盒；《DC蛋白質(zhì)分析的操作方法》(DCプロテインアツセイの操作法)，日本Bio-Rad公司出版)的任一種方法進(jìn)行測定。作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用來自BSA由來的標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-Rad公司制)。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用5～10％梯度聚丙烯酰胺凝膠、MINI-PROTEIMI電泳裝置(Bio-Rad公司制)，在非還原下進(jìn)行。蛋白質(zhì)染色使用考馬斯亮藍(lán)(CBB)試劑盒(Bio-Rad公司制)進(jìn)行。高分子量蛋白質(zhì)與低分子量蛋白質(zhì)的比例采用PhotoCaptMW(Ver99.03)軟件，通過圖像解析算出。
實(shí)施例1(1)纖維蛋白的制備由起始原料的人纖維蛋白原出發(fā)，按以下次序制備纖維蛋白塊。精制纖維蛋白原原料(Enzyme Research Laboratories公司制)溶于50mM TBS(Tris 50mM、NaCl 0.15mM、pH7.4)使?jié)舛冗_(dá)到5mg/mL，加入氯化鈣(最終濃度25mM、Kishida化學(xué)公司制)、XIII因子(最終濃度10μg/ml、Fibrogammin制劑)后，添加人凝血酶(最終濃度2U/ml、三菱ウエルフア一マ公司制)。將此混合物在37℃溫育18小時，得到凝膠狀的纖維蛋白。所得凝膠用50mM的TBS(pH 7.4)洗1小時，去除水分后，移入玻璃茄形瓶中，用PE2049型冷凍干燥裝置(目本真空技術(shù)公司制)冷凍干燥、粉碎，得到纖維蛋白粉末。
(2)分解步驟所得的纖維蛋白粉末700mg加入50mL容量聚丙烯容器中，添加50mM TBS(pH7.4)35mL，溶解纖維蛋白使其濃度達(dá)到20mg/mL。向該溶液中添加纖溶酶(P4895、Sigma公司制)(最終濃度10mU/mL)、在37℃攪拌6小時。加入抑肽酶(拜耳公司制)使之最終濃度為1000U/ml后，以10,000×g、9℃離心分離15分鐘，得到上清(粗D-二聚體級分)。
(3)級分步驟上述分解步驟得到的粗D-二聚體級分上SephacrylS-300HR柱(1.6×70cm120mLl Amersham Pharmacia Biotech公司制)，所述柱已經(jīng)用3倍柱容量的Tris-醋酸(pH7.1)緩沖液(流速0.375mL/分)平衡化，蛋白質(zhì)上樣量為80mg。以含有抑肽酶100KIU/mL和0.1M NaCl的50mM Tris-醋酸(pH7.1)緩沖液作為洗脫液，流速0.375mL/分進(jìn)行洗脫。其中，使用藍(lán)色葡聚糖(blue dextran)(Amersham PharmaciaBiotech公司制)作為空白標(biāo)志物。按1.5mL進(jìn)行級分，對所得流分在280nm波長下測定吸光度。所得結(jié)果如圖1所示。
預(yù)先使用已知分子量的蛋白質(zhì)考察分子量與流分的關(guān)系時，在流分號30、40、50和60時，分別洗脫出分子量約100萬、分子量約50萬、分子量約20萬和分子量約10萬的蛋白質(zhì)。
此外，按照上述(1)～(3)同樣方式重復(fù)3次，凝膠過濾柱層析后所得洗脫圖顯示完全相同的模式(圖1)，確認(rèn)上述操作次序的重現(xiàn)性。
藍(lán)色葡聚糖洗脫后，回收280nm吸光度從最初峰到第3根的流分(圖1中流分27～39)，得到D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。測定所得的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中蛋白質(zhì)的量，為42.4mg，收率為53％。
此外，將此D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以同級分步驟相同的條件進(jìn)行凝膠過濾層析。對所得的流分測定280nm波長下的吸光度的結(jié)果如圖2所示。
在預(yù)先使用已知分子量的蛋白質(zhì)考察分子量與流分關(guān)系時，在流分號30、40、50和60，分別洗脫了分子量約100萬、分子量約50萬、分子量約20萬和分子量約10萬的蛋白質(zhì)。因此，到流分號40為止的峰面積用Peak Fit軟件計算時、為總峰面積的83％。
試驗(yàn)例1實(shí)施例1所得的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用含3％(w/v)BSA的磷酸緩沖液(pH7.5)分別梯度稀釋到1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，用以下的膠乳凝聚法測定D-二聚體量。同樣，30μg/mL左右的濃度DIC患者血漿(3檢體)梯度稀釋，用以下的膠乳凝聚法測定D-二聚體量。
以膠乳凝聚法測定D-二聚體量的方法首先，制備用識別D-二聚體的單克隆抗體致敏的膠乳粒子。將10％(w/v)聚苯乙烯膠乳懸浮液(積水化學(xué)公司制，粒徑0.245μm)0.5mL加入含有通過保藏編號FERMP-19867的、在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所保藏的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的識別D-二聚體的單克隆抗體——DD-M1653抗體的磷酸緩沖液(pH7.5)2.0mL(抗體濃度0.625mg/mL)中，用Vortex混合器混合。將該混合液離心分離(25,000×g、20分鐘)，懸浮于含1％(w/v)BSA的MOPSO緩沖液(pH7.1)2.5mL中。該懸浮液離心分離(25,000×g、20分鐘)，懸浮于含2％(w/v)BSA的MOPSO緩沖液(pH7.1)40mL中，得到含有固定了DD-M1653抗體的膠乳粒子的試劑。
本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用含3％(w/v)BSA的磷酸緩沖液(pH7.5)稀釋的溶液和作為陰性對照的含3％(w/v)BSA磷酸緩沖液(pH7.5)各14μL，與含聚乙二醇MOPSO緩沖液(pH7.1)84μL混合，37℃反應(yīng)5分鐘。向其中添加上述含有單克隆抗體結(jié)合膠乳粒子的試劑84μL，在800mm波長下，測定每1分鐘吸光度的變化量。
結(jié)果如圖3所示。
圖3中所用試樣及其稀釋前的濃度如下來自DIC患者的檢體DIC患者A濃度33μg/ml；DIC患者B濃度28μg/ml；DIC患者C濃度31μg/ml；本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)A濃度32μg/ml；DD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)B濃度31μg/ml；DD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)C濃度32μg/ml。
從圖3結(jié)果可見，本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以用于采用膠乳凝聚法進(jìn)行的D-二聚體量的測定，而且，可以獲得與稀釋比例相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)一步可見，對從DIC患者的血漿所得的結(jié)果也顯示同樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線模式。
另外，對于按實(shí)施例1操作方法重復(fù)3次得到的3批不同批次的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(DD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)A、B和C)，膠乳凝聚法均獲得同樣結(jié)果(圖3)。
試驗(yàn)例2本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與栓塞癥患者血漿中的D-二聚體級分電泳模式的比較使用實(shí)施例1所得的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和診斷為栓塞癥患者的血漿用クロツト分離器(希森美康公司制)血清化后的試樣，將其用1％(w/v)SDS溶液稀釋4倍在含0.1％(w/v)SDS的7.5％聚丙烯酰胺凝膠上用60伏特的恒電壓展開2.5小時。緩沖液使用含0.02％(w/v)SDS的25mM Tris-192mM甘氨酸緩沖液(pH7.5)。
該凝膠上貼合PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Amersham PharmaciaBiotech公司制)，通以1mA/cm2的電流，用3小時轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。之后，將膜浸在含有封閉液(5％脫脂乳、1％(w/v)BSA、0.1％(w/v)疊氮化鈉的PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4))，振蕩30分鐘。棄去封閉液，用含0.05％(w/v)Tween20的PBS(洗滌液)5分鐘、洗3次。將膜浸入含有作為1次抗體的兔抗纖維蛋白原多克隆抗體(グコサイトメトリ-公司制)100μg/mL和0.05％(w/v)Tween20的PBS中，振蕩60分鐘。用洗滌液洗5分鐘、3次后，將膜浸入含作為2次抗體的HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(グコサイトメトリ一公司制)100μg/mL和0.05％(w/v)Tween20的PBS，振蕩60分鐘。將膜用洗滌液洗5分鐘、3次后，使用4-氯-1-萘酚和過氧化氫，用HRP標(biāo)記試劑盒(Bio-Rad公司制)使蛋白質(zhì)的條帶可視化。
結(jié)果如圖4所示。
圖4所示檢體如下帶1分子量標(biāo)志物；帶2本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；帶3纖維蛋白降解物中，X級分、Y級分、D級分、E級分和DD級分(森永生化學(xué)研究所社制)；帶5～22來自栓塞癥患者的檢體。
從圖4結(jié)果可見，本發(fā)明的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，顯示與栓塞癥患者的檢體近似的D-二聚體分布。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供使D-二聚體標(biāo)準(zhǔn)化的物質(zhì)，對D-二聚體測定的臨床檢查的精度管理或測定誤差的判斷有貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.含有在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，總峰面積的70％以上為分子量50萬以上的纖維蛋白降解物的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，還含有緩沖液。
3.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，所述緩沖液具有5～10的pH。
4.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，還含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
5.權(quán)利要求4的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑是BSA。
6.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，所述纖維蛋白降解物在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，總峰面積的75％以上為分子量50萬以上。
7.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，所述纖維蛋白降解物在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，總峰面積的80％以上為分子量50萬以上。
8.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中，所述纖維蛋白降解物是纖維蛋白被選自纖溶酶、尿激酶和彈性蛋白酶至少之一的酶作用所得的。
9.權(quán)利要求1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是用作為D-二聚體測定精度管理用試劑的。
10.如下所述的D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制造方法使纖維蛋白被分解纖維蛋白的酶作用的分解的步驟；對所得的纖維蛋白降解物，采用凝膠過濾層析使得分子量50萬以上的成分含有70％以上的級分步驟；和使用級分了的纖維蛋白降解物制備D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的步驟。
11.權(quán)利要求10的制造方法，其中，所述酶是選自纖溶酶、尿激酶和彈性蛋白酶的至少一種。
12.權(quán)利要求10的制造方法，其中，所述D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含有緩沖液。
13.權(quán)利要求12的制造方法，其中，所述緩沖液具有5～10的pH。
14.權(quán)利要求10的制造方法，其中，所述D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
15.權(quán)利要求14的制造方法，其中，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑是BSA。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供D－二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本發(fā)明通過含有如下的纖維蛋白降解物的D－二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)在通過凝膠過濾層析進(jìn)行的分子量分析中，總峰面積的70％以上為分子量50萬以上的纖維蛋白降解物。
文檔編號G01N33/68GK1825119SQ200610009520
公開日2006年8月30日 申請日期2006年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者奧田昌宏, 竹下浩生 申請人:希森美康株式會社