專利名稱：對被檢抗原內(nèi)的活菌特異性標(biāo)記化來進(jìn)行檢測的檢測方法及檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測溶液中的抗原濃度和數(shù)量的檢測方法及檢測裝置，特別是涉及可以通過對被測抗原內(nèi)的活菌進(jìn)行特異性標(biāo)記化而實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化的檢測方法及檢測裝置。
背景技術(shù)：
近年來，沙門氏菌、葡萄球菌、肉毒桿菌、病原性大腸桿菌0-157等微生物引起的食物中毒的危害成為問題，相關(guān)企業(yè)一方面進(jìn)行關(guān)于對這些微生物的預(yù)防和衛(wèi)生的講習(xí)會和普及教育活動等，另一方面通過高額的設(shè)備投資對事故的擴(kuò)散進(jìn)行預(yù)防。
微生物的檢測一般在培養(yǎng)后進(jìn)行種類的鑒定和定量。即，伴有預(yù)培養(yǎng)→增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)的培養(yǎng)操作，從該培養(yǎng)操作開始到得到檢查結(jié)果需要幾天左右的時間，而且需要專業(yè)的測定技術(shù)人員。該長時間的測定在必須對要求迅速性的生鮮食品等食品的微生物進(jìn)行檢查時非常成問題。
因此，提出了簡易且迅速地檢測食物中毒病原菌的各種試劑和裝置。例如，已知免疫層析法，即應(yīng)用免疫化學(xué)反應(yīng)，使用與特定的菌(抗原)特異性結(jié)合的抗體使該特定的菌凝集，對抗原濃度進(jìn)行測定和分析。以下，以菌體表面具有固有的抗原決定基團(tuán)的病原性大腸桿菌0-157(在菌體表面表達(dá)與稱作0-157的抗體特異性結(jié)合的抗原決定基團(tuán)的具有病原性的大腸桿菌)作為抗原的一個例子，對于免疫層析法進(jìn)行詳細(xì)說明。
免疫層析法中，有例如表面等離子體激元共振法等抗體上不結(jié)合酶等標(biāo)記物而利用抗原抗體反應(yīng)引起的物理量等的變化來測定抗原的量的非標(biāo)記免疫層析法，以及放射免疫測定法等通過使用結(jié)合了酶等標(biāo)記物的抗體對標(biāo)記物的量進(jìn)行測定來測定抗原的量的標(biāo)記免疫層析法。在這里，對于后一種標(biāo)記免疫層析法、特別是因測定操作比較容易而成為目前的主流的“夾心法(夾心ELISA法)”進(jìn)行詳細(xì)說明。


圖12為以往的夾心法的主要步驟的模式圖。(a)為抗體(一級抗體)的固定化步驟，(b)為目標(biāo)菌(抗原)的捕獲步驟，(c)為采用酶標(biāo)抗體的染色步驟，(d)為抗體(二級抗體)的固定化步驟，(e)為標(biāo)記化菌體的洗脫步驟，(f)為洗脫了的標(biāo)記化菌體的檢測步驟。圖12(a)～(f)中，記載有固定化層表面100、一級抗體101、目標(biāo)菌102、二級抗體103、標(biāo)記物104、光源105、檢測器106。
圖12中，首先，在容易發(fā)生非特異性吸附的反應(yīng)容器中注入含有與病原性大腸桿菌0-157(目標(biāo)菌102)特異性結(jié)合的一級抗體101的溶液，使一級抗體101非特異性吸附在反應(yīng)容器的固定化層表面100，進(jìn)行固定化(圖12(a))。接著，在反應(yīng)容器中注入含有目標(biāo)菌102的試樣溶液，使目標(biāo)菌102通過抗原抗體反應(yīng)與固定化于反應(yīng)容器內(nèi)的一級抗體101特異性結(jié)合(圖12(b))。
接著，在反應(yīng)容器中注入含有通過標(biāo)記物104標(biāo)記化了的二級抗體103的溶液，使由二級抗體103和標(biāo)記物104構(gòu)成的酶標(biāo)抗體與反應(yīng)容器內(nèi)的目標(biāo)菌102通過抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合(圖12(c))。由此，可以將與目標(biāo)菌102成正比的量的酶標(biāo)抗體固定化在反應(yīng)容器上(圖12(d))。此外，在反應(yīng)容器中添加含有顯色底物的底物溶液，通過酶反應(yīng)使酶標(biāo)抗體顯色。
最后，通過例如氫氧化鈉水溶液等溶菌抽提液將結(jié)合了酶標(biāo)抗體的目標(biāo)菌102洗脫后(圖12(e))，在相對于光源105配置的檢測器106中，檢測染料特異性吸收的波長的光，測定抗原濃度(圖12(f))。
如上所述，若采用夾心法，與需要培養(yǎng)操作的檢查不同，即使沒有繁復(fù)的操作和專業(yè)的知識，也可以迅速地進(jìn)行適當(dāng)?shù)奈⑸餀z測。
另一方面，使用比采用夾心法的測定操作更容易處理的檢查試劑盒也可以迅速地進(jìn)行微生物檢測。例如，提出有通過使用能夠展開含有可與堿性磷酸酶特異性結(jié)合并顯色的顯色底物成分的底物液的檢測試劑盒而僅對大腸桿菌的活菌進(jìn)行迅速檢測的技術(shù)(參考專利文獻(xiàn)1)。
更具體地，專利文獻(xiàn)1所述的發(fā)明為檢測方法及檢測試劑盒，所述檢測方法至少具有以下步驟在吸水性基材的表面上的任意區(qū)域形成有固定了可與大腸桿菌特異性結(jié)合的特異性結(jié)合成分的固定相的檢測工具上使被檢液展開的步驟；在將被檢液展開后的吸水性基材上，使含有可與堿性磷酸酶特異性結(jié)合并顯色的顯色底物成分的底物液展開的步驟。
若采用該檢測方法及檢測試劑盒，則通過適當(dāng)調(diào)節(jié)吸水性基材的吸水性，可以將使被檢液和底物液展開的速度調(diào)至最適，而且可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化。此外，被檢液中存在大腸桿菌的活菌的情況下，對于通過特異性結(jié)合成分捕獲于固定相上的活菌所具有的堿性磷酸酶，顯色底物成分特異性地結(jié)合并顯色，所以甚至可以檢測出被檢液中是否有大腸桿菌的活菌，這是其優(yōu)點(diǎn)。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開2002-165599(段落編號 ～ )發(fā)明的揭示然而，上述夾心法和專利文獻(xiàn)1所記載的檢測方法存在如下的問題。
首先，夾心法中，到抗原檢出為止需要2次抗原抗體反應(yīng)(參看圖12(b)、(c))，各次抗原抗體反應(yīng)都需要一定時間，所以存在無法實(shí)現(xiàn)檢查的進(jìn)一步迅速化的問題。此外，夾心法中，一般使用與存在于大腸桿菌外膜的脂多糖特異性結(jié)合的抗體，所以無法區(qū)別大腸桿菌是活菌，還是死菌或菌片斷，存在于食品等的檢查階段將只含死菌或菌片斷而不引起食物中毒的合格品排除的問題。
此外，專利文獻(xiàn)1所記載的檢測方法中，如上所述，可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化和大腸桿菌活菌的檢出，但僅處理0.01ml～0.2ml的極少量的試樣(參考專利文獻(xiàn)1說明書段落編號 )，存在無法保證檢查的可靠性的問題。即，作為檢查對象的試樣量少的情況下，不僅大腸桿菌的含有幾率低，而且大腸桿菌中活菌的含有幾率也低，因此必然檢測精度和檢測靈敏度會降低。
特別是在食品工場即使發(fā)覺食物中毒的情況下，也已經(jīng)通過流動途徑被販賣給零售商，消費(fèi)者食用后才進(jìn)行應(yīng)對的情況較多，食物中毒擴(kuò)散的危險(xiǎn)性高，希望檢查的進(jìn)一步迅速化。
鑒于以上的問題，本發(fā)明的目的在于提供可以在短時間內(nèi)迅速檢測出作為抗原的微生物中的活菌、而且也能保證檢查的可靠性的檢測方法及檢測裝置。
為了解決以上的課題，本發(fā)明的特征在于，生成將大腸桿菌等被檢抗原與被該被檢抗原內(nèi)的活菌所酶解的標(biāo)記物作用而得到的標(biāo)記化抗原后，在固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相上，捕獲該標(biāo)記化抗原。
更具體地，本發(fā)明提供以下的發(fā)明。
(1)檢測方法，它是通過被檢抗原與被前述被檢抗原內(nèi)的活菌所酶解的標(biāo)記物的作用對前述被檢抗原內(nèi)的活菌進(jìn)行特異性標(biāo)記化而進(jìn)行檢測的檢測方法，其特征在于，使前述標(biāo)記物與前述被檢抗原作用而生成光學(xué)上可檢測的標(biāo)記化抗原，在固定化可與前述被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相上，捕獲前述標(biāo)記化抗原。
根據(jù)本發(fā)明，由于是通過大腸桿菌等被檢抗原(包括活菌和死菌)與被該被檢抗原中的活菌所酶解的標(biāo)記物的作用來檢測活菌的檢測方法，使標(biāo)記物與被檢抗原作用而生成通過熒光反應(yīng)等在光學(xué)上可檢測的標(biāo)記化抗原，在通過抗原抗體反應(yīng)固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相上，捕獲該標(biāo)記化抗原，所以捕獲對象為光學(xué)上可檢測的標(biāo)記化抗原(活菌)和未被標(biāo)記化而光學(xué)上無法檢測的死菌(菌片斷)。
因此，不需要以往的夾心法中所必需的二級抗體，因而以往需要2次的抗原抗體反應(yīng)僅1次即可，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化。此外，捕獲了的被檢抗原中，光學(xué)上可檢測的抗原只有作為標(biāo)記化抗原的活菌，所以可以區(qū)別活菌和死菌進(jìn)行檢測，能夠準(zhǔn)確地檢測出引起食物中毒的活菌。
另外，與以往的專利文獻(xiàn)1所述的檢測方法所處理的試樣量(0.01ml～0.2ml)相比，本發(fā)明的檢測方法所處理的試樣量為數(shù)十ml～數(shù)百ml，所以可以防止樣本抽取所引起的被檢抗原的含有幾率的低下，進(jìn)而可以防止檢測精度和檢測靈敏度的下降，保證檢查的可靠性。
(2)檢測方法，其特征在于，在前述固定相上，對通過增殖培養(yǎng)液增殖了的前述標(biāo)記化抗原進(jìn)行捕獲。
根據(jù)本發(fā)明，在上述固定相上對通過增殖培養(yǎng)液增殖了的前述標(biāo)記化抗原進(jìn)行捕獲，所以與添加增殖培養(yǎng)液前相比，可以提高標(biāo)記化抗原濃度，因而標(biāo)記化抗原的捕獲幾率提高，進(jìn)而可以提高檢測精度和檢測靈敏度。
(3)檢測方法，其特征在于，使含有前述標(biāo)記化抗原的試樣溶液循環(huán)多次的同時，在前述固定相上捕獲被循環(huán)的標(biāo)記化抗原。
根據(jù)本發(fā)明，使含有上述標(biāo)記化抗原的試樣溶液循環(huán)多次的同時，在上述固定相上捕獲被循環(huán)的標(biāo)記化抗原，所以可以使試樣溶液多次與固定化了一級抗原的固定相進(jìn)行接觸，標(biāo)記化抗原的捕獲幾率提高，可以提高檢測精度和檢測靈敏度。
(4)檢測方法，其特征在于，在固定化分別對應(yīng)多種前述被檢抗原可特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的多種固定相上，捕獲前述被檢抗原。
根據(jù)本發(fā)明，在固定化分別對應(yīng)多種上述被檢抗原可特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的多種固定相上，在一系列的檢查流程中一次性捕獲多種被檢抗原，所以可以提高檢查的迅速化和高效化。
(5)檢測裝置，它是具有可設(shè)置固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱的檢測裝置，其特征在于，在設(shè)置了前述固定相的柱中，捕獲前述被檢抗原被標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原。
根據(jù)本發(fā)明，由于是具有可設(shè)置固定化可與大腸桿菌等被檢抗原(包括活菌和死菌)特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱(生物柱(biocolumn))的檢測裝置，在設(shè)置了上述固定相的柱中，捕獲被檢抗原被只與活菌作用的標(biāo)記物標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原，所以不僅到標(biāo)記化抗原捕獲為止只需1次抗原抗體反應(yīng)即可，可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化，而且可以準(zhǔn)確地檢測出引起食物中毒的活菌。此外，因?yàn)榭梢酝瑫r處理大量的試樣，所以可以防止樣本抽取所引起的被檢抗原的含有幾率的低下，進(jìn)而可以防止檢測精度和檢測靈敏度的下降，保證檢查的可靠性。
(6)檢測裝置，其特征在于，前述檢測裝置還具備攪拌液體的攪拌裝置，前述標(biāo)記化抗原在前述攪拌裝置中被標(biāo)記化。
根據(jù)本發(fā)明，上述檢測裝置還具備對液體(試樣溶液)進(jìn)行機(jī)械攪拌的攪拌裝置，上述標(biāo)記化抗原在該攪拌裝置中被標(biāo)記化，所以可以促進(jìn)被檢抗原的標(biāo)記化，進(jìn)而高效地生成標(biāo)記化抗原。
(7)檢測裝置，其特征在于，前述柱可以多次使用。
根據(jù)本發(fā)明，上述柱可以多次使用，所以可以連續(xù)地、高效地進(jìn)行多次微生物檢查。
(8)檢測裝置，它是具有多根可設(shè)置固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱的檢測裝置，其特征在于，在設(shè)置了前述固定相的多根柱中，捕獲前述被檢抗原被標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原。
根據(jù)本發(fā)明，由于是具有多根(多種)可設(shè)置固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱的檢測裝置，在設(shè)置了該固定相的多根柱中，捕獲前述被檢抗原被標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原，所以可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化和高效化。
(9)生物柱，其中，設(shè)置了固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相。
根據(jù)本發(fā)明，通過提供設(shè)置了固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的生物柱，可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化和可靠化。通過使用例如冷凍干燥法等保存方法，可以長時間以穩(wěn)定化狀態(tài)保存該生物柱。
(10)攪拌方法，在設(shè)置了固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的生物柱中，利用前述生物柱內(nèi)的壓力變化，攪拌前述固定相。
根據(jù)本發(fā)明，若使生物柱內(nèi)產(chǎn)生劇烈的壓力變化，增加流過生物柱內(nèi)的檢測水樣的流速，則可以在生物柱內(nèi)攪拌固定相，因此可以使固定相與試樣溶液(檢測水樣)充分地接觸，能夠保持高檢測精度和檢測靈敏度。
如上所述，本發(fā)明使以往需要2次的抗原抗體反應(yīng)減至1次，所以可以實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化，而且將光學(xué)上可檢測的抗原作為標(biāo)記化抗原(活菌)，所以能夠判別活菌和死菌，還因?yàn)榭梢蕴幚泶罅康脑嚇樱虼丝梢员ＷC檢查的可靠性實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下，基于附圖，對用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式進(jìn)行說明。
圖1為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置1的外觀圖。
圖1中，本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置1在內(nèi)部具有泵和閥的箱狀操作箱的側(cè)面具備設(shè)置了捕獲目標(biāo)菌的固定相的生物柱2。此外，在該生物柱2的旁邊，設(shè)置有裝入了洗脫捕獲后的目標(biāo)菌的溶菌液的M-Cell3，在檢測裝置1的上表面設(shè)置有例如瓶B1～B5的5個瓶(數(shù)量不限)。
在這里，圖2為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置1所設(shè)置的生物柱2的放大圖。圖2中，該生物柱2通過在生物柱用玻璃管的內(nèi)部填充可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)捕獲抗原的玻璃珠而制成。
更具體地，首先用氫氧化鈉水溶液和鹽酸對玻璃珠進(jìn)行預(yù)處理后，將其干燥一晚。然后，對該玻璃珠進(jìn)行燒結(jié)處理，采用硅烷化試劑的硅烷化處理后，進(jìn)行漂洗，在室溫下使其干燥，從而制成硅烷化玻璃珠。
接著，在生物柱用玻璃管中填充約0.5克該硅烷化玻璃珠。然后，在含有作為偶聯(lián)劑的戊二醛的戊二醛溶液中浸漬數(shù)十分鐘，用磷酸緩沖液清洗后，通過非特異性吸附進(jìn)行一級抗體固定化處理。該一級抗體固定化處理中，通過適當(dāng)清洗生物柱用玻璃管，除去未反應(yīng)的一級抗體。
接著，一級抗體固定化處理結(jié)束后，注入含有作為封閉劑的牛白蛋白血清的封閉溶液，使封閉劑非特異性吸附到殘存于硅烷化玻璃珠表面的非特異性吸附面上，防止以后發(fā)生其它有機(jī)物質(zhì)等的非特異性吸附。
最后，用磷酸緩沖液等將生物柱用玻璃管內(nèi)清洗多次，除去未反應(yīng)的封閉劑，從而制成生物柱2。通過使用例如冷凍干燥法等保存方法，可以長時間以穩(wěn)定化狀態(tài)保存該生物柱2。
本發(fā)明的實(shí)施方式中對使用玻璃珠的生物柱2的制作進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不局限于此，例如為了確立硅烷化處理和偶聯(lián)處理等的各種條件，可以使用比較容易處理的平面類玻璃。此外，本發(fā)明的實(shí)施方式中使用球狀的玻璃珠，但玻璃珠是固定化抗體的載體(固定化抗體的母體)之一，只要是具有可以固定化抗體的表面積、在將其填充到柱中的狀態(tài)下可以充分使抗體與檢測水樣接觸的形態(tài)的載體，可以是任意的形狀。制作步驟與使用上述玻璃珠的生物柱2的制作步驟大致相同，所以將其說明略去。此外，本發(fā)明中，只要可以在固定化層表面固定一級抗體，可以使用任意的珠的材質(zhì)、硅烷化處理?xiàng)l件、一級抗體固定化方法。
圖3為使用圖1所示的檢測裝置1進(jìn)行微生物檢查時的流路系統(tǒng)圖。此外，圖4為圖3所示的流路系統(tǒng)圖中的檢查步驟的簡略流程圖。
圖3中，在瓶B1中注入有含被檢抗原的檢測水樣(例如100ml)，所述被檢抗原中混有添加作為染色試劑的6-羧基熒光素二乙酸酯和稀釋(CFDA稀釋)液(含有標(biāo)記物的溶液)并經(jīng)水解而被標(biāo)記化了的活菌(標(biāo)記化抗原)和未進(jìn)行水解的死菌，瓶B5和瓶B6中注入有作為柱清洗液的磷酸緩沖液，M-Cell3中注入有洗脫生物柱2中捕獲的目標(biāo)菌的堿性水溶液。此外，本實(shí)施方式中所用的CFDA可以對活菌染色，而且可以用能以熒光顯色等檢測的藥劑代替它們。
圖4中，首先進(jìn)行固定化步驟(步驟S1)。更具體地，在圖3中，通過使泵P1工作，注入到瓶B1中的添加CFDA稀釋液的檢測水樣以瓶B1→閥V1→閥V2→泵P1→閥V3→生物柱2→閥4→閥5→閥6→瓶B2的順序流動。所需時間為大約15分鐘。然后，通過切換閥V1，貯留在瓶B2的檢測水樣以瓶B2→閥V1→閥V2→泵P1→閥V3→生物柱2→閥4→閥5→閥6→瓶B3的順序流動。所需時間為大約15分鐘。通過以上步驟S1的固定化步驟，使檢測水樣中的被檢抗原經(jīng)抗原抗體反應(yīng)與固定化于生物柱2(玻璃珠)的一級抗體特異性結(jié)合?？梢栽谄緽1中預(yù)先添加增殖培養(yǎng)液，捕獲通過該增殖培養(yǎng)液增殖了的標(biāo)記化抗原。由此，可以提高標(biāo)記化抗原濃度，提高標(biāo)記化抗原的捕獲幾率。
在這里，為了維持高檢測精度和檢測靈敏度，必須使固定化特異性結(jié)合抗體而形成的固定相(玻璃珠)與循環(huán)的試樣溶液(檢測水樣)充分接觸。因此，本實(shí)施方式中，使用電磁式套筒節(jié)流閥PV(參看圖3)，有效地?cái)嚢枭镏?內(nèi)的玻璃珠(固定相)。更具體地，使用圖5進(jìn)行說明。圖5為有效地?cái)嚢韫潭ㄏ嗟臓顟B(tài)的說明圖。
圖5中，設(shè)于生物柱2與閥3之間的套筒節(jié)流閥PV從開狀態(tài)(ON狀態(tài))變?yōu)殛P(guān)狀態(tài)(OFF狀態(tài))時(圖5左圖→圖5中圖)，隨著檢測水樣停止從套筒節(jié)流閥PV向生物柱2的流動，套筒節(jié)流閥PV的閥V3側(cè)的管道壓力增加。然后，經(jīng)過規(guī)定時間后，若套筒節(jié)流閥PV從關(guān)狀態(tài)(OFF狀態(tài))變?yōu)殚_狀態(tài)(ON狀態(tài))時(圖5中圖→圖5右圖)，則檢測水樣再次從套筒節(jié)流閥PV向生物柱2流動。
這時，由于套筒節(jié)流閥PV在規(guī)定時間內(nèi)處于關(guān)狀態(tài)(OFF狀態(tài))，生物柱2內(nèi)產(chǎn)生劇烈的壓力變化，使流過生物柱2內(nèi)的檢測水樣的流速增加。其結(jié)果是，生物柱2內(nèi)玻璃珠(固定相)被攪拌(參看圖5右圖)。
如上所述，本實(shí)施方式中，使檢測水樣在生物柱2內(nèi)循環(huán)時，將套筒節(jié)流閥PV以規(guī)定的時間進(jìn)行開關(guān)，形成定期地、且有效地?cái)嚢韫潭ㄏ?玻璃珠)的結(jié)構(gòu)。由此可以使固定相(玻璃珠)與檢測水樣充分接觸。
本實(shí)施方式中使用了電磁式的套筒節(jié)流閥PV，但本發(fā)明并不局限于此，可以使用例如手動式或電動式的套筒節(jié)流閥。此外，只要是起到適度攪拌生物柱2內(nèi)的固定相的效果的裝置，可以任意使用，并不特定于套筒節(jié)流閥。
接著，進(jìn)行清洗步驟(步驟S2)。具體來說，圖3中，通過切換閥V2，貯留于瓶B5的磷酸緩沖液以瓶B5→閥V2→泵P1→閥V3→生物柱2→閥V4→閥V5→瓶B4的順序流動。然后，關(guān)閉泵P1的開關(guān)。所需時間為大約15分鐘。通過以上步驟S2的清洗步驟，使磷酸緩沖液流入生物柱2，洗凈未反應(yīng)的一級抗體等，從而將被檢抗原凝縮化。
接著，進(jìn)行洗脫步驟(步驟S3)。具體來說，圖3中，通過切換閥V3和閥V4，使裝入了洗脫被檢抗原的溶菌液的M-Cell3和泵P2工作，從而將在生物柱2中被捕獲了的被檢抗原洗脫。然后，在具備流通池(圖3中的右下)的熒光分光光度計(jì)中，對被檢抗原中被標(biāo)記化了的活菌(標(biāo)記化抗原)進(jìn)行光學(xué)檢測(色譜圖測定)。通過以上步驟S3的洗脫步驟，進(jìn)行僅對引起食物中毒的活菌的檢測。然后，經(jīng)以上步驟S1～步驟S3的一系列步驟，微生物檢查告一段落。
在瓶B4和瓶B6中注入數(shù)次實(shí)驗(yàn)量的藥液連續(xù)進(jìn)行微生物檢查的情況下，如圖4所示，追加進(jìn)行清洗步驟(步驟S4)。具體來說，在圖3中，使泵P2工作，切換閥V4和閥V7，利用貯留于瓶B6的磷酸緩沖液對生物柱2進(jìn)行清洗。
由上述說明可知，若采用圖4所示的步驟S1～步驟S3(步驟S4)的一系列檢查步驟，則可以僅對作為抗原的微生物中的活菌進(jìn)行檢測。此外，通過本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置1可以檢查的檢測水樣量與檢查試劑盒等所用的檢測水樣量(約0.01ml～0.2ml)不同，為數(shù)十ml～數(shù)百ml，所以可以防止伴隨試樣的樣本化而產(chǎn)生的大腸桿菌的含有幾率的低下，進(jìn)而可以提高檢測精度和檢測靈敏度。清洗、洗脫、清洗的各步驟中所用的試劑及其方法在不超出本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)可以進(jìn)行變更。
另外，若采用圖4所示的步驟S1～步驟S3(步驟S4)的一系列檢查步驟，則可以在比以往的夾心法更短的時間內(nèi)進(jìn)行微生物檢查。對于使用檢測裝置1的檢查的迅速化，以下使用圖6的模式圖進(jìn)行詳細(xì)說明。
圖6為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測方法的主要步驟的模式圖。(a)為抗體(一級抗體)的固定化步驟，(b)為含有被檢抗原的試樣液與熒光試劑的攪拌步驟，(c)為含有標(biāo)記化抗原的捕獲步驟，(d)為被檢抗原的固定化步驟，(e)為被檢抗原的洗脫步驟，(f)為僅檢測洗脫了的被檢抗原中的標(biāo)記化抗原的檢測步驟。圖6(a)～(f)中，記載有固定化層表面10、一級抗體11、目標(biāo)菌(活菌)12、標(biāo)記物13、標(biāo)記化抗原14、光源15、檢測器16。
圖6中，首先使一級抗體11非特異性吸附于生物柱用玻璃管中所填充的玻璃珠的固定化層表面10上，進(jìn)行固定化(圖6(a))。本步驟的具體細(xì)節(jié)如生物柱2的制作步驟中所述。
接著，通過在含有被檢抗原的試樣液中添加熒光試劑，使作為目標(biāo)菌的活菌12發(fā)光(圖6(b))。更具體地，在試樣液中添加CFDA稀釋液后，被檢抗原中的活菌吸收作為細(xì)胞內(nèi)pH指示劑的CFDA(標(biāo)記物13)，通過水解而發(fā)出熒光。即，CFDA具有作為活菌染色劑的功能。在試樣液中添加CFDA稀釋液后，可以通過攪拌裝置的攪拌，促進(jìn)活菌引起的水解。由此，可以在更短時間內(nèi)、且可靠地使活菌吸收CFDA，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化。
接著，使存在被檢抗原(包括標(biāo)記化抗原14)的試樣液與生物柱2的固定化層表面10接觸，通過與一級抗體11的抗原抗體反應(yīng)捕獲被檢抗原(圖6(c))。進(jìn)行被檢抗原的捕獲后，通過使磷酸緩沖液等洗脫溶液流入生物柱2，去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的一級抗體等，進(jìn)行被檢抗原的凝縮化(濃縮化)和被檢抗原的固定化(圖6(d))。圖6(b)所示的攪拌步驟、圖6(c)所示的捕獲步驟和圖6(d)所示的固定化步驟較好是重復(fù)進(jìn)行多次。由此，未反應(yīng)狀態(tài)的被檢抗原的數(shù)量減少，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測精度和檢測靈敏度的提高。
接著，通過堿性水溶液對被一級抗體11固定化的含有標(biāo)記化抗原14的被檢抗原進(jìn)行溶菌和洗脫(圖6(e))。這時，通過減少循環(huán)路徑內(nèi)容量和流通池內(nèi)容量，使溶菌和洗脫所需的堿性水溶液的量減少，可以提高溶菌抽提液中的菌濃度，進(jìn)而提高檢測靈敏度。本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用高濃度堿性水溶液，例如通過同時使用酸性緩沖液和表面活性劑等，可以更迅速且可靠地對被檢抗原進(jìn)行溶菌和洗脫。
最后，利用與光源15對向配置的檢測器16對標(biāo)記化抗原14進(jìn)行光學(xué)檢測(圖6(f))。更具體地，含有標(biāo)記物13的標(biāo)記化抗原14通過光源15發(fā)出的紫外線激發(fā)光而發(fā)出熒光，在具備聚光透鏡的檢測器16接收該熒光，從而得到電信號(色譜信號)。通過對該電信號進(jìn)行測定和分析，可以對標(biāo)記化抗原14(目標(biāo)菌12)進(jìn)行光學(xué)檢測。本發(fā)明的實(shí)施方式中使用了熒光分光光度計(jì)，也可以使用例如粒子計(jì)數(shù)器等檢測器等任意的檢測方式。
如上所述，采用圖6(a)～圖6(f)所示的一系列步驟，可以在比以往的夾心法更短的時間內(nèi)進(jìn)行微生物檢查。即，以往的夾心法中，到被檢抗原的檢出為止需要2次抗原抗體反應(yīng)(參看圖12(b)、(c))，若采用本發(fā)明，僅標(biāo)記化抗原14與一級抗體11的1次抗原抗體反應(yīng)即可(參看圖6(c))，可以減少相應(yīng)的檢測時間，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢查的迅速化。
圖7為本發(fā)明的另一實(shí)施方式的檢測裝置的外觀圖。主要特征為設(shè)有2根可捕獲特定目標(biāo)菌的生物柱65、66。圖7中設(shè)有2根生物柱65、66，但本發(fā)明并不局限于此，例如可以設(shè)置3根以上的生物柱。通過設(shè)置多根生物柱，可以同時檢測多種目標(biāo)菌。
圖7中，本發(fā)明的另一實(shí)施方式的檢測裝置中，各設(shè)備、泵、瓶等設(shè)置在35±1℃的恒溫槽(圖中的方框)的內(nèi)部，各設(shè)備和泵通過流路控制用程控裝置69被控制在最適。恒溫槽的內(nèi)部設(shè)有含目標(biāo)菌的試驗(yàn)試樣供給槽(試樣進(jìn)樣器)61、攪拌試樣的攪拌裝置(磁攪拌器)62、去除雜質(zhì)的過濾器63、適當(dāng)切換流路的流路切換閥64、填充了在表面固定化有目標(biāo)菌抗體的玻璃微粒的生物柱65和66、使試樣流動的循環(huán)泵67、對目標(biāo)菌進(jìn)行光學(xué)檢測的高靈敏度熒光檢測器68，還設(shè)有裝入了清洗液的瓶B11、裝入了固定化液的瓶B12和裝入了捕獲的染色菌的溶菌抽提液的瓶B13。以下，對使用圖7所示的檢測裝置的檢查步驟進(jìn)行簡要說明。
首先，通過規(guī)定方法將規(guī)定量的試樣均質(zhì)化(stomaching)，將試驗(yàn)溶液(50～100ml)加入到試驗(yàn)試樣供給槽61中。然后，一邊用攪拌裝置62進(jìn)行攪拌，一邊添加作為熒光染色試劑的CFDA，對活菌進(jìn)行染色。攪拌約10分鐘后，通過過濾器63除去雜質(zhì)，同時導(dǎo)入試樣流路(生物柱65)。將流路切換閥64切換至過濾器反向清洗系統(tǒng)，將過濾器63洗凈。
接著，將通過了過濾單元(過濾器63)的試驗(yàn)溶液通過生物柱65、66，在整個流路清洗系統(tǒng)流路中循環(huán)，在生物柱65、66內(nèi)通過數(shù)次。然后，通過將從瓶B13少量添加到生物柱65、66內(nèi)的再循環(huán)流路系統(tǒng)中的溶菌抽提液進(jìn)行多次再循環(huán)，將被固定化抗體捕獲的染色菌體(標(biāo)記化抗原)以高濃度洗脫。洗脫結(jié)束后的試驗(yàn)溶液通過生物柱65、66下部的切換閥64導(dǎo)向高靈敏度熒光檢測器68，形成電信號，繪成色譜圖。
更具體地，洗脫結(jié)束后的試驗(yàn)溶液被導(dǎo)入高靈敏度熒光檢測器68的流通池，該試樣溶液中的染色菌體通過從光源發(fā)出的紫外線激發(fā)光而發(fā)出熒光。然后，該熒光通過聚光透鏡接收，將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，從而繪成色譜圖。
最后，溶菌和洗脫結(jié)束后，填充了固定化有目標(biāo)菌抗體的玻璃微粒的生物柱65、66通過瓶B11內(nèi)的清洗液進(jìn)行清洗，進(jìn)行更新。
如上所述，采用圖7所示的檢測裝置，通過設(shè)置2根生物柱65、66，可以在1次檢查的流程中同時捕獲2種目標(biāo)菌，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢查的高效化和迅速化。
通過將不同抗體的多根生物柱串聯(lián)設(shè)置，可以同時檢測多種目標(biāo)菌。此外，通過將同一抗體的多根生物柱并聯(lián)設(shè)置，可以同時檢測多份特定目標(biāo)菌的檢測水樣。另外，也可以同時使用這兩種方式。
本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測方法中，基本上沒有培養(yǎng)步驟也足以檢測目標(biāo)菌。但是，根據(jù)需要，通過培養(yǎng)目標(biāo)菌，可以獲得更可靠的檢查結(jié)果。培養(yǎng)步驟的實(shí)施可以如下進(jìn)行例如，通過在檢測裝置上預(yù)先設(shè)置加熱器在固定化步驟前進(jìn)行培養(yǎng)，或者使包括了檢查步驟的檢測裝置整體達(dá)到一定溫度來進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例1
圖8為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行生物柱2的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的圖。更具體地，表示了相對于大腸桿菌(E.coli)的注入量(CFU/100ml)的CFDA熒光強(qiáng)度。由圖8所示的表可知，大腸桿菌注入量與溶菌抽提液中的CFDA熒光強(qiáng)度之間發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)。即，由將圖8所示的表的各個數(shù)據(jù)在2維空間內(nèi)作圖得到的圖9可知，隨著大腸桿菌的注入量增加，CFDA熒光強(qiáng)度也增加，適合于目標(biāo)菌的檢測。
在這里，圖8所示的表中，對于大腸桿菌的注入量為最小濃度10CFU/ml的檢測水樣，也獲得了較強(qiáng)的熒光圖譜(平均1.2050)，所以認(rèn)為對于約5CFU/ml的檢測水樣，也適合于目標(biāo)菌的檢測。此外，通過減少循環(huán)路徑內(nèi)的容量和微流通池的容量，使溶菌抽提液的需要量減少，可以提高溶菌抽提液的菌濃度，認(rèn)為對于約1～5CFU/ml的檢測水樣，也適合于目標(biāo)菌的檢測。
圖10為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行生物柱2的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的表。特別是，圖10(a)表示對于實(shí)施了染色處理的死菌的CFDA熒光強(qiáng)度。由圖10(a)可知，即使注入被檢抗原中的死菌，溶菌抽提液中的CFDA熒光強(qiáng)度也非常微弱。即，實(shí)際的檢測水樣中，即使混有不會直接引起食物中毒的死菌，也可以不受干擾地、高精度地評價活菌，進(jìn)而可以解決排除僅含死菌的合格品的問題。
此外，圖10(b)表示對于除大腸桿菌(E.coli)以外的多種菌(大腸菌群弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)，腸道細(xì)菌科菌粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens))的注入量(CFU/100ml)的CFDA熒光強(qiáng)度。由圖10的表可知，對于除大腸桿菌以外的菌，溶菌抽提液的CFDA熒光強(qiáng)度弱。即，與死菌同樣地，即使在試樣溶液中共存有目標(biāo)菌以外的菌的情況下，也可以將其影響降到較低。
圖11為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行反復(fù)使用后的生物柱2的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的表。更具體地，表示生物柱2的相對于累計(jì)使用次數(shù)(次)的CFDA熒光強(qiáng)度。由圖11可知，若累計(jì)使用生物柱2兩次，則第二次使用時，溶菌洗脫液中的CFDA熒光強(qiáng)度減少約98％。認(rèn)為這是由于目標(biāo)菌的洗脫中使用具有溶菌作用的高濃度的堿，這時作為蛋白質(zhì)的抗體與菌一起受到破壞的緣故。因此，例如通過使用對抗體的破壞少的溶菌抽提液，生物柱2可以使用多次。
接著，對改變試驗(yàn)材料的種類和量后進(jìn)行的評價試驗(yàn)進(jìn)行以下的說明。
首先，將100ml通過MPN法等推定了菌數(shù)的菌液移入試驗(yàn)裝置的試樣供給瓶內(nèi)，加入1ml含有CFDA的活菌染色液，使所有液體以每分鐘10ml的流速在生物柱2中循環(huán)2次后，將水樣排出。接著，將所有的試樣液用于生物柱后，通過適量的生物柱清洗液，對生物柱的內(nèi)部進(jìn)行清洗后，切換流路，將殘留在生物柱內(nèi)部的生物柱清洗液全部排出。
然后，使用總量10ml的溶菌抽提液，對在上述步驟中被活菌染色的且被生物柱捕獲的目標(biāo)菌進(jìn)行溶菌抽提，同時導(dǎo)入熒光分光光度計(jì)的流通池，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。該測定結(jié)束后，用滅菌磷酸緩沖稀釋水溶液清洗整個流路系統(tǒng)。
以上為評價試驗(yàn)的概要，所需時間為約1小時。在所述評價試驗(yàn)中知道，如果試樣中存在約30CFU以上的目標(biāo)活菌，則具有足夠的檢測能力。此外，還知道除大腸桿菌以外的菌(大腸菌群和腸道細(xì)菌)的影響、死菌的影響極其輕微，實(shí)用上沒有問題。因此，本發(fā)明中例舉了大腸桿菌作為對象，但只要可以通過抗原抗體反應(yīng)捕獲，可以是任意的，例如也可以將霉類作為對象。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的檢測方法和檢測裝置通過檢測使被檢抗原和被該被檢抗原內(nèi)的活菌所酶解的標(biāo)記物作用而得到的標(biāo)記化抗原，可以將試樣溶液的活菌作為目標(biāo)菌，而且能夠保證檢查的迅速性和可靠性，非常有用。
附圖的簡單說明圖1為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置的外觀圖。
圖2為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測裝置中所設(shè)置的生物柱的放大圖。
圖3為使用圖1所示的檢測裝置進(jìn)行微生物檢查時的流路系統(tǒng)圖。
圖4為圖3所示的流路系統(tǒng)圖中的檢查步驟的簡略流程圖。
圖5為有效地?cái)嚢韫潭ㄏ嗟臓顟B(tài)的說明圖。
圖6為本發(fā)明的實(shí)施方式的檢測方法的主要步驟的模式圖。
圖7為本發(fā)明的另一實(shí)施方式的檢測裝置的外觀圖。
圖8為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行生物柱的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的圖。
圖9為將圖8所示的表的各個數(shù)據(jù)在2維空間內(nèi)作圖得到的圖。
圖10為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行生物柱的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的表。
圖11為在圖3所示的流路系統(tǒng)中進(jìn)行反復(fù)使用后的生物柱的性能實(shí)驗(yàn)時的測定結(jié)果的表。
圖12為以往的夾心法的主要步驟的示意圖。
符號的說明1 檢測裝置2 生物柱3 M-Cell10 固定化層表面11 一級抗體12 目標(biāo)菌(活菌)13 標(biāo)記物14 標(biāo)記化抗原15 光源16 檢測器
權(quán)利要求
1.檢測方法，它是通過被檢抗原與被前述被檢抗原內(nèi)的活菌所酶解的標(biāo)記物的作用、對前述被檢抗原內(nèi)的活菌進(jìn)行特異性標(biāo)記化而進(jìn)行檢測的檢測方法，其特征在于，使前述標(biāo)記物與前述被檢抗原作用而生成光學(xué)上可檢測的標(biāo)記化抗原，在固定化可與前述被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相上，捕獲前述標(biāo)記化抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在前述固定相上，對通過增殖培養(yǎng)液增殖了的前述標(biāo)記化抗原進(jìn)行捕獲。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，使含有前述標(biāo)記化抗原的試樣溶液循環(huán)多次的同時，在前述固定相上捕獲被循環(huán)的標(biāo)記化抗原。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于，在固定化分別對應(yīng)多種前述被檢抗原可特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的多種固定相上，捕獲前述被檢抗原。
5.檢測裝置，它是具有可設(shè)置固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱的檢測裝置，其特征在于，在設(shè)置了前述固定相的柱中，捕獲前述被檢抗原被標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測裝置，其特征在于，前述檢測裝置還具備攪拌液體的攪拌裝置，前述標(biāo)記化抗原在前述攪拌裝置中被標(biāo)記化。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測裝置，其特征在于，前述柱可以多次使用。
8.檢測裝置，它是具有多根可設(shè)置固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的柱的檢測裝置，其特征在于，在設(shè)置了前述固定相的多根柱中，捕獲前述被檢抗原被標(biāo)記化而得到的標(biāo)記化抗原。
9.生物柱，其特征在于，設(shè)置了固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相。
10.攪拌方法，其特征在于，在設(shè)置了固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相的生物柱中，利用前述生物柱內(nèi)的壓力變化，攪拌前述固定相。
全文摘要
本發(fā)明提供通過對被檢抗原內(nèi)的活菌進(jìn)行特異性標(biāo)記化，可以在短時間內(nèi)迅速檢測出作為抗原的微生物中的活菌，而且也能保證檢查的可靠性的檢測方法及檢測裝置。該檢測方法的特征在于，生成使大腸桿菌等被檢抗原與被該被檢抗原內(nèi)的活菌(目標(biāo)菌12)所酶解的標(biāo)記物13作用而得到的標(biāo)記化抗原14后，在固定化可與被檢抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合抗體而形成的固定相上，對該標(biāo)記化抗原14進(jìn)行捕獲。
文檔編號G01N30/50GK1989413SQ200580013890
公開日2007年6月27日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者御子柴徹, 佐佐木哲朗, 圓城寺隆治 申請人:安泰日本株式會社