專利名稱：定量電化學(xué)生物檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過電化學(xué)方法對(duì)生物結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行定量檢測的試紙條。
背景技術(shù)：
很多物質(zhì)的定性、定量分析可以通過抗原/抗體免疫檢測進(jìn)行，這些物質(zhì)既包括有機(jī)小分子、氨基酸、多肽、多糖，也包括蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細(xì)菌等生物大分子。一般來說，免疫檢測要在特殊的實(shí)驗(yàn)室操作，以微孔板或試管為反應(yīng)容器，經(jīng)過較長時(shí)間反應(yīng)后，達(dá)到較低的檢測下限。常規(guī)免疫檢測的主要缺陷是，由于涉及多步操作，包括抗原/抗體反應(yīng)、清洗、酶/底物反應(yīng)等，分析時(shí)間長、過程復(fù)雜、需要特殊儀器和設(shè)備，只適合在實(shí)驗(yàn)室使用。
近年來，人們更加注重開發(fā)用于護(hù)理點(diǎn)(point-of-care)的和移動(dòng)式免疫檢測儀。護(hù)理點(diǎn)檢測儀可以在中心檢驗(yàn)科以外的地方使用，比如專科室、病房、門診室、急診室，甚至病人家中。移動(dòng)式免疫檢測儀可以在現(xiàn)場對(duì)有毒物質(zhì)進(jìn)行快速診斷，以便當(dāng)場決定治理措施。目前，這些操作簡單、檢測快速的體系多數(shù)是通過免疫色譜的方式實(shí)現(xiàn)的。在這個(gè)方法中，生物結(jié)合分子(如抗體)固定在一個(gè)多孔試紙條的一端。含分析物的液體樣品加上試紙條的另一端后，在毛細(xì)管力的作用下，液體向固定了生物結(jié)合分子的一端流動(dòng)。分析物在固定區(qū)與抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，沒有結(jié)合的分析物隨著液體繼續(xù)流動(dòng)，達(dá)到分離效果。由于上述生物反應(yīng)的試劑通過液體在試紙條上的橫向流動(dòng)而混合，免疫色譜檢測在加樣后一步完成，操作便利，分析時(shí)間短(幾分鐘至十幾分鐘)。
目前使用的免疫檢測試紙條絕大部分采用膠體金作為信號(hào)標(biāo)記。當(dāng)生物結(jié)合反應(yīng)在試紙條的固定區(qū)發(fā)生時(shí)，膠體金在表面聚集，產(chǎn)生粉紅色色帶。使用者通過顏色的變化和產(chǎn)生顏色的深淺，可以做定性甚至半定量分析。類似的檢測在美國專利5622871，4703017，5468647，5622871，5798273中有描述。但是，金標(biāo)試紙條檢測結(jié)果沒有數(shù)字化，不利于存檔，也不能用于定量分析，極大地限制了技術(shù)的使用范圍。
也有一些利用試紙條進(jìn)行定量分析的描述。美國專利5756362采用liposome包裹的電活性分子作為信號(hào)標(biāo)記，在試紙條上進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后用電化學(xué)技術(shù)進(jìn)行定量檢測。美國專利6478938采用金屬膠體作為信號(hào)標(biāo)記，在試紙條上進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后通過測量導(dǎo)電率進(jìn)行定量分析。McNeil等人報(bào)道了用水解酶為標(biāo)記，用pH電極檢測的方法(C.J.McNeil et al.Electrochemistry Communications，2004，6，138-143)。上述方法仍處在探索階段，而且靈敏度有限。在美國專利6670115的描述中，試紙條僅僅作為試劑載體，免疫反應(yīng)和信號(hào)檢測均在電極表面進(jìn)行，這種方式對(duì)于生物分子的固定量有限，影響檢測靈敏度。
因此，現(xiàn)在需要一種器件，既充分發(fā)揮免疫檢測試紙條操作簡單、造價(jià)低、分析時(shí)間短、便于攜帶的優(yōu)勢，又能做到定量、高靈敏度檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種通過電化學(xué)方法對(duì)生物結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行定量檢測的試紙條，目的是提供一種快速、簡單、靈敏、定量的生物檢測試紙條，特別適合野外、現(xiàn)場、家庭、急診室等場所使用。
本發(fā)明所提供的試紙條，是在固體基質(zhì)上首先制備電極，然后加上一層固定了捕捉分子的膜材料。樣品中待測分子、膜上的捕捉分子和另外一個(gè)酶標(biāo)記分子之間進(jìn)行競爭或非競爭生物結(jié)合反應(yīng)，通過酶或者它的反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行定量檢測。
發(fā)明中的電極，可以利用各種厚膜或薄膜加工工藝在塑料基質(zhì)材料上制備。絲網(wǎng)印刷是一種成熟的厚膜加工工藝，已經(jīng)用于商品化的生物傳感器的制備?？梢杂糜诮z網(wǎng)印刷加工的電極材料包括碳、金、銀、氯化銀，塑料基質(zhì)材料包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸。
發(fā)明中的多孔膜，可以采用常規(guī)試紙條的膜材料，比如硝酸纖維素膜、尼龍膜。檢測所需的生物試劑可以預(yù)先固定在膜上，當(dāng)液體樣品滴加后，在毛細(xì)管力的作用下，液體帶動(dòng)試劑在膜內(nèi)橫向擴(kuò)散，造成試劑混合及分離。以免疫檢測為例，如果采用夾心法，則將酶標(biāo)記抗體固定在加樣區(qū)，捕捉抗體固定在反應(yīng)區(qū)。加樣后，液體帶動(dòng)分析物和標(biāo)記抗體做橫向流動(dòng)，在反應(yīng)區(qū)與捕捉抗體結(jié)合，形成夾心結(jié)合物。多余的試劑繼續(xù)流動(dòng)至收集區(qū)，與結(jié)合物自動(dòng)分離。類似的操作可以用于競爭免疫檢測，或其它生物結(jié)合反應(yīng)。
上述生物結(jié)合反應(yīng)完成后，向反應(yīng)區(qū)加入標(biāo)記酶的檢測試劑。由于反應(yīng)區(qū)處于電極的正上方，檢測試劑或它的反應(yīng)產(chǎn)物可以與電極接觸。這樣，通過電化學(xué)檢測儀向電極施加電壓或電流，測量產(chǎn)生的電信號(hào)，就可以對(duì)生物結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行定量分析。比較合適的酶標(biāo)記包括堿性磷酸酶、過氧化酶、葡萄糖氧化酶，而相應(yīng)的電化學(xué)測量方法有安培法、記時(shí)安培法、電量法、計(jì)時(shí)電量法、線型伏安法、循環(huán)伏安法等。


圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為基質(zhì)材料；2、3、4為電極導(dǎo)軌；5為絕緣層；6為工作電極；7為參比電極；8為對(duì)電極；9為膜材料；10為加樣區(qū)；11為反應(yīng)/檢測區(qū)；12為圍欄。
圖2為實(shí)施例1中獲得的結(jié)果，其中(A)為循環(huán)伏安圖，(B)為檢測電流與酶標(biāo)抗體濃度的關(guān)系圖。
圖3為實(shí)施例2中獲得的結(jié)果，其中(A)為循環(huán)伏安圖，(B)為檢測電流與抗雌二醇抗體濃度的關(guān)系圖。
圖4為實(shí)施例3中獲得的結(jié)果，其中(A)為循環(huán)伏安圖，(B)為檢測電流與雌二醇濃度的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1電化學(xué)方法檢測硝酸纖維素膜上小鼠IgG/羊抗小鼠IgG之間的免疫反應(yīng)。
取邊長1cm的方形硝酸纖維素膜，在10μg/mL小鼠IgG(溶于20mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液，pH9.5)中過夜浸泡。清洗后，用1％BSA封閉2小時(shí)。加入不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)。清洗后，將膜片放在絲網(wǎng)印刷電極片上，加入磷酸苯酚。等待5分鐘后，啟動(dòng)電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安檢測程序，記錄電流信號(hào)。得到如圖2所示結(jié)果，表明檢測的電流信號(hào)與酶標(biāo)抗體濃度在一定范圍內(nèi)呈線形關(guān)系，而且最低可以檢測0.1μg/mL(0.7nM)抗體。
實(shí)施例2電化學(xué)方法檢測硝酸纖維素膜上雌二醇抗原/抗體之間的免疫反應(yīng)。
取邊長1cm的方形硝酸纖維素膜，在10μg/mL雌二醇抗原(溶于20mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液，pH9.5)中過夜浸泡。清洗后，用1％BSA封閉1小時(shí)。加入不同濃度的雌二醇小鼠單抗，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)。清洗后，加入稀釋1000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)。清洗后，將膜片放在絲網(wǎng)印刷電極片上，加入磷酸苯酚。等待5分鐘后，啟動(dòng)電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安檢測程序，記錄電流信號(hào)。得到如圖3所示結(jié)果，表明檢測的電流信號(hào)與雌二醇抗體濃度在一定范圍內(nèi)呈相關(guān)性，而且最低可以檢測0.1μg/mL(0.7nM)抗體。
實(shí)施例3電化學(xué)方法檢測硝酸纖維素膜上雌二醇的競爭免疫反應(yīng)。
取邊長1cm的方形硝酸纖維素膜，在10μg/mL雌二醇抗原(溶于20mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液，pH9.5)中過夜浸泡。清洗后，用1％BSA封閉1小時(shí)。加入不同濃度的雌二醇和0.1μg/mL雌二醇小鼠單抗，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)。清洗后，加入稀釋1000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)。清洗后，將膜片放在絲網(wǎng)印刷電極片上，加入磷酸苯酚。等待5分鐘后，啟動(dòng)電化學(xué)工作站的循環(huán)伏安檢測程序，記錄電流信號(hào)。得到如圖4所示結(jié)果，表明檢測的電流信號(hào)隨雌二醇濃度的增加而降低，IC-50值約為40ng/mL。
權(quán)利要求
1.一種通過電化學(xué)方法對(duì)生物結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行定量檢測的試紙條，是在固體基質(zhì)上首先制備電極，然后加上一層固定了捕捉分子的膜材料。樣品中待測分子、膜上的捕捉分子和另外一個(gè)酶標(biāo)記分子之間進(jìn)行競爭或非競爭生物結(jié)合反應(yīng)，通過酶或者它的反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述電極包括一個(gè)工作電極、一個(gè)參比電極和一個(gè)對(duì)電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述電極包括一個(gè)工作電極和一個(gè)組合式參比電極/對(duì)電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述電極由絲網(wǎng)印刷方法制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述膜材料為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述捕捉分子是抗原、半抗原、抗體、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸(oligonucleotide)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述待測分子為有機(jī)分子、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、脂類、激素、類固醇、固醇、藥物化合物、碳水化合物及其復(fù)合物、。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述酶標(biāo)記為堿性磷酸酶、過氧化酶、葡萄糖氧化酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述生物結(jié)合反應(yīng)是抗原/抗體免疫反應(yīng)、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA雜交反應(yīng)和配體/受體反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述電化學(xué)方法是安培法、記時(shí)安培法、電量法、計(jì)時(shí)電量法、線型伏安法、循環(huán)伏安法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過電化學(xué)方法對(duì)生物結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行定量檢測的試紙條，目的是提供一種快速、簡單、靈敏、定量的生物檢測試紙條。本發(fā)明所提供的試紙條，是在固體基質(zhì)上首先制備電極，然后加上一層固定了捕捉分子的膜材料。樣品中待測分子、膜上的捕捉分子和另外一個(gè)酶標(biāo)記分子之間進(jìn)行競爭或非競爭生物結(jié)合反應(yīng)，通過酶或者它的反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明描述的電化學(xué)試紙條將常規(guī)試紙條簡單、快速、低成本的優(yōu)勢與電化學(xué)定量、靈敏的特點(diǎn)相結(jié)合，特別適合野外、現(xiàn)場、家庭、急診室等場所使用。
文檔編號(hào)G01N27/416GK1908645SQ20051008926
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月1日
發(fā)明者郭良宏 申請(qǐng)人:郭良宏