專利名稱：哺乳動物肝細胞體外組織化培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用一種新型的特異性培養(yǎng)基質(zhì)進行肝細胞體外組織化培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
肝臟是人體的重要器官，肝臟的病變，如肝硬化、肝衰竭等會危及患者的生命。臨 床上對肝臟病變晚期的患者實施肝臟移植手術(shù)來延緩患者的生命。由于肝臟供體來源的問 題，很多肝病晚期患者因為等不到供體，而終止生命。即便得到供體，接受肝移植的患者，也 要在隨后的生活中承擔(dān)著終身藥物免疫抑制的經(jīng)濟負擔(dān)。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，新的治 療手段為患者提供了改善和復(fù)活肝功能的可行性。 組織工程學(xué)是融合了工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和基本 方法，在體外構(gòu)建一個有生物活性的種植體，植入體內(nèi)修復(fù)組織缺損，替代器官功能；或作 為一種體外裝置，暫時替代器官功能，達到提高生存質(zhì)量，延長生命活動的目的。組織工程 學(xué)是一個跨學(xué)科的領(lǐng)域，其將工程和材料科學(xué)與醫(yī)學(xué)結(jié)合在一起。目標(biāo)在于恢復(fù)受損組織 或改善其功能。其原理是從人或動物體中取出部分組織，體外提取細胞，并進行體外培養(yǎng) 與增殖。然后將其再次移植到體內(nèi)。與傳統(tǒng)的供(受)體移植不同，傳統(tǒng)的移植需要供體， 而且移植后需要終身藥物免疫抑制。而本方法則提供了能夠使用內(nèi)源(自體)細胞的極其
重要ifc點。 組織工程學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，其關(guān)鍵就是細胞體外的培養(yǎng)與增殖，這對移植到體內(nèi)的
細胞是否發(fā)揮功能，是極其重要的。目前細胞體外培養(yǎng)方法越來越多，也越來越先進，但存 在的問題是，原生肝細胞在體外培養(yǎng)過程中， 一定時間內(nèi)較難培養(yǎng)出相當(dāng)數(shù)量的細胞，從而 移植回體內(nèi)達不到肝細胞的功能。 CN1587392A在聚砜中空纖維絲內(nèi)進行肝細胞的培養(yǎng)，由于促進肝細胞球狀體 的形成需較長時間，而球狀體形成的推遲會使肝細胞較快失去分化表型和發(fā)生死亡；而 CN101624473A在由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖制備得到的載體中進行肝細胞的培養(yǎng)，此 方法如需進行肝細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，還需優(yōu)化微載體制備反應(yīng)條件。并且上述方法獲得的 肝細胞可作用于體外生物反應(yīng)器，不便于移植到體內(nèi)形成組織化。為獲得一定數(shù)量的肝細 胞，使其移植回體達到肝細胞的功能并能組織化，原生肝細胞的體外培養(yǎng)方法的條件控制 非常重要，尤其細胞培養(yǎng)基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和形狀大小非常關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能使肝細胞在體外快速、高效的培養(yǎng)基質(zhì)，基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)具有 更大的體表面積比，有利于肝細胞在基質(zhì)上的粘附，利于肝細胞間的信息傳遞以及營養(yǎng)、氧 氣和代謝物之間的流通，從而提高體外肝細胞培養(yǎng)質(zhì)量和數(shù)量，使移植回體內(nèi)的肝細胞達 到相應(yīng)的功能；并且培養(yǎng)基質(zhì)的形狀、大小有利于移植回體內(nèi)。 —種哺乳動物肝細胞的體外培養(yǎng)方法，其關(guān)鍵是使用經(jīng)靜電紡織成的具有三維多 孔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基質(zhì)。
其中，培養(yǎng)基質(zhì)由膠原蛋白或絲素蛋白，與聚乳酸(PLA)按質(zhì)量百分比配置成混 合物，利用靜電紡織技術(shù)制備。 其中，聚乳酸的分子量為10000-150000道爾頓。 其中，膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%，聚乳酸為60-80%的混合物溶于二 氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6_8%的電紡液； 其中，將電紡液加入靜電紡織裝置中，靜電紡織制成直徑l-2cm，高度3-4mm的扁 圓柱形基質(zhì)； 其中，將靜電紡織獲得的基質(zhì)用真空干燥方法去除殘留的二氯甲烷； 其中，基質(zhì)體積93-96%為微孔，4-7%為基材； 其中，基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80iim-500iim之間； 其中，優(yōu)選基質(zhì)具有如下的孔徑分布，基質(zhì)上大約4%的孔平均直徑在
80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 ii m ;大約7%的孔平均直徑在121-130 y m ;
大約5%的孔平均直徑在131-260 iim ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ;大約15%
的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6 %的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10 %的孔平
均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5 %的孔平均直
徑在431-460 ii m ;大約15%的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10%的孔平均直徑在
481-500 ii m。合適的孔徑大小與分布能提高細胞的培養(yǎng)效率和質(zhì)量。 其中，基質(zhì)上孔間相互連通； 其中，基質(zhì)的消毒用Y射線照射； 其中，所述哺乳動物是人或大鼠。 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的方法中使用的微孔結(jié)構(gòu)的基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)利于細胞吸附，有利于細胞間的 相互接觸以及氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，使肝細胞在體外高密度培養(yǎng)，并保持細胞生物學(xué)活性 及其功能，另外，基質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，植入體內(nèi)后，有利于血管的在基質(zhì)中攀爬生長、組織化。
具體實施例方式
l，細胞培養(yǎng)基質(zhì)制備 膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%與60_80%的聚乳酸(分子量10000-150000 道爾頓)混合物溶于二氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6-8 %的電紡液，經(jīng)靜電紡織技術(shù)織成直 徑為l-2cm，高度為3-4mm的扁圓柱形。真空干燥去除殘留二氯甲烷?；|(zhì)體積93-96% 為微孔，4-7%為基材?？字睆綖?0um-500um之間，微孔間相互連通。其中，大約4%的孔 平均直徑在80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 y m ;大約7%的孔平均直徑在 121-130 ii m ;大約5%的孔平均直徑在131-260 ii m ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ; 大約15%的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6%的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10% 的孔平均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5%的孔平均 直徑在431-460 ii m ;大約15 %的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10 %的孔平均直徑在 481-500 iim。 2，肝細胞的體外培養(yǎng) 1)取受體(人或大鼠)小部分肝組織，同時抽取50ml血清；
2)肝組織用針頭針剌若干小孔，(TC保存在EGTA溶液最多80分鐘，直到肝組織由 暗紅變成灰白色； 3)用10,1/L HEPE緩沖液(2. 38克HEPES，用蒸餾水溶解并定容至lOOOml， pH7. 2) ， 37"灌注肝組織5-8分鐘； 4)用膠原酶/胰蛋白酶溶液(8. 3gNaCl ;0. 5g KC1 ;2. 38克HEPES ;0. 7g CaCl2 2H20 ;500mg膠原酶；7. 5mg胰蛋白酶抑制劑；蒸餾水補至lOOOml， Ph7. 2)37。C灌注 肝組織5-8分鐘； 5)剪刀剪切肝組織，用常規(guī)方法提取肝細胞； 6)提取的肝細胞懸浮于20ml Williams E和步驟1)獲得的血清混合溶液中(體 積百分比為95 : 5)，成為A溶液； 7)取1ml上述含有肝細胞的A溶液，加入經(jīng)靜電紡織制成的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的 培養(yǎng)基質(zhì)中； 8)步驟7)的基質(zhì)在溫度37t:，濕度90-96%，5-8%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時， 以便細胞充分附著在基質(zhì)上；再加入3ml含有肝細胞的A溶液，同樣條件下培養(yǎng)至少48小 時； 9)電子顯微鏡下觀察細胞生長情況，鏡下可見80%以上為成活的肝細胞，肝細胞 數(shù)量大約為2X1()5個； 10)另用錐蟲藍(Trylan Bule)溶液測定細胞活性，活性大于95% ; 11)將培養(yǎng)后的含有肝細胞的基質(zhì)存放于20ml Williams E和血清混合溶液(體
積百分比為95 : 5)中，37t:保存?zhèn)溆谩?3，動物實驗 利用上述方法對Lewis鼠進行肝細胞腹腔內(nèi)移植。移植1和4個月后取出移植物 進行檢測移植基質(zhì)中肝細胞數(shù)量，平均每立方毫米體積內(nèi)，移植后1和4個月分別為3 X 103 和5X103個肝細胞，表現(xiàn)出正常的白蛋白表達，并且形成血管，血管延伸到基質(zhì)當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種哺乳動物肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于細胞培養(yǎng)過程中使用經(jīng)靜電紡織技術(shù)制成的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基質(zhì)由膠原蛋白或絲素蛋白，與聚乳酸(PLA)按質(zhì)量百分比配置成混合物，利用靜電紡織技術(shù)制備。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于膠原蛋白20-40%或絲素蛋白20-40%，聚乳酸為60-80%的混合物溶于二氯甲烷，制成質(zhì)量濃度為6-8%的電紡液。
4. 如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于靜電紡織制成直徑l-2cm，高度3-4mm的扁圓柱形基質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求l-4之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80踐-500iim之間。
6. 如權(quán)利要求1_5之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上大約4%的孔平均直徑在80-110 ii m ;大約6%的孔平均直徑在111-120 ii m ;大約7%的孔平均直徑在121-130 y m ;大約5%的孔平均直徑在131-260 iim ;大約5%的孔平均直徑在261-300 y m ;大約15%的孔平均直徑在301-340 ii m ;大約6 %的孔平均直徑在341-360 y m ;大約10 %的孔平均直徑在361-390 ii m ;大約10%的孔平均直徑在391-430 y m ;大約5 %的孔平均直徑在431-460 ii m ;大約15%的孔平均直徑在461-480 y m ;大約10%的孔平均直徑在481-500 iim。
7. 如權(quán)利要求l-6之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)體積93-96%為微孔，4-7%為基材。
8. 如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于基質(zhì)上孔間相互連通。
9. 如權(quán)利要求1-8之一所述的方法，其特征在于將靜電紡織獲得的基質(zhì)用真空干燥去除殘留的二氯甲烷。
10. 如權(quán)利要求1-9之一所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人或大鼠。
全文摘要
一種哺乳動物肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法，使用靜電紡織的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的肝細胞培養(yǎng)基質(zhì)。基質(zhì)直徑為1-2mm，厚度3-4mm，基質(zhì)上具有不同大小的孔，孔直徑為80μm-500μm之間，孔孔間相互連通。本發(fā)明的方法使人或動物肝細胞在體外培養(yǎng)迅速增殖，保持肝細胞細胞生物學(xué)活性及其功能。
文檔編號A61L27/26GK101775365SQ201010134109
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者苑國忠 申請人:苑國忠