專(zhuān)利名稱(chēng)：使用透明質(zhì)酸的小型肝細(xì)胞選擇性培養(yǎng)方法和分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的增殖性肝細(xì)胞(小型肝細(xì)胞)的分離方法和選擇性培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肝臟和肝細(xì)胞具有多種功能從而被稱(chēng)為體內(nèi)的化工廠。例如，90％以上的血清蛋白質(zhì)是由肝臟產(chǎn)生的，對(duì)體內(nèi)所攝入或者所產(chǎn)生的有害物質(zhì)進(jìn)行代謝，具有解毒功能。因此，各研究機(jī)構(gòu)正在進(jìn)行研究，培養(yǎng)肝細(xì)胞，以利用其具有的功能檢出有害物質(zhì)(生物傳感器)、利用其在體外生產(chǎn)人體所需的物質(zhì)。由于目前尚無(wú)保持已分化肝細(xì)胞功能的細(xì)胞株，所以為了供給用于這些研究的肝細(xì)胞，在每次實(shí)驗(yàn)中都必須分離成熟肝細(xì)胞。在這種情況下，所獲得的細(xì)胞數(shù)依賴(lài)于每個(gè)個(gè)體的肝細(xì)胞數(shù)。之所以這樣，是由于還沒(méi)有充分建立起來(lái)在維持肝細(xì)胞功能的同時(shí)增殖成熟細(xì)胞的方法。因此亟待穩(wěn)定而大量供給具有較多的成熟肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。雖然開(kāi)發(fā)將包括人在內(nèi)的動(dòng)物肝細(xì)胞冷凍、長(zhǎng)期保存、再次使用的方法是非常重要的課題，其已在世界范圍進(jìn)行研究，但是迄今為止，只報(bào)告了冷凍保存后復(fù)蘇的肝細(xì)胞能夠在培養(yǎng)皿中存活，短期保持70～80％左右的肝細(xì)胞功能。而且，在該報(bào)告中，復(fù)蘇的肝細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖能力，在短期內(nèi)就死亡了。
此外，人體因種種疾病，例如肝炎、肝硬化、肝癌等而進(jìn)入肝功能不全的狀態(tài)。由于目前人工肝臟尚未進(jìn)入實(shí)用階段，所以，目前的現(xiàn)狀是這些疾病的根本治療不得不依賴(lài)于肝臟移植。但是，在包括日本在內(nèi)的世界各國(guó)，盡管需要肝臟移植的患者大量存在，但是提供臟器的供體數(shù)卻只滿(mǎn)足需要數(shù)量的1成。因此，需要在體外(in vitro)形成能夠用于肝臟移植的肝組織的方法，和能夠用于該方法的肝組織的前體細(xì)胞集落及其體外制備方法。
另一方面，本發(fā)明者報(bào)告了在肝臟組織中存在由小型細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集團(tuán)，該小型細(xì)胞雖然在白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞角蛋白(CK)8、CK18等標(biāo)記物上表現(xiàn)出與成熟肝細(xì)胞幾乎相同的表型、在超微結(jié)構(gòu)上也具有肝細(xì)胞的特征，但是增殖能力強(qiáng)，將其命名為“小型肝細(xì)胞”(small hepatocyte)(Mitaka T.等人，Hepatology，16，440-447，(1992)；Mitaka T.，Sato F，Mizuguchi T等人，Hepatology29，111-135(1999))。
進(jìn)而，本發(fā)明者報(bào)告了從肝臟中獲得富含小型肝細(xì)胞的組分的方法(WO01/92481)、能夠保持肝細(xì)胞的功能和增殖能力的小型肝細(xì)胞冷凍保存方法、和適于該方法的小型肝細(xì)胞制備方法(WO 01/92481)。此外，本發(fā)明者報(bào)告了適用于制備可移植肝組織的小型肝細(xì)胞集落、其制備方法、由該小型肝細(xì)胞集落誘導(dǎo)肝組織的方法(WO02/088332)，也報(bào)告了體外推定藥物作用，特別是與正常的肝功能相關(guān)聯(lián)的作用的方法(WO 02/088332)。但是，來(lái)自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的增殖性肝細(xì)胞(小型肝細(xì)胞)的特異性標(biāo)志蛋白質(zhì)尚未明確，因此在高效的分離方法上還存在有改善的余地。
此外，也出現(xiàn)了若干涉及小型肝細(xì)胞與具有增殖能力的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的報(bào)告(特許第3211941號(hào)、特開(kāi)2002-078481、特開(kāi)平09-313172、特開(kāi)平08-112092)。此外，在特開(kāi)2002-045087中報(bào)告了具有由包括人在內(nèi)的異種動(dòng)物由來(lái)的肝細(xì)胞所構(gòu)成的肝臟的嵌合體動(dòng)物，和使用該嵌合體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的增殖性肝細(xì)胞(小型肝細(xì)胞)的分離方法和培養(yǎng)方法，特別是選擇性培養(yǎng)方法。
本發(fā)明提供一種高效分離、培養(yǎng)在小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)中成熟化而失去作為小型肝細(xì)胞的永久增殖能力的細(xì)胞(至少具有一部分成熟肝細(xì)胞功能的細(xì)胞)和小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，即，小型肝細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)方法。
目前，來(lái)自包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的增殖性肝細(xì)胞(小型肝細(xì)胞)的特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)尚不明確，難以提高分離方法和培養(yǎng)的效率。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，小型肝細(xì)胞特異性表達(dá)CD44，作為其配體的透明質(zhì)酸對(duì)該細(xì)胞的分離·培養(yǎng)是極為有用的，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞。
進(jìn)而，本發(fā)明提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括，在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞，以及將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離。
本發(fā)明提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟i)在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞的步驟；ii)在i)中獲得的培養(yǎng)物中，將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離的步驟；iii)將在步驟ii)中獲得的附著于透明質(zhì)酸的小型肝細(xì)胞與上述透明質(zhì)酸解離的步驟；和iv)針對(duì)步驟在iii)中獲得的小型肝細(xì)胞，重復(fù)步驟i)～iii)1個(gè)以上的循環(huán)的步驟。
此外，本發(fā)明還提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟i)在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物肝臟由來(lái)的細(xì)胞的步驟；ii)在i)中獲得的培養(yǎng)物中，將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離的步驟；iii)將附著于透明質(zhì)酸的小型肝細(xì)胞與上述透明質(zhì)酸解離的步驟；iv)重復(fù)步驟i)～iii)1個(gè)以上的循環(huán)的步驟；和v)回收與上述透明質(zhì)酸解離的細(xì)胞的步驟。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為小型肝細(xì)胞的高效分離方法和培養(yǎng)方法。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂“小型肝細(xì)胞”不只是意味著來(lái)自肝臟的小型的細(xì)胞，而是意味使用下述方法、或者基于該方法的方法從肝臟中分離出來(lái)的細(xì)胞，其是具有強(qiáng)增殖能力，在白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞角蛋白(CK)8、CK18等標(biāo)記物上表現(xiàn)出與成熟肝細(xì)胞幾乎相同的表型、在超微結(jié)構(gòu)上也具有肝細(xì)胞的特征的、來(lái)自肝臟的特殊種類(lèi)的小型細(xì)胞。該細(xì)胞是由本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的，在Mitaka T.等，Hepatology，16，440-447，(1992)，Mitaka T，Sato F，Mizuguchi T.等，29，111-135(1999)中有更詳細(xì)的記載。
在本發(fā)明中，可以將從肝臟制備的細(xì)胞組分直接通過(guò)本發(fā)明在透明質(zhì)酸存在下進(jìn)行培養(yǎng)和分離，也可以通過(guò)簡(jiǎn)單方法制備富含小型肝細(xì)胞的組分后，再將該組分應(yīng)用于本發(fā)明的方法。
富含小型肝細(xì)胞的組分，例如，能夠依照如下所述進(jìn)行制備。將從人或者其他動(dòng)物采集的肝臟組織以含有膠原酶等的溶液處理，即可獲得來(lái)自肝臟的細(xì)胞。此時(shí)，可以使用通常的膠原酶肝灌流法，例如，基于Seglen的方法(Selgen，PO.，Methods Cell Biol.，1976，13，29-83)的灌流法。根據(jù)需要，也可以將所獲得的細(xì)胞懸液通過(guò)適當(dāng)大小的篩孔等，除去未消化的組織殘?jiān)蛘咂渌慕M織碎片等。雖然以本發(fā)明的方法能夠直接從該細(xì)胞懸液中分離小型肝細(xì)胞，但是優(yōu)選將實(shí)質(zhì)細(xì)胞和不需要的組織碎片等盡可能除去后再應(yīng)用本發(fā)明的方法。
實(shí)質(zhì)細(xì)胞的去除可以通過(guò)如下所述的低速離心來(lái)進(jìn)行。所謂低速離心是指，用于將含有較多實(shí)質(zhì)細(xì)胞和不需要的組織碎片等的組分與含有較多非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的輕組分分離的必要條件，優(yōu)選為用于將含有實(shí)質(zhì)細(xì)胞和不需要的組織碎片等為主的組分與含有較多小型肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、而幾乎不含有實(shí)質(zhì)細(xì)胞的輕組分分離的必要條件。若以該條件將上述方法所獲得的、來(lái)自肝臟的細(xì)胞進(jìn)行分離，則能夠在上述的輕組分中獲得更多的小型肝細(xì)胞。更具體來(lái)說(shuō)，例如，通過(guò)將該細(xì)胞懸液低速離心，例如以50×g離心1分鐘，能夠?qū)⒑袑?shí)質(zhì)細(xì)胞為主的重組分和含有肝臟星狀細(xì)胞(Ito cell)、枯否細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cell)等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞為主的相對(duì)輕的細(xì)胞的輕質(zhì)上清組分進(jìn)行分離。在該離心條件下的上清組分中能夠獲得較多的小型肝細(xì)胞。
加速度越大，或者離心時(shí)間越長(zhǎng)，則上清組分中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的比率越少，但是沉淀的小型肝細(xì)胞的比率也增加了，所以離心優(yōu)選以約50×g進(jìn)行約1分鐘以下。也可以將上清組分進(jìn)一步反復(fù)離心、沉淀、懸浮，將實(shí)質(zhì)細(xì)胞和不需要的組織碎片去除。更具體來(lái)說(shuō)，例如，將上清組分以50×g離心5分鐘，以適量培養(yǎng)基將沉淀懸浮，進(jìn)一步以50×g離心5分鐘。以同樣的培養(yǎng)基將沉淀懸浮，再次以50×g離心5分鐘。以同樣的培養(yǎng)基將所獲得的沉淀懸浮，以150×g離心5分鐘，將沉淀的細(xì)胞懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)，然后培養(yǎng)，或者調(diào)節(jié)至處理所需要的細(xì)胞密度。通常調(diào)節(jié)至1×104～5×105的密度。
通過(guò)本發(fā)明的方法能夠培養(yǎng)所制備的含有較多小型肝細(xì)胞的組分和/或從所制備的含有較多小型肝細(xì)胞的組分中高效分離小型肝細(xì)胞。為了誘導(dǎo)以透明質(zhì)酸為配體的細(xì)胞表面受體的充分表達(dá)，優(yōu)選將所制備的含有較多小型肝細(xì)胞的組分在透明質(zhì)酸存在下培養(yǎng)3天以上，特別優(yōu)選培養(yǎng)5天以上后分離小型肝細(xì)胞。在培養(yǎng)初期，優(yōu)選在培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)內(nèi)以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以避免細(xì)胞的非特異性貼壁。RT-PCR的研究顯示，作為透明質(zhì)酸受體，CD44的表達(dá)在原代培養(yǎng)第2～3天左右開(kāi)始顯著，在培養(yǎng)開(kāi)始第3～5天后幾乎達(dá)到最大值。另一方面，已知成熟肝細(xì)胞不表達(dá)CD44(Terpe H-J，Stark H，Prehm P，Guenthert U.，Histochemistry，101，79-89(1994)；Goodison S，Urquidi V，Tarin D.，J.Clin.PatholMol Pathol.，189-196(1999))。
本發(fā)明者認(rèn)為，通過(guò)從肝臟制備細(xì)胞組分這種損傷來(lái)活化潛在存在的小型肝細(xì)胞，可能至少需要2天～3天。而且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，CD44的表達(dá)隨著小型肝細(xì)胞的成熟化而降低。此外，本發(fā)明者確認(rèn)，在大鼠中，在以半乳糖胺等引起強(qiáng)肝損傷時(shí)，在給藥幾天后，肝臟組織中出現(xiàn)CD44陽(yáng)性細(xì)胞，這與上述的研究是一致的。因此，當(dāng)從該預(yù)先引起強(qiáng)肝損傷的個(gè)體的肝臟來(lái)制備細(xì)胞組分時(shí)，能夠在透明質(zhì)酸存在下，通過(guò)更短時(shí)間的培養(yǎng)以分離小型肝細(xì)胞。
或者，也可以在非透明質(zhì)酸存在下將所制備的含有較多小型肝細(xì)胞的組分培養(yǎng)一段時(shí)間(前培養(yǎng))使小型肝細(xì)胞增殖后，再通過(guò)本發(fā)明的方法培養(yǎng)和/或高效分離小型肝細(xì)胞。而且，也可以將不經(jīng)過(guò)上述小型肝細(xì)胞濃縮操作而獲得的細(xì)胞組分、或者已經(jīng)在培養(yǎng)中的成熟肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移至存在透明質(zhì)酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以培養(yǎng)和/或分離小型肝細(xì)胞。這些細(xì)胞組分中當(dāng)然含有小型肝細(xì)胞。而且，認(rèn)為在成熟肝細(xì)胞的培養(yǎng)中能夠出現(xiàn)小型肝細(xì)胞。本發(fā)明者在WO 02/24875中記載了用于培養(yǎng)正常人成熟肝細(xì)胞的培養(yǎng)基和條件，使用該培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)的正常人成熟肝細(xì)胞也可以進(jìn)而采用本發(fā)明的、在透明質(zhì)酸存在下培養(yǎng)并分離。
在前培養(yǎng)時(shí)，可以在37℃下將上述制備好的、富含小型肝細(xì)胞的組分(細(xì)胞群)于含有血清、煙酰胺、維生素C、抗生素、生長(zhǎng)因子、以及其他在細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的添加物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，例如，添加了上述添加物的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)等。用于增殖或者維持小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選含有煙酰胺、維生素C、生長(zhǎng)因子、DMSO等。維生素C通常作為抗壞血酸-2-磷酸而添加，其濃度優(yōu)選為0.1mM～1.0mM，更優(yōu)選為0.5mM～1.0mM。煙酰胺以較高的濃度使用，優(yōu)選以1～20mM使用，更優(yōu)選以5mM～10mM使用。作為生長(zhǎng)因子，可以使用表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGFα)等，特別優(yōu)選TGFα。添加TGFα?xí)r，優(yōu)選以1μg/l～100μg/l，更優(yōu)選以5μg/l～l50μg/l的濃度使用。此外，在原代培養(yǎng)時(shí)，從培養(yǎng)開(kāi)始第4天起，優(yōu)選以約0.1～約2％(v/v)，更優(yōu)選以約0.5～約1.5％(v/v)的濃度添加DMSO。
作為用于前培養(yǎng)的培養(yǎng)容器，可以使用后述的透明質(zhì)酸結(jié)合的培養(yǎng)容器，也可以使用在通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)皿，例如，可商購(gòu)包被了來(lái)自牛真皮、鼠尾的膠原的各種大培養(yǎng)皿，或者也可根據(jù)需要制備這樣的培養(yǎng)皿，但是優(yōu)選使用未經(jīng)包被膠原的培養(yǎng)皿。這是因?yàn)?，?xì)胞外的基質(zhì)越少就越容易以溫和的條件剝離細(xì)胞。當(dāng)適用本發(fā)明的分離或培養(yǎng)法時(shí)，經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)后的細(xì)胞雖然能夠在金屬螯合劑和/或酶的存在下分離為單個(gè)細(xì)胞，但是對(duì)細(xì)胞的損傷大，所以?xún)?yōu)選以非酶方法將集落從培養(yǎng)容器中剝離?？墒褂玫慕饘衮蟿?，只要是對(duì)細(xì)胞毒性小的即可，可以將通常用于剝離貼壁細(xì)胞的，例如EDTA、EGTA和/或其鹽在其各自的通常濃度下使用。作為非酶細(xì)胞剝離劑，可以使用在不含Ca、Mg的Hanks緩沖液(pH值7.3～7.5)中添加了EDTA、甘油、枸櫞酸鈉等的溶液，例如，可以從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)名為Celldissociation solution的制備好的非酶細(xì)胞剝離劑?？梢允褂猛ǔ５?％二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。二氧化碳的濃度和培養(yǎng)溫度在通常培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所容許的范圍內(nèi)即可。更具體來(lái)說(shuō)，采用WO 01/92481所述方法和條件就能夠獲得前培養(yǎng)后的富含小型肝細(xì)胞的細(xì)胞懸液。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將透明質(zhì)酸結(jié)合(包被)于載體上，在該結(jié)合了透明質(zhì)酸的載體存在下，培養(yǎng)小型肝細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物肝臟由來(lái)的細(xì)胞。作為載體，可以使用能夠包被透明質(zhì)酸并且適合細(xì)胞培養(yǎng)的任何一種載體。該載體包括塑料制品或者玻璃制品(例如，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶(flask)、培養(yǎng)瓶(bottle)、塑料或者玻璃珠)、瓊脂糖，例如瓊脂糖珠、包被有透明質(zhì)酸的多孔物質(zhì)(例如海綿)、金屬、纖維素。當(dāng)使用細(xì)胞培養(yǎng)容器作為載體時(shí)，優(yōu)選使用細(xì)胞原本難以貼壁的載體，例如，無(wú)包被細(xì)胞培養(yǎng)容器，和細(xì)菌培養(yǎng)用的培養(yǎng)容器。
此外，在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，在由透明質(zhì)酸所構(gòu)成的載體，或者以透明質(zhì)酸為主要成分的載體，例如以透明質(zhì)酸構(gòu)成的、或者以透明質(zhì)酸為主要成分的多孔物質(zhì)，例如海綿這樣的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物肝臟由來(lái)的細(xì)胞。此時(shí)的培養(yǎng)容器與在上述透明質(zhì)酸包被載體共存下的培養(yǎng)時(shí)一樣即可。由于多孔物質(zhì)包被透明質(zhì)酸后小型肝細(xì)胞能夠附著的表面積大，所以?xún)?yōu)選將其作為載體。該多孔物質(zhì)可以是能夠包被透明質(zhì)酸，只要不含任何一種對(duì)細(xì)胞、特別是小型肝細(xì)胞有害的物質(zhì)即可。
將透明質(zhì)酸包被于載體，例如，能夠如下進(jìn)行。透明質(zhì)酸可商購(gòu)獲得。此外，透明質(zhì)酸通常以分子量約100萬(wàn)為界，分為低分子量透明質(zhì)酸和高分子量透明質(zhì)酸，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用高分子量透明質(zhì)酸。將透明質(zhì)酸，優(yōu)選高分子量透明質(zhì)酸以適當(dāng)?shù)臐舛?，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或者緩沖液中制備為溶液，例如，使得將1ml～5ml制備好的溶液接觸載體表面時(shí)，相對(duì)于載體的表面積的量為10μg/cm2～1000μg/cm2，更優(yōu)選為50μg/cm2～500μg/cm2。一般來(lái)說(shuō)，將透明質(zhì)酸溶液在適量的培養(yǎng)基或者緩沖液中制備為10～20mg/ml左右的儲(chǔ)存溶液是方便的。所使用的緩沖液可以使用對(duì)細(xì)胞無(wú)害的任何一種緩沖液，例如，可以使用Hanks液、普通的細(xì)胞培養(yǎng)基、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)等。緩沖液的pH值處于透明質(zhì)酸的溶解范圍內(nèi)即可，一般優(yōu)選為7.1～8.5。溶解透明質(zhì)酸時(shí)的溫度只要是透明質(zhì)酸溶解且不分解的溫度即可，考慮到通常的培養(yǎng)箱設(shè)定溫度，例如，能夠方便地使用30℃～40℃、特別是37℃左右的溫度范圍。
將所制備的透明質(zhì)酸溶液直接、或者根據(jù)情況適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基稀釋?zhuān)蛊渑c上述載體共存，將透明質(zhì)酸包被于載體上。當(dāng)包被相對(duì)防水性的載體時(shí)，若包被用的透明質(zhì)酸溶液較少，則可能無(wú)法充分覆蓋載體的表面，因此，將透明質(zhì)酸溶液稀釋而增加液體量是特別有用的。將0.5～20mg/mL，優(yōu)選1～10mg/mL的透明質(zhì)酸溶液與載體表面接觸用于包被，每1cm2的載體表面優(yōu)選為10μg～1000μg，更優(yōu)選為50μg～500μg。例如，當(dāng)用透明質(zhì)酸包被60mm培養(yǎng)皿時(shí)，會(huì)通過(guò)下述方法進(jìn)行包被以PBS等將所制備的10mg/ml的透明質(zhì)酸稀釋到1mg/ml，將1ml該稀釋液注入培養(yǎng)皿進(jìn)行包被。透明質(zhì)酸溶液和載體的接觸優(yōu)選在30℃～40℃，特別優(yōu)選在37℃左右孵育1小時(shí)～24小時(shí)左右。孵育的溫度和時(shí)間只要使透明質(zhì)酸溶液充分包被于載體上即可，雖然用于包被的孵育時(shí)間即使超過(guò)24小時(shí)也沒(méi)有問(wèn)題，但是長(zhǎng)時(shí)間包被是沒(méi)有優(yōu)勢(shì)的。
經(jīng)過(guò)充足時(shí)間的包被后，將透明質(zhì)酸溶液除去，以對(duì)細(xì)胞無(wú)害的緩沖液，例如PBS洗凈載體表面。根據(jù)需要，可以通過(guò)UV照射等對(duì)載體進(jìn)行滅菌。當(dāng)載體本身為培養(yǎng)容器時(shí)，添加后述的適于小型肝細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，當(dāng)載體為珠子或海綿等時(shí)，可以轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器中后再添加上述培養(yǎng)基。能夠?qū)⒄J(rèn)為含有小型肝細(xì)胞的細(xì)胞懸液添加于該準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中。此時(shí)的初期細(xì)胞密度優(yōu)選為1×104～5×105細(xì)胞/ml。
能夠在上述含有血清、煙酰胺、維生素C、抗生素、生長(zhǎng)因子、其他在細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的添加物的基本培養(yǎng)基中，例如，添加了上述物質(zhì)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)等中，在37℃下，在上述結(jié)合了透明質(zhì)酸的載體存在下進(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，該結(jié)合了透明質(zhì)酸的載體為涂布有透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿，或者涂布有透明質(zhì)酸的培養(yǎng)瓶。此外，在其他實(shí)施方式中，該結(jié)合了透明質(zhì)酸的載體為透明質(zhì)酸包被的塑料珠、玻璃珠、瓊脂糖珠、或者透明質(zhì)酸包被的磁珠。此外，在其他實(shí)施方式中，該結(jié)合了透明質(zhì)酸的載體為由透明質(zhì)酸制成的載體、或者以透明質(zhì)酸為主要成分的載體。特別優(yōu)選多孔物質(zhì)(海綿)作為由透明質(zhì)酸制成的載體、或者以透明質(zhì)酸為主要成分的載體。
培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)一步含有煙酰胺、維生素C、生長(zhǎng)因子、DMSO等。維生素C通常作為抗壞血酸-2-磷酸添加，其濃度優(yōu)選為0.1mM～1.0mM，更優(yōu)選為0.5mM～1.0mM。煙酰胺以較高的濃度使用，優(yōu)選以1～20mM使用，更優(yōu)選以5mM～10mM使用。作為生長(zhǎng)因子，可以使用表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGFα)等，特別優(yōu)選TGFα。添加TGFα?xí)r，優(yōu)選以1μg/l～100μg/l，更優(yōu)選以5μg/l～50μg/l的濃度使用。當(dāng)將從哺乳動(dòng)物肝臟制備的含有小型肝細(xì)胞的細(xì)胞組分，而非繼代培養(yǎng)細(xì)胞直接培養(yǎng)時(shí)(原代培養(yǎng))，從培養(yǎng)開(kāi)始第4天起，優(yōu)選以約0.1～約2％(v/v)，更優(yōu)選以約0.5～約1.5％(v/v)的濃度添加DMSO。而且，通過(guò)在最初的24小時(shí)使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，能夠減少例如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等非特異性貼壁。而且，為了防止血清中含有的玻璃體結(jié)合蛋白、纖連蛋白的混入，也優(yōu)選在初期進(jìn)行這種無(wú)血清培養(yǎng)。
優(yōu)選使用二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，基本上以大約每?jī)商煲淮?每周三次)的頻率更換培養(yǎng)基。
更具體來(lái)說(shuō)，能夠使用以下培養(yǎng)基Dulbecco’s Modified Eagle Medium(GIBCO Laboratories)+20mM HEPES (Dojindo)+25Mm NaHCO3(Katayama Chemical Co.)+30mg/l脯氨酸(Sigma Chemical Co.)+0.5mg/l胰島素 (Sigma Chemical Co.)+10-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)+10％FBS (Hyclone Laboratories，Inc.)+10mM煙酰胺 (Katayama Chemical Co.，)+1mM L-抗壞血酸-2-磷酸鹽 (Wako Pure Chemical Ind.)+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)+抗生素1％二甲基亞砜(DMSO) (ALDRICH)(DMSO在培養(yǎng)第四天更換培養(yǎng)基時(shí)添加)當(dāng)從沒(méi)有預(yù)先引起肝損傷的個(gè)體制備細(xì)胞時(shí)，為了保證與透明質(zhì)酸的充分結(jié)合，培養(yǎng)期間至少進(jìn)行2天以上，優(yōu)選進(jìn)行大約3天以上，進(jìn)一步優(yōu)選進(jìn)行3天～30天，特別優(yōu)選進(jìn)行大約3天～21天；當(dāng)從以半乳糖胺等預(yù)先引起肝損傷的個(gè)體制備細(xì)胞時(shí)，或者從已經(jīng)進(jìn)行繼代培養(yǎng)的細(xì)胞制備細(xì)胞時(shí)，能夠通過(guò)較短期間的培養(yǎng)并分離小型肝細(xì)胞。當(dāng)以半乳糖胺引起損傷時(shí)，例如，以10mg～100mg/200μl PBS/100g體重的濃度向成熟大鼠(8～10周齡)腹腔內(nèi)注射D-半乳糖胺(ACROSS)，在注射后第3天～第6天，基于Seglen方法可從肝臟中分離細(xì)胞。
在更換培養(yǎng)基時(shí)，由于未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，或者易于從載體上剝落，所以易于從培養(yǎng)物中除去，而且，易于從培養(yǎng)物中回收附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞。在本發(fā)明中，從培養(yǎng)物中除去未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和從培養(yǎng)物中回收附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞是相同的。
當(dāng)結(jié)合透明質(zhì)酸的載體為培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、或者海綿這樣的比較大型的載體時(shí)，通過(guò)以適當(dāng)?shù)木彌_液或者培養(yǎng)基，例如，PBS或者上述小型肝細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基對(duì)載體表面進(jìn)行沖洗，能夠容易地除去未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞。當(dāng)載體為珠子這種比較小型的載體時(shí)，通過(guò)離心，或者，若為磁珠時(shí)，通過(guò)磁性固定，然后棄去培養(yǎng)基，根據(jù)需要，通過(guò)以適當(dāng)?shù)木彌_液或者培養(yǎng)基洗凈，就能夠容易地回收附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞，或者能夠容易地除去未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞。然后，可以添加新鮮培養(yǎng)基，在透明質(zhì)酸存在下或者非存在下繼續(xù)培養(yǎng)，也可以提供下述的從載體上將小型肝細(xì)胞解離的處理。
在進(jìn)行上述培養(yǎng)之后，棄去培養(yǎng)基，根據(jù)需要將載體用培養(yǎng)基或者PBS等適當(dāng)?shù)木彌_液洗凈之后，通過(guò)透明質(zhì)酸酶的作用能夠?qū)⒏街谕该髻|(zhì)酸的小型肝細(xì)胞從載體上解離下來(lái)。可以商購(gòu)獲得透明質(zhì)酸酶，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中配制使用。所使用的適當(dāng)?shù)木彌_液只要是能夠溶解透明質(zhì)酸酶，并對(duì)透明質(zhì)酸酶的活性沒(méi)有顯著損害的緩沖液即可，例如，可以使用Hanks液、通常的細(xì)胞培養(yǎng)基、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)。此外，對(duì)透明質(zhì)酸酶的濃度也沒(méi)有特別限定，例如，能夠以0.1～20mg/ml的濃度，優(yōu)選以1～10mg/ml的濃度配制。使該配制好的透明質(zhì)酸酶作用于載體-透明質(zhì)酸-細(xì)胞復(fù)合體，將小型肝細(xì)胞從載體解離下來(lái)。對(duì)作用的透明質(zhì)酸的量沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)使用量調(diào)節(jié)孵育時(shí)間。但是，一般來(lái)說(shuō)，可以使用每1cm2的載體表面優(yōu)選為約5μg～1000μg，更優(yōu)選為約50μg～500μg的透明質(zhì)酸酶。
例如，棄去培養(yǎng)液后，以PBS洗凈，加入1mM EDTA/PBS，在室溫下孵育1分鐘。棄去1mM EDTA/PBS后，添加預(yù)熱到與培養(yǎng)溫度相同，例如37℃的上述濃度的透明質(zhì)酸酶溶液，在37℃的5％的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。例如，當(dāng)使用60mm培養(yǎng)皿時(shí)，優(yōu)選使用大約1ml的5mg/ml或者10mg/ml的透明質(zhì)酸酶溶液。當(dāng)使用涂布有透明質(zhì)酸的載體，例如，透明質(zhì)酸包被的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶時(shí)，孵育時(shí)間典型的為大約30分鐘～大約2小時(shí)。特別是當(dāng)處理以透明質(zhì)酸制成，或者以透明質(zhì)酸為主要成分的載體時(shí)，孵育到該載體全部、或者透明質(zhì)酸成分充分溶解為止。在任何情況下，都可以在觀察細(xì)胞游離狀態(tài)的同時(shí)將孵育溫度和時(shí)間調(diào)節(jié)到最適。然后，添加適量冰冷的培養(yǎng)液，輕輕吹打后，回收入試管內(nèi)，通過(guò)50×g離心5分鐘而能夠回收小型肝細(xì)胞。
根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間等條件，有時(shí)小型肝細(xì)胞以透明質(zhì)酸酶的處理也可能不完全游離出來(lái)。此時(shí)，可以使用市售的細(xì)胞解離溶液，例如可以從Sigma公司獲得的Ceu dissociation solution。例如，棄去培養(yǎng)液后，以PBS等適當(dāng)?shù)木彌_液洗凈，加入適量的1mM EDTA/PBS，在室溫下孵育1～3分鐘左右。接下來(lái)，棄去1mM EDTA/PBS后，添加適量的預(yù)熱到與培養(yǎng)溫度相同，例如37℃的Cell dissociation solution，在5％的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育例如5～15分鐘左右，通過(guò)上述方法能夠容易地將小型肝細(xì)胞從載體中解離出來(lái)?？梢栽谟^察細(xì)胞游離狀態(tài)的同時(shí)將孵育溫度和時(shí)間調(diào)節(jié)到最適。
可以單獨(dú)使用上述細(xì)胞解離溶液處理，也可以合用透明質(zhì)酸酶處理。
孵育后，可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ɑ厥諒妮d體解離下來(lái)的小型肝細(xì)胞。例如，孵育后，向培養(yǎng)容器內(nèi)添加適量的PBS等對(duì)細(xì)胞無(wú)害的適當(dāng)緩沖液或者培養(yǎng)基，制備游離的小型肝細(xì)胞的細(xì)胞懸液，根據(jù)需要反復(fù)離心和重懸，能夠?qū)妮d體-透明質(zhì)酸中游離出來(lái)的小型肝細(xì)胞洗凈并回收。為了不對(duì)小型肝細(xì)胞造成過(guò)度的損傷，以較低速進(jìn)行短時(shí)間離心，例如，優(yōu)選以50×g離心5分鐘左右。此外，當(dāng)載體為珠子等小型載體時(shí)，能夠通過(guò)更加低速和/或更短時(shí)間的離心，或者數(shù)秒鐘～數(shù)分鐘左右，優(yōu)選在1分鐘以下的單純靜止來(lái)分離小型肝細(xì)胞懸液和載體-透明質(zhì)酸。也可以將這樣所獲得的小型肝細(xì)胞進(jìn)一步在表面結(jié)合透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，重復(fù)上述操作。
使用各種標(biāo)記物能夠證實(shí)，這樣分離和/培養(yǎng)的小型肝細(xì)胞具有肝細(xì)胞的部分功能。作為這樣的標(biāo)記物，除了分泌于培養(yǎng)基中的白蛋白之外，能夠利用轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿素的產(chǎn)生、糖原量、氨基酸代謝酶、細(xì)胞色素P450等。通過(guò)培養(yǎng)基或者細(xì)胞抽提液的ELISA、Western印跡分析、RT-PCR等，或者直接將細(xì)胞免疫染色來(lái)證實(shí)。小型肝細(xì)胞具有作為成熟肝細(xì)胞標(biāo)記物的白蛋白、CK8、CK18、糖原、過(guò)氧化物酶體等標(biāo)記物，另一方面，沒(méi)有作為膽管上皮細(xì)胞標(biāo)記物的CK7、CK19等，從這一點(diǎn)上能夠與其他的細(xì)胞相區(qū)別。例如，已知卵形細(xì)胞(ovalcell)作為肝干細(xì)胞的一種，具有CK7、CK19等膽管上皮細(xì)胞標(biāo)記物，沒(méi)有糖原、過(guò)氧化物酶體等成熟肝細(xì)胞標(biāo)記物，從這一點(diǎn)上能夠與小型肝細(xì)胞相區(qū)別。此外能夠證實(shí)，其他的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物[[ED1/2(枯否細(xì)胞的標(biāo)記物)、SE-1(肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物)、結(jié)蛋白(desmin)(肝臟星狀細(xì)胞的標(biāo)記物)、波形蛋白(vimentin)(肝上皮樣細(xì)胞標(biāo)記物)]也是陰性的。
與培養(yǎng)從肝臟中獲得的含有較多小型肝細(xì)胞的組分時(shí)相同，像這樣高效分離并維持培養(yǎng)的小型肝細(xì)胞可以使用上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)，可以使用上述結(jié)合了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)容器，也可以使用在通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)容器。雖然可以使用通常用于的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的膠原包被的培養(yǎng)容器，但是，如果在制備冷凍保存用集落或者制備適合肝組織形成的小型肝細(xì)胞集落時(shí)而希望將小型肝細(xì)胞從培養(yǎng)容器中剝離下來(lái)時(shí)，則優(yōu)選未包被膠原的培養(yǎng)皿。這是因?yàn)?，?xì)胞外基質(zhì)越少，就容易以越溫和的條件剝離細(xì)胞，并且，當(dāng)未以膠原等包被時(shí)，小型肝細(xì)胞傾向于優(yōu)先從容器中剝離。在培養(yǎng)時(shí)，可以使用通常的5％二氧化碳培養(yǎng)箱。二氧化碳的濃度和培養(yǎng)溫度處于通常的培養(yǎng)細(xì)胞所容許的范圍內(nèi)即可。
上述高效分離并維持培養(yǎng)的小型肝細(xì)胞也能夠根據(jù)WO 01/92481所述方法冷凍保存，也可以根據(jù)WO 02/088332所述方法使其向肝組織成熟化，進(jìn)而使用成熟化的肝組織用于推定藥物的功能。
此外，本發(fā)明書(shū)中所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用而全部納入本說(shuō)明書(shū)中。
實(shí)施例實(shí)施例1富含小型肝細(xì)胞的細(xì)胞組分的制備根據(jù)Seglen的方法，將添加了0.2mM EGTA的不含鈣、鎂的Hanks液從門(mén)靜脈向成熟大鼠(10～15周齡)的肝臟灌流。以40ml/分的流速灌流大約4分鐘后，將含有0.02％膠原酶(Yakult)的Hanks液以20ml/分的流速灌流10分鐘。根據(jù)規(guī)定的方法從消化后的肝臟中將肝細(xì)胞振落于燒杯中。以250μm篩孔和70μm篩孔的濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液，以50×g離心1分鐘。收集上清，再以50×g離心1分鐘，重復(fù)2次。收集該上清，以50×g離心5分鐘。將沉淀的細(xì)胞以培養(yǎng)液(Leivobitz L-15+10％胎牛血清+10-7M地塞米松+0.5mg/l胰島素+抗生素)洗凈，再以50×g離心5分鐘。重復(fù)相同的操作后，以150×g離心5分鐘。重復(fù)相同的操作后，再以50×g離心5分鐘。將沉淀的細(xì)胞以新培養(yǎng)液懸浮后，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，制成1×104～5×105cell/ml。
實(shí)施例2CD44在小型肝細(xì)胞中的表達(dá)譜研究了在實(shí)施例1中制備的小型肝細(xì)胞的CD44的表達(dá)譜。
1)CD44的表達(dá)譜的經(jīng)時(shí)變化從新鮮制備的小型肝細(xì)胞、培養(yǎng)開(kāi)始后的小型肝細(xì)胞、和成熟肝細(xì)胞中制備總RNA，以RT-PCR法研究CD44的表達(dá)。使用GPDH(甘油-3-磷酸脫氫酶)作為陽(yáng)性對(duì)照(管家基因)。使用以下培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (GIBCO Laboratories)+20mM HEPES (Dojindo)+25Mm NaHCO3(Katayama Chemical Co.)+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)+0.5mg/l胰島素 (Sigma Chemical Co.)+10-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)+10％FBS(Hyclone Laboratories，Inc.)+10mM煙酰胺 (Katayama Chemical Co.，)+1mM L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(Wako Pure Chemical Ind.)+10μg/lEGF (Collaborative Research Inc.)+抗生素
1％二甲基亞砜(DMSO) (ALDRICH)(DMSO在培養(yǎng)第四天更換培養(yǎng)基時(shí)添加)從大約1.0～1.5×105個(gè)小型肝細(xì)胞中抽提總RNA。使用ISOGEN(NIPPON GENE)，根據(jù)技術(shù)人員推薦的實(shí)驗(yàn)方案將細(xì)胞溶解，然后添加氯仿，充分混和后，在4℃以10000×g離心15分鐘。取出上層，添加異丙醇，在4℃以10000×g離心15分鐘后，將所獲得的沉淀以70％乙醇洗凈，溶解于DEPC水中。灌注之后立即以同樣的方法從成熟肝細(xì)胞中抽提出RNA。
使用10ng的獲得的總RNA進(jìn)行RT-PCR。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以密度計(jì)讀取所獲得的各條帶，將CD44的條帶強(qiáng)度除以GPDH的條帶強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)強(qiáng)度。使用的引物如下5’-cccgaattcatggacaaggtttggtggca-3’ (序列編號(hào)1)5’-cccgaattcctacaccccaatcttcatat-3’ (序列編號(hào)2)此外，使用下述引物用于GPDH5’-accacagtccatgccatcac-3’ (序列編號(hào)3)5’-tccaccaccctgttgctgta-3’ (序列編號(hào)4)PCR的條件如下95℃15秒，60℃30秒，68℃1分鐘，循環(huán)數(shù)＝25。
結(jié)果明確，在原代培養(yǎng)開(kāi)始后，大約2～3天后可見(jiàn)顯著的CD44表達(dá)，此后表達(dá)量逐漸增大，在培養(yǎng)開(kāi)始第3～5天后幾乎達(dá)到最大值，在增殖中的小型肝細(xì)胞中幾乎維持CD44的表達(dá)水平(圖1)。此外也顯示，當(dāng)以該條件培養(yǎng)時(shí)，在40天后小型肝細(xì)胞達(dá)到一定程度的成熟度，CD44的表達(dá)降低(圖1)。
2)小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞中CD44的表達(dá)譜的比較依照WO 01/92481所述方法，將冷凍保存的細(xì)胞(約1.0～1.5×105個(gè)細(xì)胞)以常規(guī)方法復(fù)蘇，通過(guò)和1)相同的步驟從培養(yǎng)2周后的細(xì)胞中提取總RNA。從成熟肝細(xì)胞抽提RNA是以相同的方法從剛灌流后的細(xì)胞中抽提的。使用所獲得的10ng總RNA，與1)相同進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)CD44的相對(duì)表達(dá)量。但是PCR的循環(huán)數(shù)設(shè)為35。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以密度計(jì)讀取所獲得的各條帶，將CD44的條帶的強(qiáng)度除以GPDH的條帶的強(qiáng)度，比較小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞中CD44的表達(dá)(圖2)。
結(jié)果明確，在成熟肝細(xì)胞中，CD44的表達(dá)始終非常低(圖1、圖2)。
通過(guò)Northern印跡也獲得同樣的結(jié)果(圖3)。此時(shí)也使用了作為管家基因的GPDH。如上所述，以密度計(jì)讀取所獲得的各條帶，將CD44的條帶的強(qiáng)度除以GPDH的條帶的強(qiáng)度，比較小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞中CD44的表達(dá)。所使用的探針為編碼CD44區(qū)域的全長(zhǎng)(序列編號(hào)5)。使用Alkphos Direct標(biāo)記試劑盒(Amersham Biosciences)標(biāo)記探針。
依照WO 02/088332所述方法，將Matrigel添加于培養(yǎng)中的小型肝細(xì)胞中，誘導(dǎo)小型肝細(xì)胞成熟化，通過(guò)Northern印跡檢測(cè)CD44的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在添加Matrigel后第二天開(kāi)始成熟化(WO02/088332)，CD44的表達(dá)伴隨著成熟化而降低(圖4)。
這些結(jié)果顯示，CD44是小型肝細(xì)胞特異性表達(dá)的，同時(shí)，通過(guò)制備來(lái)自肝臟的細(xì)胞組分這樣的損傷，誘導(dǎo)了CD44的表達(dá)，由此提示，在構(gòu)成肝臟的細(xì)胞群中潛在存在的小型肝細(xì)胞及其前體細(xì)胞能夠表現(xiàn)出作為小型肝細(xì)胞的本來(lái)性質(zhì)。
實(shí)施例3在透明質(zhì)酸存在下的培養(yǎng)以PBS配制濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸儲(chǔ)存溶液，保持在37℃。使用的透明質(zhì)酸是從Sigma購(gòu)買(mǎi)的(Sigma Hyaluronic acid(人臍帶；Human imbilical cords)，貨號(hào)H-1504)。向所獲得的透明質(zhì)酸儲(chǔ)液添加適量的PBS，配制成透明質(zhì)酸稀釋溶液，使得在總體積3ml中含有1～10mg透明質(zhì)酸。將獲得的各種濃度的透明質(zhì)酸溶液加入60mm的未處理培養(yǎng)皿(Kord-Valmark)中。將該培養(yǎng)皿在37℃下孵育過(guò)夜，以PBS洗凈后使用。
將在1)中制備的富含小型肝細(xì)胞的細(xì)胞組分接種于該培養(yǎng)皿中。在最初的24小時(shí)使用下述培養(yǎng)基，然后更換為向該培養(yǎng)基中添加了10％FBS(Hyclone Laboratories，Inc.)的培養(yǎng)基。使用二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，基本上以每?jī)商煲淮?每周3次)的頻率更換培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基的組成如下
Dulbecco’s Modified Eagle Medium(GIBCO Laboratories)+20mM HEPES (Dojindo)+25Mm NaHCO3(Katayama Chemical Co.)+30mg/l脯氨酸(Sigma Chemical Co.)+0.5mg/l胰島素 (Sigma Chemical Co.)+10-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)+10mM煙酰胺 (Katayama Chemical Co.，)+1mM L-抗壞血酸-2-磷酸鹽 (Wako Pure Chemical Ind.)+10μg/l EGF (Collaborative Research Inc.)+抗生素1％二甲基亞砜(DMSO) (ALDRICH)(DMSO在培養(yǎng)第四天更換培養(yǎng)基時(shí)添加)使用1mg、5mg、10mg透明質(zhì)酸包被60mm培養(yǎng)皿，在第7天、第14天、和第21天在顯微鏡下觀察在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中的小型肝細(xì)胞的增殖。結(jié)果示于圖5.
由圖5可明確，在非貼壁細(xì)胞用的培養(yǎng)皿(陰性對(duì)照)上培養(yǎng)的小型肝細(xì)胞幾乎沒(méi)有形成集落，與在貼壁細(xì)胞用的培養(yǎng)皿(陽(yáng)性對(duì)照)中的培養(yǎng)相比，在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中的小型肝細(xì)胞的面積大。而且，若培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，則會(huì)發(fā)生小型肝細(xì)胞的分化，即成熟化，從而取代小型肝細(xì)胞的增殖，小型肝細(xì)胞集落面積的增加率就會(huì)降低，但是至少到第21天為止，其面積仍然大于未涂布透明質(zhì)酸時(shí)的面積。此外，通過(guò)顯微鏡的觀察，未發(fā)現(xiàn)增殖中的小型肝細(xì)胞的形態(tài)變化。
實(shí)施例4小型肝細(xì)胞的分離a)透明質(zhì)酸酶處理在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)6天和3周后，以透明質(zhì)酸酶(Sigma Chemical Co.)進(jìn)行處理。將培養(yǎng)液從培養(yǎng)皿中棄去后，以PBS洗凈，加入1mM EDTA/PBS1ml，在室溫下孵育1分鐘。棄去1mMEDTA/PBS后，添加1ml預(yù)熱到37℃的透明質(zhì)酸酶(5mg/ml或10mg/ml)，在37℃的5％的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)。然后，添加1ml冰冷的培養(yǎng)液，輕輕吹打后，回收入試管內(nèi)，以50×g離心5分鐘，回收小型肝細(xì)胞。
培養(yǎng)6天的小型肝細(xì)胞集落能夠剝離，所以能夠回收細(xì)胞，但是單獨(dú)以透明質(zhì)酸酶無(wú)法充分剝離培養(yǎng)3周的細(xì)胞。因此，使用b)所示的分散液。
b)以細(xì)胞解離溶液(Cell dissociation solution)的處理在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3周后，使用細(xì)胞解離溶液(Cell dissociation solution)(Sigma Chemical Co.)，根據(jù)技術(shù)人員推薦的實(shí)驗(yàn)方案對(duì)培養(yǎng)皿中貼壁的細(xì)胞進(jìn)行處理。
棄去培養(yǎng)液后，以PBS洗凈，加入1ml的1mM EDTA/PBS，在室溫下孵育1分鐘左右。棄去1mM EDTA/PBS后，添加1ml的預(yù)熱到37℃的Cell dissociation solution，在37℃的5％的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～15分鐘。然后，添加1ml冰冷的培養(yǎng)液，回收入試管內(nèi)，以50×g離心5分鐘，回收小型肝細(xì)胞。
所獲得的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與小型肝細(xì)胞相同，CD44為陽(yáng)性。該細(xì)胞能夠增殖形成集落。形成集落的細(xì)胞分泌白蛋白，通過(guò)免疫染色分析的結(jié)果證實(shí)，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物[ED1/2(枯否細(xì)胞的標(biāo)記物)、SE-1(肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物)、結(jié)蛋白(desmin)(肝星狀細(xì)胞的標(biāo)記物)、波形蛋白(vimentin)(肝上皮樣細(xì)胞標(biāo)記物)]都是陰性的。因此證實(shí)所獲得的細(xì)胞為小型肝細(xì)胞。
實(shí)施例5成熟肝細(xì)胞的制備以含有膠原酶的溶液灌流成熟大鼠的肝臟，將所獲得的細(xì)胞懸液在4℃下以50×g離心1分鐘，回收沉淀。將沉淀懸浮于Hanks緩沖液中，在4℃下以50×g離心1分鐘，重復(fù)該操作3次。
將所獲得的沉淀懸浮于25ml的Hanks緩沖液中，加入21.6ml的Percoll(Amersham)、2.4ml的10×Hanks緩沖液，顛倒混合。在4℃下以50×g離心15分鐘，棄去上清。以PBS將細(xì)胞懸浮，在4℃下以50×g離心1分鐘，回收沉淀，獲得成熟肝細(xì)胞。
實(shí)施例6小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞在透明質(zhì)酸存在下培養(yǎng)的比較將以實(shí)施例1和實(shí)施例4的方法制備的小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞接種于以實(shí)施例3的方法涂布后的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)方法與實(shí)施例3相同。
在最初的24小時(shí)使用下述培養(yǎng)基，然后更換為添加了10％FBS(Hyclone Laboratories，Inc.)的培養(yǎng)基。使用二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，以每周3次的頻率更換培養(yǎng)基。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (GIBCO Laboratories)+20mM HEPES (Dojindo)+25Mm NaHCO3(Katayama Chemical Co.)+30mg/l脯氨酸 (Sigma Chemical Co.)+0.5mg/l胰島素 (Sigma Chemical Co.)+10-7M地塞米松 (Sigma Chemical Co.)+10mM煙酰胺 (Katayama Chemical Co.，)+1mM L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(Wako Pure Chemical Ind.)+10μg/l EGF(Collaborative Research Inc.)+抗生素1％二甲基亞砜(DMSO) (ALDRICH)(DMSO在培養(yǎng)第四天更換培養(yǎng)基時(shí)添加)在培養(yǎng)后第1天和第7天計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的細(xì)胞。以第1天的細(xì)胞數(shù)量作為1，表示在第7天的比率(圖6)。成熟肝細(xì)胞在培養(yǎng)第7天幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，相反地，小型肝細(xì)胞在第7天達(dá)到了第1天的大約7倍的細(xì)胞數(shù)。
采用本發(fā)明，能夠從包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的肝臟中高效分離小型肝細(xì)胞。而且，采用本發(fā)明能夠選擇性地培養(yǎng)小型肝細(xì)胞。進(jìn)而，采用本發(fā)明，能夠?qū)⑿⌒透渭?xì)胞與在培養(yǎng)中成熟化而失去小型肝細(xì)胞的永久增殖能力的細(xì)胞高效分離并培養(yǎng)。
例如，當(dāng)在透明質(zhì)酸包被的培養(yǎng)皿中分別培養(yǎng)小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞時(shí)，成熟肝細(xì)胞在培養(yǎng)第7天幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，相反地，小型肝細(xì)胞在第7天達(dá)到了第l天的大約7倍或者7倍以上的細(xì)胞數(shù)，因此，采用本發(fā)明能夠區(qū)別成熟肝細(xì)胞而選擇性地培養(yǎng)和分離小型肝細(xì)胞。


圖1為通過(guò)RT-PCR檢測(cè)的在制備和培養(yǎng)開(kāi)始后的各時(shí)間點(diǎn)的CD44的mRNA水平的表達(dá)結(jié)果?？v軸表示相對(duì)強(qiáng)度，橫軸表示培養(yǎng)天數(shù)。
圖2為通過(guò)RT-PCR比較在小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞中CD44的mRNA水平表達(dá)的結(jié)果。SH小型肝細(xì)胞；MH成熟肝細(xì)胞。縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
圖3為以Northern印跡(Northern印記雜交)比較在小型肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞中CD44的mRNA水平的表達(dá)結(jié)果。SH小型肝細(xì)胞；MH成熟肝細(xì)胞。縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。Upper表示在被檢出的mRNA中的大小大的RNA，Lower表示大小小的RNA。
圖4為通過(guò)Northern lot檢測(cè)的在以Matrigel誘導(dǎo)成熟化后的小型肝細(xì)胞中CD44表達(dá)的結(jié)果。SH小型肝細(xì)胞；MH成熟肝細(xì)胞?？v軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
圖5表示在包被了不同量的透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中，小型肝細(xì)胞集落增殖的經(jīng)過(guò)時(shí)間?？v軸為mm2單位面積×10-3。陽(yáng)性對(duì)照貼壁細(xì)胞用培養(yǎng)皿；陰性對(duì)照非貼壁細(xì)胞用培養(yǎng)皿；膠原膠原涂布培養(yǎng)皿；1mg HA、5mg HA、10mg HA分別以1mg、5mg、10mg的透明質(zhì)酸處理過(guò)的容器。
圖6為在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中的成熟肝細(xì)胞和小型肝細(xì)胞的相差顯微鏡照片。A成熟肝細(xì)胞培養(yǎng)第1天；B成熟肝細(xì)胞培養(yǎng)第7天；C小型肝細(xì)胞培養(yǎng)第1天；D小型肝細(xì)胞培養(yǎng)第7天。以3×105的細(xì)胞濃度將成熟肝細(xì)胞(MH)和小型肝細(xì)胞(SH)接種于涂布了透明質(zhì)酸的過(guò)的60mm培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)。分別表示第1天和第7天的生長(zhǎng)狀態(tài)。小型肝細(xì)胞增殖而形成集落，與此相對(duì)，成熟肝細(xì)胞變?yōu)榍驙疃鴦冸x，在第7天幾乎沒(méi)有存活的細(xì)胞。圖中的線(xiàn)表示200微米。
圖7為表示在涂布了透明質(zhì)酸的培養(yǎng)皿中的成熟肝細(xì)胞和小型肝細(xì)胞的增殖的圖表。計(jì)測(cè)存活細(xì)胞數(shù)，以第1天的細(xì)胞數(shù)作為1，相對(duì)表示第7天的細(xì)胞數(shù)。
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gaccttccca cttcacagcc tactggagac cgggatgacg ccttctttat tgggagcacc660ctggccacca gtgatggaga ctcatccatg gaccccaggg gtggtttcga cactgtgact720catggatccg aattagctgg acactcaagt gggaatcaag acagtggagt gaccacaact780tctggtcctg cgaggagacc tcagattcca gagtggctta tcatcttggc atccctcctg840gcgctggctc tgattcttgc cgtctgcatt gctgtcaaca gtaggagaag gtgtgggcag900aagaagaagc tggtgatcaa cagtggcaat ggaacagtgg aagacaggaa accaagtgaa960ctcaacgggg aggccagcaa gtctcaggaa atggtgcatt tggtgaacaa ggaaccaaca 1020gagactccgg accagtttat gacagctgat gagacccgga atctgcagag tgtggatatg 1080aagattgggg tgtag109權(quán)利要求
1.一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)方法包括在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞，以及將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離。
3.一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟i)在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞的步驟；ii)在i)中獲得的培養(yǎng)物中，將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離的步驟；iii)將在步驟ii)中獲得的附著于透明質(zhì)酸的小型肝細(xì)胞與所述透明質(zhì)酸解離的步驟；和iv)針對(duì)在步驟iii)中獲得的小型肝細(xì)胞，重復(fù)步驟i)～iii)1個(gè)以上的循環(huán)的步驟。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述載體選自多孔物質(zhì)、玻璃、瓊脂糖、塑料、金屬、纖維素。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于通過(guò)將相對(duì)于載體表面為10～1000μg/cm2的透明質(zhì)酸與載體一同孵育，將透明質(zhì)酸結(jié)合于載體表面。
6.一種小型肝細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟i)在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物肝臟由來(lái)的細(xì)胞的步驟；ii)從i)中所獲得的培養(yǎng)物中回收附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞的步驟；
7.如權(quán)利要求6所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟i)在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物肝臟由來(lái)的細(xì)胞的步驟；ii)在i)中所獲得的培養(yǎng)物中，將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞和未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞分離的步驟；iii)將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞與所述透明質(zhì)酸解離的步驟；iv)重復(fù)步驟i)～iii)1個(gè)以上的循環(huán)的步驟；和v)回收與所述透明質(zhì)酸解離的細(xì)胞的步驟。
8.如權(quán)利要求6或7中任一項(xiàng)所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述載體選自多孔物質(zhì)、玻璃、瓊脂糖、塑料、金屬、纖維素。
9.如權(quán)利要求6～8中任一項(xiàng)所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于通過(guò)將相對(duì)于載體表面為10～1000μg/cm2的透明質(zhì)酸與載體一同孵育，將透明質(zhì)酸結(jié)合于載體表面。
10.如權(quán)利要求6～9中任一項(xiàng)所述的小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于通過(guò)透明質(zhì)酸酶的作用將小型肝細(xì)胞與透明質(zhì)酸解離。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供一種小型肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括，在表面結(jié)合有透明質(zhì)酸的載體和/或以透明質(zhì)酸為主要成分的載體存在下培養(yǎng)小型肝細(xì)胞，和將附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞與未附著于透明質(zhì)酸的細(xì)胞進(jìn)行分離。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101018856SQ20058002925
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月29日
發(fā)明者三高俊廣, 金純子 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)