專利名稱：用新的抗il13單克隆抗體治療癌癥的制作方法
背景技術(shù)：
IL13是主要由CD4+T-輔助細(xì)胞2型細(xì)胞以及NKT細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生的多效性Th2細(xì)胞因子(Hershey，GKK，JAllergy Clin Immunol.(2003)111677-90)。除了在哮喘、纖維化、慢性肺部阻塞性疾病和潰瘍性結(jié)腸炎中的病原學(xué)作用之外(Wynn，TA，Annu Rev Immunol.(2003)21425-56；Wynn TA.，Nat RevImmunol.(2004)4583-94；Heller F et al.，Immunity(2002)17629-38)，也已知IL13在腫瘤生長(Kapp U et al.，J Exp Med.(1999)1891939-4；Trieu Y et al.，Cancer Res.2004；643271-5)和腫瘤免疫性調(diào)節(jié)(Terabe M et al.，Cancer Immunol Immunother.2004；5379-85；Terabe M et al.，Nat Immunol.2000；1515-20)中起重要作用。因此，IL13及其受體是癌癥的潛在治療靶。
霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)是一種淋巴結(jié)惡性疾病，其特征在于從HL的惡性細(xì)胞群Reed-Stemberg(RS)細(xì)胞中異常產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(見Kapp等及Trieu等，如前所述)。IL13還顯示出通過自分泌機(jī)制促進(jìn)HL增殖?？笽L13中和單克隆抗體(MAb)顯示出在體外抑制HL細(xì)胞增殖(Trieu等，如前所述)。
累積的證據(jù)表明IL13受體在多種人惡性腫瘤細(xì)胞系上表達(dá)(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸部腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、AIDS-相關(guān)的Kaposi′s癌、前列腺癌、胰腺癌、及上皮癌如胃、結(jié)腸和皮膚的腺癌)(見例如Debinski W et al.J Biol Chem.(1995)27016775-80；Puri RKet al.Blood(1996)874333-9；Maini A et al.J Urol.(1997)158948-53；Debinski W et al.Clin Cancer Res.(1995)11253-8；Kommann M et al.Anticancer Res.(1999)19125-31；Husain SR et al.Blood(2000)953506-13；Kawakami K et al.Cancer Res.(2001)616194-6200)。一種包含與突變形式的假單胞菌外毒素偶聯(lián)的IL13的重組融合蛋白示出在體外特異性殺死這些腫瘤細(xì)胞。因此，這些數(shù)據(jù)提示IL13受體是介導(dǎo)選擇性殺死腫瘤的引人注目的靶位。
現(xiàn)在已知抗腫瘤免疫性的主要介體是CD4+Th1細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。由于朝向Th2的免疫偏移抑制Th1發(fā)生，已經(jīng)提示在癌癥患者體內(nèi)誘導(dǎo)Th2應(yīng)答是阻遏腫瘤免疫監(jiān)視的主要機(jī)制。Terabe等人示出IL13抑制劑(sIL13R□2-Fc)在小鼠模型中抑制腫瘤復(fù)發(fā)。應(yīng)用STAT6或IL4R剔除的小鼠也發(fā)現(xiàn)相似的觀測結(jié)果，但應(yīng)用IL4剔除的小鼠沒有觀察到類似的結(jié)果?？傊?，這些結(jié)果表明IL13在體內(nèi)抑制抗腫瘤免疫性中起重要作用。因此，抑制IL13可以促進(jìn)癌癥患者的抗腫瘤免疫性。
已經(jīng)證實(shí)基于抗體的治療方法在治療各種癌癥中非常有效。例如，HERCEPTIN和RITUXAN已經(jīng)分別被成功用于治療乳腺癌和非霍奇金淋巴瘤。本發(fā)明提供了治療癌癥的另外的方法，這些方法克服了常規(guī)治療方法的限制，并提供了從下文詳細(xì)描述中將顯而易見的額外優(yōu)勢。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用新的抗IL13單克隆抗體治療表達(dá)IL13的癌癥和/或腫瘤。本發(fā)明使用的抗體包括新的抗IL13抗體，它們特異性并高親和性地結(jié)合糖基化和非糖基化的人IL13，但不結(jié)合小鼠IL13，并且以約1∶2(MAb∶IL13)的摩爾比中和人IL13活性。包含衍生自所述抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)的抗體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的抗體可以是單克隆的，單克隆抗體可以是人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
這些抗體例如是228B/C-1、228A-4、227-26和227-43。產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤于2003年11月20日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，保藏號分別為PTA-5657、PTA-5656、PA-5654和PTA-5655。這些抗體在體內(nèi)可以靶向表達(dá)IL13的腫瘤細(xì)胞。這些抗體在共同在審專利申請(WO＿＿，申請日為2004年12月23日)中描述，所述文獻(xiàn)并入本文作參考。
可用于本發(fā)明的抗體還包括如下抗體具有與SEQ ID NO3所示序列有至少95％同源性的VL序列及與SEQ ID NO4所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗體；具有與SEQ ID NO5所示序列有至少95％同源性的VL序列及與SEQ ID NO6所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗體；具有與SEQ ID NO7所示序列有至少95％同源性的VL序列及與SEQ ID NO8所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗體。本發(fā)明還包括一種重組抗體分子或者其結(jié)合IL13的片段，其包含至少一個抗體重鏈或其結(jié)合IL13的片段和至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合IL13的片段以及來自人單克隆抗體的構(gòu)架區(qū)，所述至少一個抗體重鏈或其結(jié)合IL13的片段在第31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)(Kabat編號)位包含來自小鼠抗IL13抗體的非人CDR，其中第27-30位具有氨基酸Gly 26、Phe 27、Ser28、Leu 29、Asn 30(SEQ ID NO18)，所述至少一個抗體輕鏈或其結(jié)合IL13的片段在第24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)位包含來自小鼠抗IL13抗體的非人CDR。
用于本發(fā)明的抗體還包括本發(fā)明的抗體的結(jié)合人抗原的抗體片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)。本發(fā)明還包括包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的單域抗體。一個實(shí)例是具有SEQ ID NO152所示序列的scFv。
用于本發(fā)明的抗體還包括單克隆抗體228B/C-1的人源化序列。這些人源化的重組抗體分子包含一個可變輕鏈區(qū)，其包含式為FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中FRL1由SEQ ID NO20-25的任一個序列組成；CDRL1由SEQ IDNO99-103的任一個序列組成；FRL2由SEQ ID NO29組成；CDRL2由SEQ ID NO104-114的任一個序列組成；FRL3由SEQ ID NO30-56的任一個序列組成；CDRL3由SEQ ID NO115-116的任一個序列組成；FRL4由SEQ ID NO57-59的任一個序列組成；所述人源化的重組抗體分子還包含一個可變重鏈區(qū)，其包含式為FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中FRH1由SEQ ID NO60-66的任一個序列組成；CDRH1由SEQ IDNO117-122的任一個序列組成；FRH2由SEQ ID NO67-75的任一個序列組成；CDRH2由SEQ ID NO123-134的任一個序列組成；FRH3由SEQ ID NO76-90的任一個序列組成；CDRH3由SEQ IDNo135-141的任一個序列組成；FRH4由SEQ ID NO91-92的任一個序列組成。所述可變重鏈區(qū)可進(jìn)一步包含恒定區(qū)的至少CH1結(jié)構(gòu)域或者恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。所述重鏈恒定區(qū)可包含一種IgG抗體，其中所述IgG抗體是IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或者IgG4抗體。
另外，本發(fā)明包括的抗體包含重組抗體分子，其中可變輕鏈選自SEQ ID NO3、5、7、93、95、97、142、144和150中的任一個序列，可變重鏈選自SEQ ID NO4、6、8、94、96、98、143、145、146、147、148和149中的任一個序列。一種特定的抗體包括具有SEQ IDNO142所示序列的可變輕鏈和具有SEQ ID NO143所示序列的可變重鏈。
MAb 228B/C-1的結(jié)合表位被定位于IL13上的一個負(fù)責(zé)與IL4Rα相互作用的獨(dú)特位點(diǎn)，其組成多聚的IL13R復(fù)合物的一部分。IL13上的這個結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離負(fù)責(zé)IL13R相互作用的位點(diǎn)，因此，228B/C-1可以與結(jié)合在過表達(dá)IL13R的腫瘤細(xì)胞上的IL13結(jié)合。本發(fā)明還提供了競爭結(jié)合由上述任何單克隆抗體識別的相同表位的抗體。本發(fā)明還包括結(jié)合與228B/C-1所結(jié)合的相同的表位的抗體。表位肽包括基本上包含或者由ESLINVSG(SEQ ID NO18)或YCAALESLINVS(SEQ ID NO19)組成的肽。
在另一個實(shí)施方案中，提供了一種分離的抗IL13單克隆抗體，其在體內(nèi)抑制表達(dá)IL13的癌細(xì)胞生長，或者其在體內(nèi)對這種細(xì)胞及含有這種細(xì)胞的腫瘤是毒性的。本發(fā)明提供了與胞毒劑或生長抑制劑綴合的抗IL13抗體。所述胞毒劑可以是毒素、細(xì)胞毒性小分子藥物、高能放射性同位素、可光活化的藥物、促凋亡(pro-apoptotic)的蛋白質(zhì)或藥物、細(xì)胞溶解酶或核溶解酶。
用于本發(fā)明中使抗體可包含一個人IgG1恒定區(qū)，其可通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(CMC)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)而介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞。這種抗體也可以抑制IL13依賴性腫瘤細(xì)胞生長。
前述實(shí)施方案中的抗IL13抗體包括完整的(全長)抗體以及抗體片段。在一個實(shí)施方案中，前述任一個實(shí)施方案的抗IL13抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。本發(fā)明的抗體的結(jié)合人抗原的抗體片段包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)。本發(fā)明還包括包含VL或者VH結(jié)構(gòu)域的單域抗體。一個實(shí)例是具有SEQ ID NO152所示序列的scFv。
本發(fā)明還涵蓋了包含上述實(shí)施方案的任一個抗IL13抗體及一種載體的組合物在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。所述載體是藥物可接受的載體。這些組合物可以以制造品或藥盒提供而用于治療癌癥。
本發(fā)明的再一方面是一種殺死表達(dá)IL13的癌細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述癌細(xì)胞與上述任一實(shí)施方案的抗IL13抗體接觸，從而殺死癌細(xì)胞。本發(fā)明另一方面是一種減輕或治療哺乳動物中表達(dá)IL13的癌癥的方法，所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明的抗IL13抗體給予所述哺乳動物。在前述方法的實(shí)施方案中，所述癌癥是腎細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、霍奇金淋巴瘤或者在其表面表達(dá)IL13受體的其它腫瘤或癌癥。在這些方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗IL13抗體是人抗體或人源化抗體。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體與一種胞毒劑如毒素或者放射性同位素及一種細(xì)胞生長抑制劑如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑綴合。
減輕表達(dá)IL13的癌癥的方法預(yù)期將抗IL13抗體與其它形式的癌癥治療方法如放療和化療聯(lián)合給予。對于后者，哺乳動物還接受至少一種化療劑。在一個特異的實(shí)施方案中，所述化療劑選自一組藥物如但不限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、硫替派(Thiotepa)，白消安(Busulfan)，Cytoxin，Taxol、氨甲喋呤、順鉑、美法侖(Melphalan)、長春堿(Vinblastine)、博來霉素和卡鉑(Carboplatin)。在另一個特異的實(shí)施方案中，所述抗IL13可以與其它抗腫瘤抗體例如但不限于抗VEGF MAb、抗Her2 MAb、抗EGFRMAb、抗EpCam MAb、抗神經(jīng)節(jié)苷脂MAb，抗組織因子MAb和抗整聯(lián)蛋白MAb聯(lián)合使用。
另一方面，本發(fā)明提供了制造品(article of manufacture)，包括一種容器和其中包含的組合物，其中所述組合物包含上述實(shí)施方案的抗IL13抗體，該制造品進(jìn)一步包含一個包裝插頁，指示所述組合物可用于減輕或治療表達(dá)IL13的癌癥。
本發(fā)明的另一方面包括診斷過表達(dá)IL13的癌癥或腫瘤，所述診斷包括使用本發(fā)明的抗IL13抗體檢測取自懷疑患有所述癌癥或腫瘤的患者的生物學(xué)樣品中IL13的過表達(dá)情況。
附圖簡述

圖1描述了抗IL13單克隆抗體與人IL13的結(jié)合。
圖2描述了抗IL13單克隆抗體與突變體IL13-Fc的結(jié)合。
圖3例證了mAb JES10-5A2(Pharmingen)對mAb 228B/C-1與人IL13的結(jié)合無抑制作用。
圖4例證了抗IL13單克隆抗體對霍奇金淋巴瘤L-1236細(xì)胞增殖的影響。
圖5例證了抗IL13單克隆抗體對IL13誘導(dǎo)的對人單核細(xì)胞中CD14表達(dá)的抑制作用的影響。
圖6例證了抗IL13單克隆抗體對IL13誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞中CD23表達(dá)的正調(diào)節(jié)作用的影響。
圖7例證了抗IL13單克隆抗體對IL13誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中STAT6磷酸化的影響。
圖8描述了單克隆抗體228B/C-1的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。
圖9描述了衍生自單克隆抗體228B/C-1的一些人源化抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。
詳細(xì)描述本發(fā)明不限于本文所述的特定方法學(xué)、方案、細(xì)胞系、載體或試劑，因為這些是可以變化的。另外，本文所用術(shù)語只是為了描述特定的實(shí)施方案而無限制本發(fā)明的范圍之意。如本文及所附權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式的“一個”、“一種”等除非上下文特別說明則包括復(fù)數(shù)形式，例如“一種宿主細(xì)胞”包括多個這類宿主細(xì)胞。
除非另外限定，則本文所用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語和任何縮寫均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的含義相同的含義。盡管在實(shí)施本發(fā)明時可以使用與本文所述相似或相同的任何方法和材料，但本文還是描述了使用設(shè)備和材料。
本文提及的所有專利和出版物均在法律允許的程度內(nèi)引入本文作為參考，以用于描述和披露這些專利和出版物中報道的可能用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)、酶、載體、宿主細(xì)胞和方法學(xué)。但是本文內(nèi)容不應(yīng)被理解為承認(rèn)本發(fā)明由于在先發(fā)明而使本發(fā)明無法占先于這種披露。
如本文所用，術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1hIgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。另外，術(shù)語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(mAb)意在包括完整分子以及能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，更快速地從動物或植物的循環(huán)中清除，且與完整抗體相比可具有更低的非特異性組織結(jié)合(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
如本文所用，術(shù)語“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，及包括分離自人免疫球蛋白文庫或者分離自用一或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因但不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的動物的抗體，如下文所述及例如Kucherlapati等的美國專利No.5,939,598所述。
抗體“效應(yīng)子功能(effector function)”是指可歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或者氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性，并且隨著抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)子功能例如包括Clq結(jié)合及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的負(fù)調(diào)節(jié)及B細(xì)胞激活作用。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或者“ADCC”是指一種細(xì)胞毒性形式，其中分泌的Ig結(jié)合某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷細(xì)胞(NK)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fcγ受體(FcγR)，使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨之用細(xì)胞酶或者氧化自由基殺死靶細(xì)胞?？贵w“武裝(arm)”細(xì)胞毒性細(xì)胞并且是這種殺傷所需要的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞-NK細(xì)胞-只表達(dá)FCγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。為了評價感興趣分子的ADCC活性，可以進(jìn)行如下文所述的體外ADCC分析。用于這類分析的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，感興趣的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)評價，例如在動物模型如Clynes et al.PNAS(USA)95652-656(1998)所揭示的動物模型中進(jìn)行。
免疫原使用重組IL13免疫小鼠以產(chǎn)生能產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。重組IL13可商購自許多來源(見例如R & D Systems，Minneapolis，MN，PeproTech，Inc.，NJ，和Sanofi Bio-Industries，Inc.，Tervose，PA.)?；蛘?，可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將編碼IL13的基因或cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體中，并在多種表達(dá)系統(tǒng)中的任一種中表達(dá)?？寺『捅磉_(dá)IL13的方法及IL13的核酸序列是公知的(見例如U.S.專利5,652,123所述)。由于遺傳密碼的簡并性，可以產(chǎn)生多個編碼IL13多肽的核苷酸序列。人們可以通過選擇基于可能的密碼子選擇的組合來改變核苷酸序列。這些組合是根據(jù)用于編碼天然發(fā)生的IL13多肽的核苷酸序列的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體遺傳密碼產(chǎn)生的，所有這些變化均加以考慮。這些多肽的任一種均可以用于免疫動物以產(chǎn)生結(jié)合IL13的抗體。
當(dāng)有益時，免疫原IL13多肽可表達(dá)為融合蛋白，所述融合蛋白具有與融合區(qū)段附著的IL13多肽。所述融合區(qū)段例如通過允許經(jīng)親和層析分離和純化融合蛋白而通常有助于蛋白質(zhì)純化。融合蛋白可以通過培養(yǎng)用融合核酸序列轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞而產(chǎn)生，所述融合核酸序列編碼包括附著于蛋白質(zhì)的羧基末端和/或氨基末端的融合區(qū)段的蛋白質(zhì)。融合區(qū)段可包括但不限于免疫球蛋白Fc區(qū)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、能結(jié)合二價金屬離子的聚組氨酸區(qū)段和麥芽糖結(jié)合蛋白。
使用包含突變形式的人IL13的融合蛋白產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。這種突變形式的IL13含有一個單突變，產(chǎn)生失活形式的蛋白質(zhì)(Thompson et al.，J.Biol.Chem.2742994(1969))。為了產(chǎn)生具有高親和性的中和抗體，所述融合蛋白包含與免疫球蛋白Fc特別是IgG1融合的突變IL13蛋白，并在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)，由此重組蛋白質(zhì)是天然糖基化的。融合蛋白的Fc部分可以提供一種暴露關(guān)鍵表位的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。所述糖基化可以增加表位的免疫原性，使得可以產(chǎn)生針對這一特殊表位的抗體。
在大腸桿菌中表達(dá)的IL13多肽缺乏糖基化，并且被測試的商購抗體使用這種蛋白質(zhì)產(chǎn)生。我們測試了這些抗體，例如R & DSystems和Pharmingen，發(fā)現(xiàn)它們與本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位不交叉反應(yīng)。
抗體產(chǎn)生本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體可以包含多克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備多克隆抗體的方法(Harlow，et al.，Antibodiesa Laboratory Manual，(Cold springHarbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)，在此以其全文并入?yún)⒖?。
例如，上述免疫原可以被給予各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有特異于該抗原的多克隆抗體的血清。所述免疫原的給予可以伴隨一或多次免疫制劑以及佐劑(如果需要)的注射。根據(jù)宿主物種，可以使用各種佐劑以增加免疫學(xué)應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔嘁血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚及潛在有用的人用佐劑如BCG(bacille Calmette-Guerin)和短小棒桿菌(Corynebacterium parvum)?？梢圆捎玫钠渌魟┑睦影∕PL-TDM佐劑(單磷酰脂A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案是本領(lǐng)域熟知的，可以通過在選定的宿主體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的任何方法進(jìn)行。佐劑也是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
典型地，免疫原(有或無佐劑)通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射或者經(jīng)肌內(nèi)或通過靜脈內(nèi)注射進(jìn)哺乳動物體內(nèi)。所述免疫原可包括一種IL13多肽、一種融合蛋白或其變體。根據(jù)所述多肽的性質(zhì)(即疏水性百分比，親水性百分比，穩(wěn)定性，凈電荷，等電點(diǎn)等等)，可以將所述免疫原與已知在被免疫的動物體內(nèi)是免疫原性的蛋白質(zhì)綴合。這種綴合包括通過衍生化所述免疫原和待綴合的免疫原性蛋白質(zhì)的活性化學(xué)官能團(tuán)由此形成共價鍵而進(jìn)行的化學(xué)綴合，或者通過基于融合蛋白的方法學(xué)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法進(jìn)行綴合。這種免疫原性蛋白質(zhì)包括但不限于匙孔嘁血藍(lán)蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑及混雜(promiscuous)T輔助細(xì)胞肽?？梢允褂酶鞣N佐劑增加如上所述的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體。單克隆抗體可以使用雜交瘤技術(shù)制備，如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)和美國專利No.4,376,110，Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold springHarbor Laboratory Press，2.sup.nd ed.(1988)，Hammerling，et al.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier，N.Y.，(1981))，或者技術(shù)人員已知的其它方法?？梢杂糜诋a(chǎn)生單克隆抗體的其它方法例如包括但不限于人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)，這類抗體可以是任何類別的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。
使用典型的雜交瘤技術(shù)，將宿主如小鼠、人源化小鼠(具有人免疫系統(tǒng)的小鼠)、倉鼠、兔、駱駝或任何其它合適的宿主動物用免疫原典型地免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異性結(jié)合IL13的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘撸馨图?xì)胞可以在體外用抗原免疫。
一般地，在制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤過程中，如果希望是人源細(xì)胞則使用外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，如果希望是非人哺乳動物來源則使用脾細(xì)胞或者淋巴結(jié)細(xì)胞。然后使用合適的融合劑如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與無限增殖化的細(xì)胞系融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)，pp.59-103)。無限增殖化的細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒動物、?；蛉嗽吹墓撬枇黾?xì)胞。典型地，應(yīng)用大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系。所述雜交瘤細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有抑制未融合的無限增殖化細(xì)胞生長或存活的一或多種物質(zhì)。例如，如果親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基典型地包括阻止HGPRT缺乏的細(xì)胞生長的物質(zhì)次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是有效融合、支持所選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定高水平表達(dá)抗體并且對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基是敏感的那些細(xì)胞系。更優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，其可以例如得自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.和American Type Culture Collection，Manassas，Va。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系也可以用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。
然后分析培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對IL13的單克隆抗體的存在情況。由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過例如免疫沉淀方法或者通過體外結(jié)合分析如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)而確定。這種技術(shù)為本領(lǐng)域所已知并且在技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。IL13的單克隆抗體的結(jié)合親和性可例如通過Scatchard分析(Munson et al.，Anal.Biochem.，107220(1980))而確定。
在鑒別了希望的雜交瘤細(xì)胞后，可以將這些克隆通過限制稀釋程序亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，如前述)培養(yǎng)。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括例如Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基和RPMI-1640。由這些亞克隆分泌的單克隆抗體可以通過常規(guī)免疫球蛋白純化程序分離或純化自培養(yǎng)基，所述純化程序例如是蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析或者親和層析。
本領(lǐng)域現(xiàn)有許多生產(chǎn)單克隆抗體的方法，因此本發(fā)明的抗體不限于僅在雜交瘤中產(chǎn)生。例如，單克隆抗體可以通過重組DNA方法產(chǎn)生，如美國專利No.4,816,567所述方法。在文中，術(shù)語“單克隆抗體”是指衍生自單一真核細(xì)胞、噬菌體或原核細(xì)胞克隆的抗體。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA可使用常規(guī)程序分離并測序(例如通過使用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈或者來自人、人源化的或其它來源的這些鏈的基因的寡核苷酸探針進(jìn)行)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。分離后，可以將DNA置于表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞如NSO細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞中，以在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。所述DNA也可以是修飾的，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利No.4,816,567；Morrison et al，如前述)或者通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列共價連接而進(jìn)行。這種非免疫球蛋白多肽可以取代本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者可以取代本發(fā)明抗體的一個抗原組合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生嵌合的二價抗體。
所述抗體可以是單價抗體。制備單價抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，一種方法包括重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和修飾的重鏈。所述重鏈通常是在Fc區(qū)的任一點(diǎn)被截短以防止重鏈交聯(lián)?；蛘撸嚓P(guān)的半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基取代或者缺失以防止交聯(lián)。
識別特異性表位的抗體片段可以通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的Fab和F(ab′)2片段可以通過使用酶如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或者胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab′)2片段)對免疫球蛋白分子進(jìn)行蛋白酶解而產(chǎn)生。F(ab′)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域。
對于一些應(yīng)用，包括抗體在人體內(nèi)及在體外檢測分析中的應(yīng)用，可優(yōu)選使用嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。嵌合抗體是其中抗體的不同部分衍生自不同動物物種的分子，如具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所已知，見例如Morrison，Science 2291202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4214(1986)；Gillieset al.，(1989)J.Immunol.Methods125191-202；美國專利No5,807,715；4,816,567和4,816,397所述，這些文獻(xiàn)和專利的全部內(nèi)容并入本文作參考。
人源化抗體是在非人物種中產(chǎn)生的結(jié)合希望的抗原的抗體分子，其具有來自非人物種的一或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(FR)。通常地，人構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基被來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代，以改變、優(yōu)選地改善抗原結(jié)合。這些構(gòu)架取代通過本領(lǐng)域熟知的方法鑒別，例如通過CDR與構(gòu)架殘基的相互作用的建模以鑒別對于抗原結(jié)合重要的構(gòu)架殘基，并進(jìn)行序列對比以鑒別在特定位置的與眾不同的構(gòu)架殘基(見例如Queen et al.，美國專利No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature 332323(1988)，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖??？贵w可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)人源化，例如CDR移植(EP 239,400；PCT出版物WO 91/09967；美國專利No5,225,539；5,530,101和5,585,089)，veneering或resurfacing(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91969-973(1994))和鏈改組(美國專利No.5,565,332)。
通常地，人源化抗體中被導(dǎo)入來自非人來源的一或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱作“輸入”殘基，其典型地取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上根據(jù)Winter及其同事所述的方法(Joneset al.，Nature，321522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988)，通過用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列而進(jìn)行。因此，這種“人源化的”抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中完整的人可變結(jié)構(gòu)域的少部分被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體典型地是人抗體，其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被嚙齒動物抗體中的相似位點(diǎn)取代。
完全的人抗體對于人類患者的治療是特別希望的。人抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法生產(chǎn)，包括上述使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法。也見例如美國專利No4,444,887和4,716,111，及PCT出版物WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO98/16664、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741所述；所述文獻(xiàn)均以其全文并入?yún)⒖?。Cole等和Boerder等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole et al，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss，(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95，(1991))。
利用不能表達(dá)功能性的內(nèi)源性免疫球蛋白但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠也可以生產(chǎn)人抗體。例如，可以將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合體隨機(jī)地導(dǎo)入或通過同源重組導(dǎo)入到小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)?；蛘撸巳酥劓満洼p鏈基因以外，還可以將人可變區(qū)、恒定區(qū)、和多變區(qū)導(dǎo)入到小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)。通過同源重組引入人免疫球蛋白基因座可以使得小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因分別或同時變成無功能。特別地，JH區(qū)的純合缺失阻止了內(nèi)源性抗體產(chǎn)生。擴(kuò)增經(jīng)修飾的胚胎干細(xì)胞，并將其顯微注射到胚泡內(nèi)以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后對所述嵌合小鼠進(jìn)行育種以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。所述轉(zhuǎn)基因小鼠用所選擇的抗原例如本發(fā)明的多肽的全部或一部分以正常的方式免疫。通過傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)可以從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中得到針對所述抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)所含有的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間進(jìn)行重排，并在此之后進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變(somatic mutation)。因此，利用這個技術(shù)生產(chǎn)治療有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體是有可能的。對于該生產(chǎn)人抗體的技術(shù)的綜述，參見Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。對于該生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)以及生產(chǎn)這些抗體的方案的詳細(xì)討論參見例如PCT文獻(xiàn)WO 98/24893、WO 92/01047、WO96/34096、WO 96/33735、歐洲專利No.0598877、美國專利NO.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771、和5,939,598，這些文獻(xiàn)在此以其全文并入本文作參考。另外，利用與上述相似的技術(shù)，公司例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(San Jose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)可以被委托提供針對所選擇的抗原的人抗體。
也可以通過對移植了人外周血白細(xì)胞、脾細(xì)胞或骨髓的小鼠進(jìn)行免疫而制備人MAb(例如XTL的三元雜交瘤技術(shù)(Triomatechniques))。可以利用被稱作為“引導(dǎo)選擇(guided selection)”的技術(shù)產(chǎn)生識別選定表位的完整的人抗體。在這個方法中，用所選擇的非人的單克隆抗體例如小鼠抗體引導(dǎo)對識別相同表位的完整的人抗體的選擇(Jespers et al.，Bio/technology 12899-903(1988))。
另外，接下來利用本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)可以用針對本發(fā)明的多肽的抗體產(chǎn)生“模擬”本發(fā)明的多肽的抗獨(dú)特型抗體(見，例如，Greenspan & Bona，F(xiàn)ASEB J.7(5)437-444；(1989)and Nissinoff，J.Immunol.147(8)2429-2438(1991))。例如，可以用結(jié)合并競爭性抑制多肽多聚化和/或本發(fā)明的多肽與配體結(jié)合的抗體產(chǎn)生“模擬”多肽多聚化和/或結(jié)合區(qū)并因此結(jié)合及中和多肽和/或其配體的抗獨(dú)特型抗體。在治療方案中，可以用這些中和抗獨(dú)特型抗體或這些抗獨(dú)特型抗體的Fab片段中和多肽配體。例如，可以用這些抗獨(dú)特型抗體結(jié)合本發(fā)明的多肽和/或結(jié)合其配體/受體，并因此阻斷其生物學(xué)活性。
本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體是單克隆抗體，優(yōu)選地是人或人源化的單克隆抗體，它們具有針對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。在本發(fā)明中，其中一種結(jié)合特異性可以針對IL13，另一種可以針對任何其它抗原，優(yōu)選地針對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒來源的蛋白質(zhì)、病毒編碼的包膜蛋白、細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)、或細(xì)菌表面蛋白質(zhì)等等。
用于制備雙特異性抗體的方法是熟知的。傳統(tǒng)上，對雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)進(jìn)行的，其中兩種重鏈具有不同的特異性(Milstein and Cuello，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合，這些雜交瘤(四元雜交瘤(quadromas))產(chǎn)生十種不同抗體分子的可能的混和物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。常常用親和層析步驟完成對所述正確分子的純化。在1993年5月13日公開的WO93/08829以及在Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中公開了相似的方法。
具有所希望的結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))可以與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。所述融合優(yōu)選與包括至少絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)進(jìn)行。它可以具有第一重鏈恒定區(qū)(CH1)，所述第一重鏈恒定區(qū)含有在至少一種融合體中存在的輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及免疫球蛋白輕鏈(如果希望)的DNA插入到獨(dú)立的表達(dá)載體內(nèi)，并將其共轉(zhuǎn)化到合適的宿主生物體內(nèi)。對于產(chǎn)生雙特異性抗體的更詳細(xì)的描述參見例如Suresh et al.，Meth.In Enzym.，121210(1986)。
本發(fā)明還包括異源綴合抗體(heteroconjugate antibody)。異源綴合抗體由兩種共價連接的抗體構(gòu)成。這些抗體已經(jīng)例如被提議將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向于不需要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)。利用在合成蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中的已知方法可以在體外制備抗體，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，利用二硫鍵交換反應(yīng)或通過形成硫酯鍵都可以構(gòu)建出免疫毒素。用于此目的的合適試劑的實(shí)例包括亞氨基硫醇(iminothiolate)和甲基-4-mercaptobutyrimidate，和那些在例如美國專利No.4,676,980中所公開的試劑。
另外，可以產(chǎn)生IL13的單域抗體。WO9425591中已經(jīng)描述了關(guān)于來源于駱駝科(Camelidae)重鏈Ig的抗體這個技術(shù)的實(shí)例，以及US20030130496中描述了從噬菌體文庫中分離出單區(qū)完全人抗體。
抗IL13抗體的鑒定本發(fā)明提供了抑制并中和IL13作用的拮抗單克隆抗體。特別地，本發(fā)明的抗體與IL13結(jié)合并抑制IL13受體復(fù)合物的激活。本發(fā)明的抗體包括被命名為228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43的抗體，并公開了228B/C-1的人源化克隆。本發(fā)明也包括與單克隆抗體228B/C-1結(jié)合相同表位的抗體。
用酶聯(lián)免疫吸附測定(EILISA)、Western免疫印跡、或其它免疫化學(xué)技術(shù)測試候選的抗IL13抗體。用于鑒定單個抗體的檢測包括(1)抑制霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)細(xì)胞系HDLM-2和L-1236的IL13-自分泌增殖；(2)抑制IL13誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)的STAT6磷酸化；(3)抑制IL13誘導(dǎo)的對原代人單核細(xì)胞中的CD14表達(dá)的抑制；和(4)抑制IL13誘導(dǎo)的對原代人單核細(xì)胞上的CD23表達(dá)的上調(diào)。在實(shí)施例中描述了試驗的細(xì)節(jié)。
本發(fā)明的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單價抗體、雙特異性抗體、異源綴合抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、單域抗體、Fab片段、F(ab’)片段、Fab表達(dá)文庫所產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括例如針對本發(fā)明的抗體的抗Id抗體)、和上述任一抗體的表位結(jié)合片段。
抗體可以是本發(fā)明的結(jié)合人抗原的抗體片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)和包括VL或VH結(jié)構(gòu)域的單域抗體。包括單鏈抗體在內(nèi)的結(jié)合抗原的抗體片段可以包括單獨(dú)的可變區(qū)或與以下的全部或一部分組合的可變區(qū)絞鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也包括抗原結(jié)合片段，其包括可變區(qū)與絞鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任一組合。本發(fā)明的抗體可以來自任何動物來源包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，抗體來自于人、非人靈長類、嚙齒類(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。
本發(fā)明的抗體可以是單特異的、雙特異的、三特異的或具有更高的多特異性。多特異性抗體可以是特異于IL13的不同表位，或者可以是特異于IL13以及一種異源表位，所述異源表位例如異源多肽或固相支持材料。參見例如PCT文獻(xiàn)WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793、Tutt，et al.，J.Immunol.14760-69(1991)；美國專利NO.4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
可以根據(jù)抗體所識別的或特異結(jié)合的IL13的表位或一部分描述或說明本發(fā)明的抗體?？梢匀绫疚乃稣f明表位或多肽部分，例如通過N末端和C末端位置，通過連續(xù)氨基酸殘基的大小，或表和圖中所列出的進(jìn)行說明。
也可以根據(jù)抗體的交叉反應(yīng)性描述或說明本發(fā)明的抗體。本發(fā)明也包括與IL13多肽結(jié)合的抗體，所述IL13多肽與IL13具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％的相同性(如利用本領(lǐng)域已知的和本文所述方法所計算的)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人IL13的猴同源物以及其相應(yīng)表位交叉反應(yīng)。在一個特定實(shí)施方案中，上述交叉反應(yīng)性相關(guān)于任何單一特異抗原性或免疫原性多肽，或相關(guān)于本文所述特異抗原性和/或免疫原性多肽的組合。
本發(fā)明還包括與在嚴(yán)格雜交條件下與編碼IL13的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽結(jié)合的抗體。也可以根據(jù)抗體與本發(fā)明的多肽的結(jié)合親和力描述或說明本發(fā)明的抗體。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括那些具有從10-8到10-15M的平衡解離常數(shù)或KD的抗體。本發(fā)明也提供了根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何用于確定競爭性結(jié)合的方法例如本文所述的免疫測定法所確定的競爭性抑制抗體與本發(fā)明的表位結(jié)合的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體競爭性地抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％與表位的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步包括結(jié)合與本發(fā)明的抗IL13抗體所結(jié)合的相同的表位的抗體。為了確定一種抗體是否競爭性結(jié)合與本發(fā)明的抗IL13抗體(包括通過使用在ATCC保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體)結(jié)合的表位相同的表位，可以進(jìn)行一種交叉阻斷分析，例如競爭性ELISA分析。在一個競爭性ELISA實(shí)例中，將包被在微量滴定板的孔上的IL13與或不與候選的競爭抗體預(yù)先保溫，然后加入生物素標(biāo)記的本發(fā)明的抗IL13抗體。與孔中IL13抗原結(jié)合的標(biāo)記的抗IL13抗體的量使用抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物及合適的底物進(jìn)行測定。所述抗體可以用放射性或熒光標(biāo)記或者一些其它可檢測和可測定的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。與抗原結(jié)合的標(biāo)記的抗IL13抗體的量與候選的競爭抗體(測試抗體)競爭結(jié)合相同表位的能力間接相關(guān)，即測試抗體與相同表位的親和性越高，則越少的標(biāo)記抗體結(jié)合抗原包被的孔。如果與沒有候選的競爭抗體的平行進(jìn)行的對照實(shí)驗相比，候選抗體可以阻斷至少20％、優(yōu)選至少20-50％、更優(yōu)選至少50％的IL13抗體的結(jié)合，則認(rèn)為候選的競爭抗體是充分結(jié)合相同表位的抗體或者與本發(fā)明的抗IL13抗體競爭結(jié)合相同表位的抗體。應(yīng)理解可以進(jìn)行變化形式的這種分析以達(dá)到相同的數(shù)量值。
載體和宿主細(xì)胞在另一個方面，本發(fā)明提供了包括編碼本發(fā)明的抗體的核苷酸序列的載體構(gòu)建體以及包括這樣一種載體的宿主細(xì)胞?？梢杂眠M(jìn)行克隆和轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系。
利用熟知的技術(shù)可以制備含有編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體包括與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列可操縱地連接的核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列例如那些起源于哺乳動物、微生物、病毒、或昆蟲基因的序列。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱子、增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和/或其它控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。當(dāng)所述調(diào)節(jié)序列與合適的多肽的核苷酸序列功能性相關(guān)時，核苷酸序列是“可操縱地連接的”。因此，如果一個啟動子核苷酸序列控制合適的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，那么所述啟動子核苷酸序列就是可操縱地連接于例如抗體重鏈序列的。
另外，可以將編碼不與抗體重鏈和/或輕鏈序列天然相關(guān)的合適的信號肽的序列摻入到表達(dá)載體內(nèi)。例如，可以符合讀碼框地(in-frame)將信號肽(分泌前導(dǎo)肽)的核苷酸序列與多肽序列融合，使得抗體可以被分泌到胞質(zhì)外周空間或分泌到培養(yǎng)基中。在所希望的宿主細(xì)胞內(nèi)具有功能的信號肽增強(qiáng)合適的抗體的胞外分泌。在抗體從細(xì)胞中分泌之后，信號肽可以從多肽中被切割下。這些分泌信號的實(shí)例是熟知的并包括例如在US5698435、US5698417、和US6204023中所描述的那些分泌信號。
可用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括但不限于微生物，例如經(jīng)含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia))；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；經(jīng)重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)；煙草花葉病毒(TMV)感染的或經(jīng)含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶含有來源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3細(xì)胞)。
載體可以是質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、或單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。用熟知的將DNA和RNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)可以將這些載體作為多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。在噬菌體和病毒載體的情況下，也可以用熟知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)將載體作為包裝病毒或包囊化病毒導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。病毒載體可以是可復(fù)制的或有復(fù)制缺陷的。在后一情況中，通常只有在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞內(nèi)才會發(fā)生病毒繁殖。利用來源于本DNA構(gòu)建體的RNA，也可以采用無細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這些載體可以包括編碼抗體分子的恒定區(qū)的核苷酸序列(見，例如PCT文獻(xiàn)WO 86/05807、PCT文獻(xiàn)WO 89/01036、美國專利No.5,122,464)，并且可以將抗體的可變結(jié)構(gòu)域克隆到這樣的載體內(nèi)，用于表達(dá)整個重鏈或輕鏈。
在本發(fā)明中可用作宿主細(xì)胞的原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。在原核宿主細(xì)胞內(nèi)所用的表達(dá)載體通常包括一個或多個表型選擇標(biāo)記基因。例如，表型選擇標(biāo)記基因是編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因。用于原核宿主細(xì)胞的有用的表達(dá)載體的實(shí)例包括那些來源于可商購的質(zhì)粒的表達(dá)載體，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)、和pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)以及pRSET(InvitrogenCorporation，Carlsbad，California，USA)載體系列(Studier，F(xiàn).W.，J.Mol.Biol.21937(1991)；Schoepfer，R.Gene 12483(1993))。通常用于重組的原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體的啟動子序列包括T7(Rosenberg，et al.Gene56，125-135(1987))、β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang etal.，Nature 275615，(1978)；和Goeddel et al.，Nature 281544，(1979))、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel et al.，Nucl.Acids Res.84057，(1980))、和tac啟動子(Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2dEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.)。
在本發(fā)明中有用的酵母包括那些來自酵母屬、畢赤酵母屬、放線菌(Actinomycetes)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的酵母。酵母載體常常含有一個來自2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制序列起點(diǎn)、一個自主復(fù)制序列(ARS)、啟動子區(qū)、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和選擇標(biāo)記基因。酵母載體的合適啟動子序列包括但不限于金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或其它的糖酵解酶(Holland et al.，Biochem.174900，(1978))例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶的啟動子。在Fleer et al.，Gene，107285-195(1991)中還描述了用于酵母表達(dá)的其它合適的載體和啟動子。用于酵母和酵母轉(zhuǎn)化方案的其它合適的啟動子和載體在本領(lǐng)域是熟知的。酵母轉(zhuǎn)化方案是熟知的。在Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，751929(1978)中描述了一種這樣的方案。Hinnen方案在選擇培養(yǎng)基中選擇出Trp+轉(zhuǎn)化體。
也可以采用哺乳動物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組抗體，例如用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)。在一個昆蟲系統(tǒng)中，可以將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus，AcNPV)用作表達(dá)外源基因的載體。所述病毒生長在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞內(nèi)?？梢詫⒖贵w編碼序列單個地克隆到病毒的非必要區(qū)內(nèi)(例如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制之下。
可以將NS0或中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)用于在哺乳動物中表達(dá)本發(fā)明的抗體?？梢詮牟《净蚪M中切割下用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列。常用的啟動子序列和增強(qiáng)子序列來源于多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)、和人巨細(xì)胞病毒(CMV)?？梢杂脕碓从赟V40病毒基因組的DNA序列提供用于在哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)構(gòu)基因序列的其它遺傳元件，例如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動子、增強(qiáng)子、剪切和聚腺苷酸化位點(diǎn)。病毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，因為容易從病毒基因組中作為片段得到這兩種啟動子，所述片段也可以含有病毒的復(fù)制起點(diǎn)。用于哺乳動物宿主細(xì)胞的所例舉的表達(dá)載體是可商購的。
編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明還提供了包括編碼本發(fā)明的抗體和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明也包括在嚴(yán)格的或較低嚴(yán)格的條件下能與編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。
可以利用本領(lǐng)域任一已知的方法得到多核苷酸，并確定出多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知了抗體的核苷酸序列，就可以從化學(xué)合成的寡核苷酸裝配出編碼所述抗體的多核苷酸(例如如在Kutmeier et al.，BioTechniques 17242(1994)中所述那樣)。簡要地，所述裝配包括含有編碼所述抗體的序列的部分的重疊寡核苷酸的合成、這些寡核苷酸的退火和連接、以及接下來用PCR對所連接的寡核苷酸的擴(kuò)增。
或者，可以從來自合適來源的核酸中產(chǎn)生編碼抗體的多核苷酸。如果無法得到含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但已知所述抗體分子的序列，那么可以通過化學(xué)合成得到編碼所述免疫球蛋白的核酸，或利用與所述序列的3’和5’末端可雜交的合成引物從合適的來源(例如抗體cDNA文庫、或從表達(dá)所述抗體的任一組織或細(xì)胞例如所選擇的用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞中所產(chǎn)生的cDNA文庫，或從中所分離到的核酸，優(yōu)選聚A+RNA)通過PCR擴(kuò)增得到編碼所述免疫球蛋白的核酸，或通過利用特異于所述特定基因序列的寡核苷酸探針通過克隆得到編碼所述免疫球蛋白的核酸，以例如從cDNA文庫中鑒定出編碼所述抗體的cDNA克隆。然后可以利用本領(lǐng)域任一熟知的方法將PCR所產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體內(nèi)。
一旦確定了抗體的核苷酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列，就可以利用本領(lǐng)域熟知的處理核苷酸序列的方法例如重組DNA技術(shù)、定位誘變、PCR等處理抗體的核苷酸序列(參見例如Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel et al.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，以其全文并入本文作參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸取代、缺失、和/或插入。
在一個特定的實(shí)施方案中，可以用熟知的方法檢查重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以鑒定出CDR的序列，所述方法例如通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列比較以確定出序列的高變異性區(qū)域。利用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以將一個或多個CDR插入到構(gòu)架區(qū)內(nèi)，例如插入到人構(gòu)架區(qū)內(nèi)以人源化非人抗體，如上面所述。構(gòu)架區(qū)可以是天然發(fā)生的或共有的構(gòu)架區(qū)，以及優(yōu)選地是人構(gòu)架區(qū)(見例如，Chothia et al.，J.Mol.Biol.278457-479(1998)中的人構(gòu)架區(qū)的列表)。優(yōu)選地，通過構(gòu)架區(qū)和CDR的組合所產(chǎn)生的多核苷酸編碼與本發(fā)明的多肽特異結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，如上面所討論的，在構(gòu)架區(qū)內(nèi)可以進(jìn)行一個或多個氨基酸取代，以及優(yōu)選地所述氨基酸取代提高了抗體與其抗原的結(jié)合。另外，可以用這些方法對參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個或多個可變區(qū)半胱氨酸殘基進(jìn)行取代或刪除，以產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明包括對多核苷酸的其它改變，這也在本領(lǐng)域人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。
另外，可以使用為通過將具有合適抗原特異性的來自小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪切在一起而產(chǎn)生“嵌合抗體”所開發(fā)的技術(shù)(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984)；Takedaet al.，Nature 314452-454(1985))。如上面所述，嵌合抗體是一種不同的部分來源于不同的動物物種的分子，例如具有來源于小鼠MAb的可變區(qū)以及人免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合抗體，例如人源化抗體。
或者，可以調(diào)整所描述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No.4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature334544-54(1989))以適于生產(chǎn)單鏈抗體。單鏈抗體通過經(jīng)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段以得到一條單鏈多肽而形成。也可以使用在大腸桿菌中裝配功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra et al.，Science2421038-1041(1988))。
生產(chǎn)抗IL13抗體的方法用本領(lǐng)域已知的用于合成抗體的任一方法，特別是通過化學(xué)合成或優(yōu)選地通過重組表達(dá)技術(shù)可以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的抗體或其片段、衍生物或類似物(例如本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈或本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)要求構(gòu)建含有編碼所述抗體或抗體片段的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦已經(jīng)得到了編碼抗體分子的多核苷酸，就可以用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生用于產(chǎn)生抗體的載體。構(gòu)建含有抗體編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。
利用傳統(tǒng)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后用傳統(tǒng)技術(shù)培養(yǎng)所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。如下面所詳細(xì)描述的，在本發(fā)明的一個方面，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)編碼重鏈和輕鏈的載體，以便表達(dá)整個免疫球蛋白分子。
如上所述，可以利用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這樣的宿主表達(dá)系統(tǒng)不僅代表通過其可以產(chǎn)生并隨后純化感興趣的編碼序列的載體(vehicles)，也代表當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后可以原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子的細(xì)胞。通常用細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌和真核細(xì)胞表達(dá)重組抗體分子，特別是表達(dá)完整重組抗體分子。例如，與載體例如來自人巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件相結(jié)合的哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是抗體的有效的表達(dá)系統(tǒng)(Foecking et al.，Gene 45101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 82(1990))。
另外，可以選擇宿主細(xì)胞株，其調(diào)控所插入序列的表達(dá)，或以所希望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。這些對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有針對蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的特征性的和特定的機(jī)制?？梢赃x擇出合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證對所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的正確的修飾和加工。為此，可以使用具有對基因產(chǎn)物的初級轉(zhuǎn)錄、糖基化、和磷酸化的正確加工的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這些哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤細(xì)胞。
為了長期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以對穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系進(jìn)行工程化?？梢杂檬芎线m的表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，而不是用含有病毒的復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體。在導(dǎo)入外源DNA之后，可以使工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1到2天，然后將其轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予了對選擇的抗性，使得細(xì)胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到其染色體內(nèi)并生長形成灶(foci)，接下來這可以被克隆并擴(kuò)增成為細(xì)胞系。這種方法可以有利地用于對表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系進(jìn)行工程化。這些工程化的細(xì)胞系可以被特別用于篩選和評價與所述抗體分子直接或間接相互作用的化合物。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，其包括但不限于可以在tk、hgprt或aprt-細(xì)胞內(nèi)分別采用的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigier et al.，Cell 11223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202(1992))、和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.，Cell 22817(1980))基因。也可以基于抗代謝物抗性對下列基因進(jìn)行選擇產(chǎn)生對甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci..USA 77357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；產(chǎn)生對霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))；產(chǎn)生對氨基糖苷G-418的抗性的neo(Wu and Wu，Biotherapy 387-95(1991))；和產(chǎn)生對潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.，Gene 30147(1984))?？梢猿Ｒ?guī)地采用在重組DNA技術(shù)領(lǐng)域通常已知的方法選擇所希望的重組克隆，例如在Ausubel et al.(eds)，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和in chapter 12 and 13，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley& Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.1501(1981)中描述了這些技術(shù)，這些文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。
通過載體擴(kuò)增可以增加抗體分子的表達(dá)水平(綜述參見Bebbington and Hentschel，“The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells”(DNA cloning，Vol.3.Academic Press，New York，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的標(biāo)記時，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中所存在的抑制劑水平的增加將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因為擴(kuò)增區(qū)與抗體基因相關(guān)，因此抗體的產(chǎn)生也會增加(Crouse et al.，Mol.Cell Biol.3257(1983))。
可以用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一種載體編碼重鏈來源的多肽，而第二種載體編碼輕鏈來源的多肽。兩種載體都可以含有相同的能使得重鏈和輕鏈多肽等量表達(dá)的選擇標(biāo)記?；蛘?，可以使用編碼并能表達(dá)重鏈以及輕鏈多肽的單個載體。在這種情況中，輕鏈應(yīng)當(dāng)置于重鏈的前面，以避免有毒的游離重鏈的過量產(chǎn)生(Proudfoot，Nature 32252(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。
一旦已經(jīng)用動物、化學(xué)合成或重組表達(dá)產(chǎn)生了本發(fā)明的抗體分子，可以用本領(lǐng)域已知的任一用于純化免疫球蛋白分子的方法進(jìn)行純化，例如通過層析(例如，離子交換層析、親和層析特別是通過在蛋白A之后的與特異抗原的親和力進(jìn)行的層析，以及體積排阻層析)、離心、差異溶解度、或任何其它的用于純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，還可以將本發(fā)明的抗體或其片段與本文所述或本領(lǐng)域已知的異源多肽序列融合，以促進(jìn)純化。
本發(fā)明包括與多肽重組融合的或化學(xué)綴合的(包括共價和非共價綴合的)抗體?？梢杂帽景l(fā)明的融合或綴合抗體使得純化更為簡便。參見例如Harbor等(見上)和PCT文獻(xiàn)WO 93/21232、EP 439,095、Naramura et al.，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美國專利No.5,474,981；Gillies et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.891428-1432(1992)；Fell et al.，J.Immunol.1462446-2452(1991)，以其全文并入本文作參考。
此外，本發(fā)明的抗體或其片段可以與標(biāo)記物序列例如肽融合以促進(jìn)純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如在pQE載體中所提供的標(biāo)簽(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)等等，其中許多都是可商購的。例如在Gentzet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)中所述，六組氨酸提供了對融合蛋白的便利純化。其它對純化有用的肽標(biāo)簽包括但不限于“HA”標(biāo)簽，它對應(yīng)于來源于流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson etal.，Cell 37767(1984))以及“flag”標(biāo)簽。
抗IL13抗體的診斷應(yīng)用本發(fā)明的抗體包括被修飾的衍生物，即通過任何類型的分子與所述抗體的共價連接而進(jìn)行的修飾，所述共價連接并不干擾抗體與IL13的結(jié)合。例如，抗體衍生物包括那些已經(jīng)被例如生物素、HRP、或任何其它的可檢測組分修飾的衍生物，但這并非是限定。
本發(fā)明的抗體可以被用于例如但不限于檢測癌癥患者的IL13水平，包括在體外和在體內(nèi)的診斷方法中。例如所述抗體可應(yīng)用于定性或定量測定生物學(xué)樣品中的IL13水平的免疫測定中。參見例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988)(以其全文并入本文作參考)。
如在下面更為詳細(xì)討論的，可以單獨(dú)地或聯(lián)合其它的組合物一起使用本發(fā)明的抗體。所述抗體還可以在N或C末端與異源多肽重組融合，或與多肽或其它組合物化學(xué)綴合(包括共價的或非共價的綴合)。例如，本發(fā)明的抗體可以與在檢測測定中用作標(biāo)記的分子重組融合或綴合。
本發(fā)明還包括與診斷劑綴合的抗體或其片段。所述抗體可以作為臨床測試方法的一部分被診斷性地用于例如監(jiān)測癌癥的發(fā)生或進(jìn)展，以例如確定給定治療方案的效力。通過將抗體偶聯(lián)到可檢測物質(zhì)可以促進(jìn)檢測?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、利用各種正電子發(fā)射斷層掃描的正電子發(fā)射金屬、以及非放射性的順磁性金屬離子。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可檢測物質(zhì)可以直接地與抗體(或其片段)偶聯(lián)或綴合，或經(jīng)中間物(例如本領(lǐng)域已知的接頭)間接地偶聯(lián)或綴合。參見例如關(guān)于金屬離子的美國專利No.4,741,900，其中所述金屬離子可以與抗體綴合，用作本發(fā)明的診斷劑。合適的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、dichlorotriazinylamine熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素、和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗體也可以被附著到固相支持物，這對于靶抗原的免疫測定或純化是特別有用的。這些固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。
與IL13特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體及其衍生物和類似物都可被用于診斷目的，以檢測、診斷、或監(jiān)測與IL13的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、病癥、和/或病態(tài)。本發(fā)明提供了對IL13異常表達(dá)的檢測，其包括(a)用一種或多種特異于IL13的本發(fā)明的抗體檢測個體的細(xì)胞或體液中的IL13的表達(dá)，和(b)比較基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)水平，與標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平比較所檢測到的IL13表達(dá)水平的增高或降低是異常表達(dá)的提示。
本發(fā)明提供了一種用于診斷病癥的診斷檢測，包括(a)用一種或多種特異于IL13的本發(fā)明的抗體檢測個體的細(xì)胞或體液中的IL13的表達(dá)；和(b)比較基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)水平，與標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平比較，所檢測到的基因表達(dá)水平的增高或降低是特定疾病的提示。
可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法用本發(fā)明的抗體檢測生物樣品中的蛋白質(zhì)水平(參見例如Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。其它用于檢測蛋白質(zhì)基因表達(dá)的基于抗體的方法包括免疫測定例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。合適的抗體測定標(biāo)記在本領(lǐng)域是已知的，并包括酶標(biāo)記例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)、和锝(99Tc)；發(fā)光標(biāo)記例如魯米諾；熒光標(biāo)記例如熒光素和羅丹明；以及生物素。
本發(fā)明的一個方面是對與動物(優(yōu)選地是哺乳動物，以及最優(yōu)選地是人)中的IL13的異常表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的檢測和診斷。在一個實(shí)施方案中，診斷包括a)給對象施用(例如腸胃外、皮下、或腹腔內(nèi))有效量的與IL13特異結(jié)合的被標(biāo)記的分子；b)在給藥后等待一段時間間隔，以使得被標(biāo)記的分子優(yōu)先地積聚在對象體內(nèi)的表達(dá)多肽的位置上(并使得未結(jié)合的標(biāo)記分子被清除到背景水平)；c)確定背景水平；和d)檢測對象體內(nèi)的被標(biāo)記的分子，這樣檢測到超過背景水平的被標(biāo)記的分子提示對象患有與IL13的異常表達(dá)相關(guān)的特定疾病或病癥?？梢杂酶鞣N方法確定出背景水平，包括將所檢測到的被標(biāo)記的分子的量與預(yù)先確定好的某一特定系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
本領(lǐng)域人員知道對象的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷性圖像所需的成像組分的量。就放射性同位素組分而言，對于人體對象，所注射的放射性的量的范圍通常從約5毫居里到20毫居里的99Tc。然后被標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)先地積聚在含有特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞的部位。在S.W.Burchiel et al.，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.”Chapter 13 in TumorImagingThe Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)中描述了體內(nèi)成像。
依據(jù)一些變量包括所用標(biāo)記物的類型以及給藥模式，在給藥后使得被標(biāo)記的分子優(yōu)先地在對象體內(nèi)的位置上積聚和使得未結(jié)合的被標(biāo)記的分子被清除到背景水平的時間間隔是6到48小時或6到24個小時或6到12小時。在另一實(shí)施方案中，給藥后的時間間隔是5到20天或5到10天。
在一個實(shí)施方案中，通過重復(fù)用于診斷疾病或病癥的方法進(jìn)行對疾病或病癥的監(jiān)視，例如在初次診斷后1個月重復(fù)，在初次診斷后6個月重復(fù)，在初次診斷后1年重復(fù)等。
利用本領(lǐng)域已知的用于體內(nèi)掃描的方法可以檢測患者體內(nèi)的被標(biāo)記的分子的存在。這些方法依賴于所用的標(biāo)記的類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定出用于檢測特定標(biāo)記的合適方法。在本發(fā)明的診斷方法中可以使用的方法和設(shè)備包括但不限于計算機(jī)斷層掃描(CT)、全身掃描例如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、核磁共振顯像(MRI)、和超聲波。
在一個特定的實(shí)施方案中，用放射性同位素標(biāo)記分子，并用放射應(yīng)答外科裝置檢測患者體內(nèi)的被標(biāo)記的分子(Thurston等的美國專利No.5,441,050)。在另一個實(shí)施方案中，用熒光化合物標(biāo)記分子并用熒光應(yīng)答掃描裝置檢測患者體內(nèi)的被標(biāo)記的分子。在另一個實(shí)施方案中，用正電子發(fā)射金屬標(biāo)記分子并用正電子發(fā)射斷層掃描檢測患者體內(nèi)的被標(biāo)記的分子。在另一個實(shí)施方案中，用順磁標(biāo)記物標(biāo)記分子并用核磁共振顯像(MRI)檢測患者體內(nèi)的被標(biāo)記的分子。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷患者發(fā)生由未受調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的表達(dá)所引起的疾病的易感性的方法。在某些患者細(xì)胞、組織或體液中的IL13的量的增加可能提示該患者對某些疾病易感。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括收集已知具有低或正常水平的IL13的對象的細(xì)胞、組織、或體液樣品；針對組織或體液分析組織中是否存在IL13；并根據(jù)組織或體液中的IL13表達(dá)水平預(yù)測患者對某些免疫疾病的易感性。在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括從患者中收集已知含有確定水平的IL13的細(xì)胞、組織、或體液樣品；分析組織或體液中的IL13的量；并根據(jù)與正常細(xì)胞、組織或體液中已建立的確定水平或測定水平比較時的IL13量的變化預(yù)測患者對某些疾病的易感性。IL13的確定水平可以是依據(jù)文獻(xiàn)數(shù)值的已知量或可以通過測定正常細(xì)胞、組織或體液中的量而事先確定。特別地，對某些組織或體液中的IL13水平的確定使得特異地和早期地檢測到患者體內(nèi)的免疫疾病，優(yōu)選地是在疾病發(fā)生之前。利用本方法可以診斷的免疫疾病包括但不限于本文所述的免疫疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織或體液是外周血、外周血白細(xì)胞、生物活檢組織例如肺或皮膚活檢、和組織。
抗IL13抗體的治療應(yīng)用單獨(dú)施用或聯(lián)合細(xì)胞毒性因子或細(xì)胞抑制因子一起施用的抗體(有或沒有與之綴合的治療組分)可以被用作為一種治療劑。本發(fā)明涉及基于抗體的治療，其包括給動物、哺乳動物、或人施用本發(fā)明的抗體，以治療IL13介導(dǎo)的疾病、病癥或病變。針對IL13的抗體對于抑制動物體內(nèi)的腫瘤或癌細(xì)胞增殖是有用的，所述動物包括但不限于牛、豬、馬、雞、貓、狗、非人靈長類等以及人。例如，通過施用治療可接受劑量的本發(fā)明的抗體、或本發(fā)明抗體的混合物、或聯(lián)合施用各種來源的其它抗體，可以減輕或消除所治療哺乳動物體內(nèi)的對癌癥或腫瘤。
本發(fā)明的治療化合物包括但不限于本發(fā)明的抗體(包括如本文所述其片段、類似物和衍生物)和編碼下面所述本發(fā)明的抗體(包括如本文所述其片段、類似物和衍生物以及抗獨(dú)特型抗體)的核酸。可以用本發(fā)明的抗體治療、抑制或預(yù)防與IL13的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、病癥、或病變，所述疾病、病癥或病變包括但不限于本文所述任何一種或多種疾病、病癥、或病變。對與IL13的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、病癥、或病變的治療和/或預(yù)防包括但不限于緩解與這些疾病、病癥、或病變相關(guān)的癥狀。可以以如本領(lǐng)域已知的或本文所述藥物學(xué)可接受的組合物提供本發(fā)明的抗體。
可以在多種疾病中治療性地應(yīng)用本發(fā)明的抗IL13抗體。本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療哺乳動物中IL13介導(dǎo)的疾病的方法。所述方法包括給所述哺乳動物施用疾病預(yù)防或治療量的抗IL13抗體?？笽L13抗體與IL13結(jié)合，并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和細(xì)胞受體的表達(dá)，產(chǎn)生表現(xiàn)為非疾病狀態(tài)的細(xì)胞因子水平。
可以用標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)確定出能有效地治療、抑制和預(yù)防與IL13的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或病癥的抗體的量?？梢园磁c疾病相一致的治療方案施用抗體，例如在一天到數(shù)天內(nèi)施用單次或數(shù)次劑量以緩解疾病狀態(tài)，或在一段延長的時間內(nèi)施用周期性的劑量以預(yù)防過敏或哮喘。另外，可以任選地采用體外測定以幫助鑒別出最佳的劑量范圍。在配制品中所采用的精確劑量也依賴于給藥途徑以及疾病或病癥的嚴(yán)重程度，并應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)生的判斷以及每個患者的情況做出決定。從來源于體外模型或動物模型測試系統(tǒng)的劑量效應(yīng)曲線可以外推出有效的劑量。
對于抗體，施用給患者的劑量通常是每kg患者體重0.1mg到100mg。優(yōu)選地，施用給患者的劑量是在每kg患者體重0.1mg和20mg之間，更優(yōu)選地是在每kg患者體重1mg到10mg之間。一般而言，人抗體在人體內(nèi)具有比其它物種的抗體更長的半衰期，這是由于人體對外源多肽的免疫應(yīng)答。因此，更低劑量的人抗體以及更少頻率的給藥常常是可能的。另外，通過修飾例如脂質(zhì)化增強(qiáng)抗體的攝取和組織通透性(例如進(jìn)入到腦部)可以減少本發(fā)明的抗體的給藥劑量和頻率。
可以聯(lián)合例如其它的單克隆或嵌合抗體、或淋巴因子或造血生長因子(例如IL-2、IL-3、IL-7、IFN、GCSF、GMCSF、Flt3、IL21)或含非甲基化CpG的寡肽有利地利用本發(fā)明的抗體，這些物質(zhì)可以增加與抗體相互作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目或活性。
可以單獨(dú)地或聯(lián)合其它類型的治療例如化療和放療施用本發(fā)明的抗體。
在一個優(yōu)選的方面，抗體是被充分純化的(例如，基本上沒有限制其作用或產(chǎn)生非所希望的副作用的物質(zhì))。
可以按任何可接受的形式給哺乳動物施用抗IL13抗體。導(dǎo)入的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服途徑。可以用任何便利的途徑施用抗體或組合物，例如通過輸注或推注，或通過經(jīng)上皮或皮膚粘膜內(nèi)層的吸收(例如口腔粘膜、直腸和腸道粘膜等)，以及可以與其它的生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能希望通過任何合適的途徑(包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射)將本發(fā)明的治療抗體或組合物導(dǎo)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)；通過腦室內(nèi)導(dǎo)管例如連接到儲存池如Ommaya囊的導(dǎo)管可以有助于腦室內(nèi)注射。
也可以采用肺部給藥，例如通過使用吸入器或霧化器以及霧化劑的劑型。也可以給患者的肺部施用干粉組合物形式的抗體(參見例如美國專利No.6,514,496)。
在一個特定的實(shí)施方案中，希望將本發(fā)明的治療性抗體或組合物局部地施用到所希望治療的部位；例如通過(并不限于此)局部輸注、局部應(yīng)用、通過注射、通過導(dǎo)管的方式、通過栓劑的方式、或通過植入物的方式可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，所述植入物是多孔的、非多孔的、或膠狀的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的抗體時，必須小心地使用蛋白質(zhì)所不吸附的材料。
在另一個實(shí)施方案中，可以在載體中送遞抗體，特別是在脂質(zhì)體中(見，Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat et al.，in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein andFidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez Berestein，ibid.，pp.317-327；see generally ibid.)。
在另一個實(shí)施方案中，可以用控釋系統(tǒng)送遞抗體。在一個實(shí)施方案中，可以使用泵(見，Langer，如上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88507(1980)；Saudek etal.，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一個實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(見，Medical Applications of Controlled Release，Langer andWise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)la.(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也見Levy et al.，Science 228190(1985)；During et al.，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard et al.，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一個實(shí)施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療靶點(diǎn)的附近。
本發(fā)明也提供了藥物組合物。這些組合物包括治療有效量的抗體，以及生理學(xué)可接受的載體。在一個特定的實(shí)施方案中，術(shù)語“生理學(xué)可接受的”意思是經(jīng)聯(lián)邦或州政府的審批機(jī)構(gòu)所認(rèn)證的或在美國藥典或其它普遍公認(rèn)的用于動物(以及更特別地用于人)的藥典中所羅列的。術(shù)語“載體”指的是與治療藥物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這些生理學(xué)載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用所述藥物組合物時，水是一種優(yōu)選的載體。也可以采用鹽溶液和葡萄糖和甘油水溶液作為液體載體，特別是作為可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果希望，所述組合物也可以含有少量的濕化劑或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放配制品等形式。用傳統(tǒng)的粘合劑和載體例如甘油三酯可以將所述組合物配制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體例如藥物純級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述了合適載體的實(shí)例。這些組合物含有有效量的抗體(優(yōu)選地是純化形式的抗體)以及合適量的載體，以便提供能適當(dāng)?shù)厥┯媒o患者的形式。劑型應(yīng)當(dāng)適應(yīng)于給藥的模式。
在一個實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制成為適用于靜脈內(nèi)施用給人體的藥物組合物。用于靜脈內(nèi)給藥的組合物通常是無菌等張的水性緩沖溶液。如果需要，組合物也可以含有增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因以減輕注射部位的疼痛。一般地，組分可以分別地或一起混和在單位劑量形式中提供，例如作為在標(biāo)明活性劑的量的熔封容器例如安瓿或密封袋(sachette)內(nèi)的凍干粉末或無水濃縮物提供。如果要通過輸注施用所述組合物，可以用含有無菌的藥物純級水或鹽水的輸液瓶配藥。如果要通過注射施用所述組合物，可以提供一安瓿的注射用無菌水或鹽水，使得可以在給藥之前混和組分。
本發(fā)明也提供了包括一個或多個裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種組分的容器的藥物包裝或試劑盒。與這些容器任選地伴隨的可以是以管理藥物或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的說明，這些說明反映了管理人體施用的藥物的生產(chǎn)、使用或銷售的機(jī)構(gòu)的認(rèn)證。
此外，本發(fā)明的抗體可以與各種效應(yīng)分子例如異源多肽、藥物、放射性核素、或毒素綴合。參見例如PCT文獻(xiàn)WO 92/08495、WO91/14438、WO89/12624、美國專利No.5,314,995、和EP 396,387?？贵w或其片段可以與治療組分綴合，所述治療組分例如細(xì)胞毒素如細(xì)胞生長抑制劑或殺細(xì)胞劑、治療劑或放射性金屬離子例如α粒子輻射劑例如213Bi。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括任何對細(xì)胞有害的物質(zhì)。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、dihydroxyanthracin dione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素(mithramycin)、更生霉素D(actinomycin D)、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和其類似物或同源物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如，氨甲蝶呤、6-硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、馬法蘭(melphalan)、卡氯芥(carmustine，BSNU)和環(huán)己亞硝脲(lomustine，CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、順二氯化二氨亞鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類抗生素(例如，柔紅霉素(daunorubicin，以前稱為daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前叫放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和蒽霉素(AMC))、和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。
用于將這些治療組分與抗體綴合的技術(shù)是熟知的，見例如Arnonet al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss Inc.1985)；Hellstrom et al.，“AntibodiesFor Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2ndEd.)，Robinson etal.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，inMonoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe etal.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.62119-58(1982)。或者，抗體可以與第二種抗體綴合以形成抗體異源綴合物。(見例如Segal的美國專利No.4,676,980)。
本發(fā)明的綴合物可以被用于修飾給定的生物應(yīng)答，治療劑或藥物組分不應(yīng)被解釋成限定為經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物組分可以是具有所希望的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可以包括例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白質(zhì)例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白纖溶酶激活劑；凋亡劑例如TNFα、TNFβ、AIM I(見國際文獻(xiàn)No.WO 97/33899)、AIM II(見，國際文獻(xiàn)No.WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi et al.，Int.immunol.，61567-1574(1994))、VEGI(見，國際文獻(xiàn)No.WO 99/23105)；血栓形成劑或抗血管生成劑例如血管抑素(angiostatin)或血管內(nèi)皮抑素(endostatin)；或生物應(yīng)答修飾劑例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它的生長因子。
實(shí)施例實(shí)施例1IL13免疫原(一種突變的、失活的人IL13/Fc(MT-IL13/Fc))的制備A.MT-IL13/Fc的表達(dá)質(zhì)粒的克隆和構(gòu)建據(jù)報道在第13位氨基酸殘基上具有突變(谷氨酸突變成賴氨酸)的人IL13能以相同的或更高的親和力與IL13Rα1結(jié)合，但其已經(jīng)喪失了激活具有IL13Rα1的細(xì)胞的能力(Thompson et al.，J.Biol.Chem.，27429944(1999))。在人胚胎腎細(xì)胞293-T內(nèi)表達(dá)該突變的、失活的IL13(稱為MT-IL13)。用純化的重組蛋白作為本發(fā)明的免疫原，以產(chǎn)生抗IL13單克隆抗體。合成了2種對應(yīng)于MT-IL13的寡核苷酸序列的寡核苷酸引物5′AAGCTTTCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCAT3′(SEQ ID NO 9)和5′CTCGAGGTTGAACCGTCCCTCGCGAAAAAG 3′(SEQ ID NO10)，并將其用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的模板，以從人睪丸cDNA文庫(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)中克隆IL13基因。將缺少預(yù)期的IL13的信號肽序列的PCR片段(342個堿基對)連接到pSecTag/FRT載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，所述pSecTag/FRT載體在其5’末端含有分泌信號肽序列以及在3’末端含有人Fcγ1(絞鏈區(qū)和恒定區(qū)CH2及CH3)序列。通過測序確認(rèn)該構(gòu)建體的組成。
B.從所轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生MT-IL13/Fc為了短暫表達(dá)MT-IL13/Fc，根據(jù)生產(chǎn)商說明書，用Lipofectamine2000(Invitrogen)將純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染后72個小時，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液用于純化。為了穩(wěn)定地表達(dá)MT-IL 13/Fc，用Flp-In 293T細(xì)胞系(Invitrogen)建立細(xì)胞系。為了確認(rèn)表達(dá)，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析培養(yǎng)物上清液。將所分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，并通過與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的小鼠抗人IgG(Fc)單克隆抗體(Sigma，St.Louis，MO)或多克隆的山羊抗IL13抗體(R & D Systems，Minneapolis，MN)的反應(yīng)進(jìn)行檢測，然后用HRP-驢抗山羊IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)對上述單克隆或多克隆抗體進(jìn)行檢測。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(Supersignal WestPicoChemiluminescent Substrate，Pierce，Rockford，IL)在膜上鑒別出免疫反應(yīng)性蛋白。
C.MT-IL13/Fc的純化用經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的hyper-D蛋白A親和柱(Invitrogen)純化MT-IL13/Fc。在往柱中加入細(xì)胞培養(yǎng)物上清液后，用超過20倍柱體積的PBS洗滌樹脂。然后，用SCC緩沖液(0.05M檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉，pH 6.0)洗滌樹脂，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后洗脫出IL13融合蛋白(0.05M檸檬酸鈉、0.15M氯化鈉，pH 3.0)，并在PBS中進(jìn)行透析。
用SDS-PAGE分析含有MT-IL13/Fc的得自親和柱的級分。用考馬斯藍(lán)染色分析蛋白的純度，以及如上所述用利用山羊抗人IgG(Fc)抗體(Sigma)和山羊抗人IL13抗體(R & D Systems)的Western免疫印跡法進(jìn)行蛋白的鑒定。
實(shí)施例2抗IL13單克隆抗體的產(chǎn)生給8-12周齡的雄性A/J小鼠(Harlan，Indianpolis，IN)皮下注射200μl含20μg MT-IL 13/Fc和弗氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)的PBS(pH 7.4)。在兩周的間隔內(nèi)，給小鼠皮下注射兩次處于弗氏不完全佐劑中的20μg MT-IL13/Fc。然后，在兩周后以及在處死前3天，再次給小鼠腹腔內(nèi)注射含有20μg同種免疫原的PBS。將從經(jīng)一種或多種抗原免疫的小鼠中所分離到的脾細(xì)胞用于融合。對于大腸桿菌表達(dá)的人IL13(R & D Systems)作為免疫原時，也使用相似的免疫接種和融合的方法。
在導(dǎo)致產(chǎn)生抗IL13 MAb 228B/C-1的融合中，組合來自兩種免疫小鼠的26.4×106個脾細(xì)胞和58.8×106個脾細(xì)胞。對于每種融合，從免疫小鼠的脾中制備出單細(xì)胞懸液，并將其用于與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。在含有50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，NY)和5％二甲基亞砜(Sigma)的培養(yǎng)基中，按1∶1的比例融合Sp2/0和脾細(xì)胞。然后在加有10％胎牛血清、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.1mM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、和16μM胸腺嘧啶的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，CA)中將細(xì)胞調(diào)整至濃度為每250μL懸浮液中1.5×105個脾細(xì)胞。往約50個96孔微量培養(yǎng)板的每個孔內(nèi)加入250微升細(xì)胞懸浮液。在約10天以后，取出培養(yǎng)物上清，用于在ELISA中篩選與MT-IL13/Fc的反應(yīng)性。
通過加入純化的MT-IL 13/Fc(0.1μg/mL)將Immulon 2(DynatechLaboratories，Chantilly，VA)微量測定板的孔在室溫下過夜包被。通過輕彈平板去除包被液之后，往每孔內(nèi)加入200μL封閉/稀釋緩沖液(含有2％小牛血清白蛋白和0.05％ TWEEN20的PBS)1個小時以封閉非特異性位點(diǎn)。在1小時之后，用PBST緩沖液(含有0.05％TWEEN20的PBS)洗滌孔。從每個融合孔內(nèi)收集50微升培養(yǎng)物上清液，并將其與50μL封閉/稀釋緩沖液混和，然后將其加入到微量測定板的單個孔內(nèi)。在溫育1個小時之后，用PBST洗滌孔。然后通過與HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Fc特異的)(Jackson ImmunoResearchLab，West Grove，PA)的反應(yīng)檢測所結(jié)合的鼠抗體，并用封閉/稀釋緩沖液按1∶2,000將其稀釋。往孔內(nèi)加入含有0.1％3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺(Sigma，St.Louis，MO)和0.003％過氧化氫(Sigma)的過氧化物酶底物溶液進(jìn)行顯色30分鐘。通過每孔加入50μL 2M H2SO4終止反應(yīng)。用BioTek ELISA讀數(shù)器(BioTek Instruments，Winooski，VM)測定反應(yīng)混和物的OD450值。
然后測定得自MT-IL13/Fc篩選陽性孔的培養(yǎng)物上清液與無關(guān)的Fγ1融合蛋白的陰性結(jié)合。然后通過有限稀釋選擇出單細(xì)胞克隆的最終陽性孔。用ELISA重新測定得自單克隆抗體的培養(yǎng)物上清液以確認(rèn)其活性。將所選擇的雜交瘤生長在錐形瓶內(nèi)，并收集用過的培養(yǎng)物上清液用于通過蛋白A親和層析進(jìn)行抗體純化。
用四種測試測試純化的抗體i)與293T細(xì)胞表達(dá)的MT-IL13/Fc以及大腸桿菌表達(dá)的小鼠IL13的交叉反應(yīng)性；ii)抑制HDLM-2和L-1236細(xì)胞的IL13自分泌性增殖；iii)抑制IL13誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中的STAT6磷酸化；和iv)抑制IL13調(diào)節(jié)的人單核細(xì)胞的CD14及CD23的表達(dá)。
從在MT-IL13/Fc和IL13免疫的小鼠中進(jìn)行的融合中得到了73種抗IL13MAb。純化了39種Mab用于通過ELISA和基于細(xì)胞的測試描述它們的特征。這39種MAb中有13種MAb抑制自分泌性IL13誘導(dǎo)的HDLM-2和L-1236細(xì)胞的增殖(見實(shí)施例5中的測試描述和結(jié)果)。ELISA中發(fā)現(xiàn)了4種MAb與人IL13有著強(qiáng)反應(yīng)，并且它們在基于功能性細(xì)胞的測試中中和人IL13。這些單克隆抗體被稱作228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43。所有的這些抗體都是利用糖基化MT-IL13/Fc作為免疫原產(chǎn)生的。
實(shí)施例3ELISA測定的抗IL13單克隆抗體與人及小鼠IL13的反應(yīng)性用ELISA測試各種抗IL13單克隆抗體的反應(yīng)性。通過添加100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液，96孔微量測定板的不同孔用大腸桿菌表達(dá)的非糖基化的人IL13(R & D Systems)、293T細(xì)胞表達(dá)的糖基化MT-IL13/Fc、或大腸桿菌表達(dá)的小鼠IL13(R & D Systems)包被。在室溫下過夜溫育之后，用PBSTB(含有2％BSA的PBST)處理孔以飽和剩余的結(jié)合位點(diǎn)。然后用PBST洗滌孔。
在室溫下往孔內(nèi)加入100微升2倍系列稀釋的抗IL13mAb(從0.5μg/mL(3.33nM)到0.05ng/mL(0.00033nM))1個小時。同時測定來自(BD Biosciences-Pharmingen，San Diego，CA)的抗IL13 mAb JES-5A2，并將其作為陽性對照。這種抗體是通過利用大腸桿菌表達(dá)的人IL13作為免疫原產(chǎn)生的。將同種型匹配的小鼠抗HIV-1 gp120 MAb作為無關(guān)的陰性對照。然后用PBST洗滌孔。通過與稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)在室溫下溫育1個小時檢測所結(jié)合的抗體。然后如上述的加入過氧化物酶底物溶液顯色。用ELISA讀數(shù)器測定OD450。
圖1顯示了ELISA測定的抗IL13mAb 228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和陰性對照的劑量依賴性結(jié)合。在這些mAb中，228B/C-1表現(xiàn)出最強(qiáng)的反應(yīng)性。圖2顯示了ELISA測定的抗IL13mAb與MT-IL13/Fc的劑量依賴性的結(jié)合。228B/C-1和228A-4表現(xiàn)出與MT-IL13/Fc最強(qiáng)的反應(yīng)性，而227-26和227-43表現(xiàn)出中等的反應(yīng)性。
圖1和2顯示228B/C-1在所有被測試的抗IL13mAb中具有與糖基化及非糖基化的人IL13最高的親和力。在ELISA測定中，所有這些抗IL13mAb與小鼠IL13都沒有交叉反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4JES10-5A2缺乏對228B/C-1-Hrp與人IL13結(jié)合的競爭為了研究JES10-5A2和228B/C-1是否與人IL13上的相同的表位結(jié)合，用競爭性ELISA檢查JES10-5A2對228B/C-1-HRP與大腸桿菌表達(dá)的人IL13結(jié)合的作用。96孔微量測定板中的每個孔都與100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液溫育。在室溫下過夜溫育之后，用PBSTB(含有2％BSA的PBS)處理孔以飽和剩余的結(jié)合位點(diǎn)。然后用PBST洗滌孔。將50微升2倍系列稀釋的228B/C-1和JES 10-5A2(終濃度從20μg/mL到9.76ng/mL)與50μL預(yù)先滴定的228B/C-1-HRP(1∶6,400稀釋)混和。然后將混和物加入到孔中，并在室溫下溫育1個小時。然后如上所述加入過氧化氫酶底物溶液顯色。用ELISA讀數(shù)器測定OD450。
圖3證實(shí)了JES10-5A2不競爭228B/C-1-HRP與人IL13的結(jié)合，說明228B/C-1和JES10-5A2與人IL13上的不同位點(diǎn)相結(jié)合。
實(shí)施例5通過利用L-1236和HDLM-2細(xì)胞的IL-13自分泌依賴性增殖測試篩選抗IL13的中和單克隆抗體L-1236和HDLM-2是從德國Collection of Microorganisms andCell Cultures(DSMZ，Braunschweig，Germany)得到的霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系。這些細(xì)胞系產(chǎn)生IL13，而IL13接下來以自分泌的方式激活它們的細(xì)胞增殖(Kapp U et al.，J.Exp.Med.1891939(1999))。在有或沒有不同的抗IL13mAb(0.2、0.02和0.002μg/mL)時，將細(xì)胞在5％CO2、37℃下培養(yǎng)(25,000個細(xì)胞/孔)3到5天。然后通過利用四唑鹽化合物MTS(Promega，Madison，WI)的測試(在OD490讀取)或通過摻入3H-胸腺嘧啶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)測定細(xì)胞增殖。
預(yù)計往這些細(xì)胞系的培養(yǎng)物中添加抗IL13中和mAb將通過結(jié)合并使這些細(xì)胞所產(chǎn)生的IL13失活而抑制細(xì)胞的增殖。圖4所示的結(jié)果顯示了本發(fā)明的抗IL13mAb對L-1235細(xì)胞增殖的作用。在所測試的中和抗體中，mAb 228B/C-1顯示出最高效力地以劑量依賴性方式抑制L-1236細(xì)胞增殖。而TA1-37(用大腸桿菌表達(dá)的人IL13作為免疫原所產(chǎn)生的抗IL13mAb)甚至在劑量高到0.2μg/mL也沒有任何的抑制活性。用HDLM-2細(xì)胞得到了相似的結(jié)果。
實(shí)施例6對原代人單核細(xì)胞上的IL13調(diào)節(jié)的CD14和CD23表達(dá)的測試IL13誘導(dǎo)對人單核細(xì)胞上的CD14表達(dá)的抑制以及對CD23表達(dá)的上調(diào)(de Waal Malefyt et al.，J.Immunol.，1516370(1993)；Chomaratet al.，Int.Rev.Immunol.，171(1998))。通過在Histopaque-1077(Sigma)中的密度梯度離心從新鮮收集的、肝素化的健康人供體的全血中分離出外周血白細(xì)胞(PBLs)。向含有重組IL13(終濃度10ng/mL＝0.813nM)和抗IL13單克隆抗體或無關(guān)抗體(三倍系列稀釋，始自終濃度12μg/mL＝80nM)的96孔組織培養(yǎng)板的每個孔內(nèi)都加入懸浮在加有5％小牛血清的RPMI-1640(Invitrogen)中的PBLs(1.5×106)。通過向溫育培養(yǎng)基中加入0.813nM人IL13分別抑制或上調(diào)了單核細(xì)胞上的CD14表達(dá)或CD23表達(dá)。對照培養(yǎng)基含有RPMI-1640/FBS培養(yǎng)基，但不含有重組IL13。
將細(xì)胞在5％CO2、37℃下溫育2天。收集細(xì)胞，用抗CD14-FITC或抗CD23-PE(BD Biosciences-Pharmingen)染色。用流式細(xì)胞術(shù)測定單核細(xì)胞群上的CD14和CD23的表達(dá)水平，并用中位熒光強(qiáng)度(Median Fluorescence Intensity，MFI)表示。
圖5描述了抗IL13mAb對受IL13抑制的人單核細(xì)胞上的CD14表達(dá)的作用。在所有測試的抗IL13mAb中，228B/C-1在抑制IL13對CD14表達(dá)的作用上具有最高的效力。在0.33nM濃度上，達(dá)到對IL13作用的完全抑制。mAb 227-26和228A-4的抑制活性是中等的，而JES10-5A2具有弱活性。甚至在80nM濃度上，JES10-5A2仍不能完全地抑制IL13的作用。
圖6描述了抗IL13MAb對IL13誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞上的CD23表達(dá)上調(diào)的作用。與CD14表達(dá)中的結(jié)果相似(圖5)，在所有測試的抗IL13MAb中，228B/C-1最強(qiáng)力地抑制IL13對CD23表達(dá)的作用。0.33nM濃度的228B/C-1達(dá)到完全抑制。JES10-5A2具有弱抑制效力。
根據(jù)圖5和6所示的結(jié)果，在摩爾化學(xué)計量比為1∶2(mAb∶IL13)時，228B/C-1可以實(shí)現(xiàn)對IL13的完全抑制，因此，228B/C-1是一種具有非常高親和力的抗人IL13的中和MAb。
實(shí)施例7IL13誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中的STAT6磷酸化的測試IL13能激活髓細(xì)胞系THP-1(ATCC，Manassas，VA)以誘導(dǎo)STAT6的磷酸化，這是IL13的信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵步驟(Murata T et al.，Int.Immunol.101103-1110(1998))。在這個測試中，測試了抗IL13MAb對IL13的抑制作用。
將THP-1細(xì)胞維持在加有5％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen)中。在試驗當(dāng)天，洗滌細(xì)胞并將其在無血清的DMEM中、37℃和5％CO2下溫育2個小時。然后向96孔圓底平板的每個孔內(nèi)都加入80μL含有0.3×106個細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，和120μL含有人IL13(終濃度為10ng/mL＝0.813nM)和抗IL13MAb(5倍系列稀釋液，始自終濃度0.5μg/mL＝3.333nM)。陰性對照孔不含有IL13或含有IL13以及同種型匹配的無關(guān)MAb。
將混和物在5％CO2、37℃下溫育10分鐘。然后將平板在4℃、300xg下離心3分鐘。在倒掉上清液之后，將細(xì)胞沉淀物重懸在100μLLaemmli非還原樣品緩沖液(SDS-PAGE上樣緩沖液，BioRad，CA)中，然后將其轉(zhuǎn)移到微量離心管內(nèi)。將所述離心管在95℃下加熱5分鐘，然后在室溫下10,000xg離心10分鐘。收集上清液，并用4-20％梯度SDS-PAGE分析。將所分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后將膜與稀釋的小鼠抗人Stat6(Y641，磷酸特異的)mAb(BD BiosciensesPharmingen)一起溫育。
用HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗體(Jackson ImmunoResearchLaboratories)檢測結(jié)合的抗體。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光測試(SupersignalWest Pico Chemiluminescent Substrate，Pierce)鑒定膜上的免疫反應(yīng)性蛋白。圖7描述了抗IL13MAb對IL13誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中的Stat6磷酸化的作用的結(jié)果。在經(jīng)0.813nM人IL13處理的THP-1細(xì)胞中，Stat6被磷酸化。當(dāng)用MAb 228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和JES10-5A2處理細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)了對Stat6磷酸化的劑量依賴性的抑制作用。在所測試的抗IL13mAb中，MAb 228B/C-1是作用最強(qiáng)的中和抗體。濃度為0.667nM和0.133nM之間的228B/C-1可以達(dá)到完全抑制。完全抑制時的228B/C-1和IL13之間的近似摩爾化學(xué)計量比是1∶2。這與圖5和6中所示的數(shù)據(jù)一致。
實(shí)施例8對編碼抗IL13單克隆抗體的重鏈和輕鏈基因的分子克隆用QIAGEN試劑盒(Valencia，CA)從雜交瘤細(xì)胞中分離出總RNA。如下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(第一鏈cDNA)反應(yīng)將1-1.5mg總RNA與1ml 10mM dNTPs、50ng隨機(jī)六聚物、以及無RNase的水混和，終體積為12mL。
將反應(yīng)混和物在65℃下溫育5分鐘，并立即將其放置于冰上1分鐘。在短暫離心之后，加入以下試劑4mL 5X第一鏈緩沖液(250mM Tris-HCl、pH 8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)、2mL 0.1mM DTT、和1mL RNaseOUT RNase抑制物(40U/mL)。在混和之后，將反應(yīng)物在室溫下溫育2分鐘。然后向混和物中加入1mL Superscript IIRT(50U/mL)，在25℃溫育10分鐘，隨后在42℃溫育50分鐘。在短暫離心之后，將反應(yīng)物在70℃溫育15分鐘以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。然后加入1μL RNaseH(2U/mL)，并將反應(yīng)物在37℃溫育20分鐘以破壞RNA。
為了擴(kuò)增重鏈和輕鏈的可變區(qū)，使用了O’Brien和Jones(O′BrienS.and Jones T.，″Humanizing antibodies by CDR grafting″，AntibodyEngineering，Springer Lab manual，Eds.Kontermann and Duble，S(2001))描述的方法。簡要而言，從信號肽區(qū)選擇5’引物(輕鏈有11組，重鏈有12組簡并引物)，從輕鏈或重鏈的恒定區(qū)內(nèi)選擇3’引物。將5’和3’引物(1.5mL 10mM)與5mL 10X PCR緩沖液(250mM Tris-HCI、pH 8.8，20mM MgSO4，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，1％TritonX-100，1mg/mL無核酸酶的BSA)、先前制備的1mL cDNA、1mL Turbopfu(Stratagene)混和，并用水將其終體積調(diào)整為50mL。如下進(jìn)行PCR1個循環(huán)的94℃下4分鐘；25個循環(huán)的94℃下30秒、53℃下30秒、和72℃下45秒；1個循環(huán)的72℃下7分鐘。用1％瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)混和物。
純化所擴(kuò)增的DNA片段，并將其克隆到pcDNA3.1載體內(nèi)。根據(jù)廠家所推薦的方案，利用Invitrogen TOPO克隆試劑盒進(jìn)行克隆。15到20個轉(zhuǎn)化大腸桿菌的克隆被用于質(zhì)粒純化。用T7引物對質(zhì)粒進(jìn)行測序。通過雜交誘變技術(shù)(Glaser S.et al.Antibody Engineering(Oxford University Press，New York(1995))，Near RI，BioTechniques 1288(1992))將重鏈和輕鏈的優(yōu)勢序列(predominant sequences)克隆到M13Fab表達(dá)載體內(nèi)。用ELISA確認(rèn)所表達(dá)的Fab的結(jié)合性質(zhì)。圖8描述了228B/C的VH和VL鏈的氨基酸序列。
實(shí)施例9表位定位抗IL-13MAb 228B/C-1與一個構(gòu)象表位結(jié)合，并以與人IL13結(jié)合相同的高親和力與cynomologous猴的IL13結(jié)合。但是，228B/C不與鼠IL13結(jié)合。因此，設(shè)計用于表位定位的策略是將猴IL13的小部分與相應(yīng)的小鼠IL13序列互換。合成重疊寡核苷酸。進(jìn)行兩輪PCR以裝配出IL13雜交構(gòu)建體，使得用來自小鼠IL13的相應(yīng)序列取代猴IL13的一部分序列。利用TOPO克隆試劑盒(Invitrogen)將最終的PCR擴(kuò)增的IL13編碼區(qū)符合讀框地克隆到具有V5標(biāo)簽的pcDNA3.1載體內(nèi)。通過測序確認(rèn)所有的PCR擴(kuò)增的區(qū)域都只含有所希望的結(jié)構(gòu)域交換突變(domain swapping mutation)，并且在表達(dá)載體中沒有其它的非所希望的突變。
抗IL13MAb結(jié)合表位被鑒定為從氨基酸#49到56的8肽ESLINVSG(SEQ ID NO 18)。這個表位位于人IL13的B螺旋和BC環(huán)中。當(dāng)來源于cyno-IL13的表位肽被用于交換鼠IL13中的相應(yīng)序列時，所形成的雜交IL13分子能與228B/C結(jié)合，其結(jié)合親和力與原始的cynoIL13的結(jié)合親和力相似，進(jìn)一步確認(rèn)了228B/C MAb在殘基#49-56之間的肽上與cyno或人IL13結(jié)合。人、cyno、和鼠IL13的序列比較顯示人IL13中只有三個殘基Ile52、Val54、Gly56不是保守的，提示這三個殘基中的一個或多個的組合決定了IL13和抗IL13MAb通過該8肽相互作用的關(guān)鍵殘基。
用肽點(diǎn)分析(peptide spot analysis)進(jìn)一步確認(rèn)該表位。用一系列經(jīng)SPOT在纖維素膜上合成的重疊的12肽掃描整個人IL13肽。唯一的抗IL13 MAb反應(yīng)性肽被鑒定為氨基酸#44-56的12肽，YCAALESLINVS(SEQ ID NO 19)，該序列與通過結(jié)構(gòu)域交換試驗中所鑒別的區(qū)域重疊。
實(shí)施例10抗-IL-13MAb的ADCC分析PBMC通過標(biāo)準(zhǔn)離心技術(shù)使用Ficoll-paque分離自新鮮肝素化的血樣(50ml淡黃色表層提供～300×106PBMC)。將PBMC用在RPMI1640/10％FCS中的IL-2(10U/ml)在37℃、5％CO2的條件下刺激24小時(20×106PBMC)。
24小時后，將HDLM-2或L-1236(霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系)靶細(xì)胞(2×106個細(xì)胞)通過與400uCi的51Cr(鉻酸鈉)在37℃保溫過夜而標(biāo)記。將51Cr標(biāo)記的細(xì)胞洗滌4次并再懸浮于RPM11640/5％FCS中。然后將標(biāo)記的細(xì)胞等份加入96孔U型底平板中(一式兩孔)。然后以不同的E∶T比率(例如80∶1、20∶1)加入IL-2刺激的PBMC。
將測試的抗IL13MAb系列稀釋并等份加入孔中，以便終MAb濃度在例如0、0.5、5、50μg/ml之間。在保溫后，將平板在900rpm離心3分鐘。從每個孔中收集上清，計數(shù)放射性的量。細(xì)胞裂解百分比根據(jù)如下等式計算％細(xì)胞裂解＝(Cpmtest-Cpmspont)/(Cpmmax-Cpmspont)×100％[額外的ADCC信息見例如L M.Weiner et at，Cancer Res.，482568-2573(1988)；P.Hersey et al，Cancer Res.，466083-6090(1988)；C.J.Hansik et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，837893-97(1986)所述]。
實(shí)施例11補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CMC)的分析腫瘤細(xì)胞(5×104于50μL的DMEM培養(yǎng)基中)、正常人血清(于50μL培養(yǎng)基中1∶1稀釋)及各種濃度的人源化抗IL13MAb(IgG1)(于100μL培養(yǎng)基中)可以在96孔平底平板中在37℃、5％CO2下保溫2小時。一種不相關(guān)的同種型匹配的抗體可用作陰性對照。加入細(xì)胞增殖試劑WST-1(15μL，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)并在37℃保溫5小時。生色反應(yīng)的光密度用ELISA平板讀數(shù)器在450nm讀數(shù)。CMC被抗IL13MAb的抑制百分比＝100×(ODs/a-ODs)/(ODns-ODs)，ODs/a是用血清和抗體處理孔的OD，ODs是用血清處理孔的OD，ODns是無血清和抗體處理孔的OD。
保藏下面的培養(yǎng)物已經(jīng)被保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas Va.20110-2209USA(ATCC))
本保藏是根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約及其細(xì)則(布達(dá)佩斯條約)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行的。這保證了從保藏之日起保持該活培養(yǎng)物30年。在布達(dá)佩斯協(xié)議的范圍下，通過ATCC可以獲得該生物體，這保證了在相關(guān)的美國專利授權(quán)之后，公眾可以永久地、不受限制地獲得該培養(yǎng)物的后代。
本申請的受讓人已經(jīng)同意如果當(dāng)在合適條件下培養(yǎng)的被保藏培養(yǎng)物死亡或丟失或被損害時，將在被通知后迅速地用相同培養(yǎng)物的活體樣品代替。保藏菌株的獲得并不作為在違反任何政府主管部門根據(jù)其專利法所賦予的權(quán)利下實(shí)施本發(fā)明的許可。
上面所寫的說明書據(jù)信足以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明并不受所保藏的培養(yǎng)物的范圍的限定，因為所保藏的實(shí)施方式只是用作舉例說明本發(fā)明的一個方面，任何功能上等價的培養(yǎng)物都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文材料的保藏不構(gòu)成對本文所含的所寫的描述不足以能實(shí)施本發(fā)明的任何方面(包括本發(fā)明的最佳模式)的承認(rèn)，它也不被用于將本權(quán)利要求書的范圍限定到本文所呈現(xiàn)的特定的舉例說明。事實(shí)上，通過上面的描述，對本發(fā)明的各種除了本文所示的和所述以外的修飾對于本領(lǐng)域人員將是顯而易見的，并且都在附錄的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
本領(lǐng)域人員將認(rèn)識到，或者能確信應(yīng)用不超出常規(guī)試驗范圍的、與本文所述特異的實(shí)施方式等價的多個等價物。下面的權(quán)利要求書包括這些等價物。
序列表<110>泰勒公司<120>用新的抗IL13單克隆抗體治療癌癥<130>TNX-1088<150>US60/532,130<151>2003-12-23<160>152<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>114<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu1 5 10 15Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly20 25 30Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala35 40 45Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr50 55 60Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln65 70 75 80Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe85 90 95Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg100 105 110Phe Asn<210>2<211>114<212>PRT
<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>2Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Xaa Leu Ile Glu1 5 10 15Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly20 25 30Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala35 40 45Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr50 55 60Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln65 70 75 80Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe85 90 95Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg100 105 110Phe Asn<210>3<211>113<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(113)<223>VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228B/C<400>3Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp65 70 75 80Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110Ala<210>4<211>118<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(118)<223>VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228B/C<400>4Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60
Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80Lys Met Ser Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly His Gly Thr100 105 110Ser Val Thr Val Ser Ser115<210>5<211>118<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(118)<223>VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228A-4<400>5Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr20 25 30Asn Ile Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser115<210>6<211>118<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(118)<223>VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228A-4<400>6Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr20 25 30Asn Ile Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Ser Val Thr Val Ser Ser115<210>7<211>114<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(114)<223>VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(114)<223>VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26-1<400>7Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg Ala<210>8<211>120<212>PRT<213>Murinae gen.sp.
<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(120)<223>VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26-1<400>8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Leu Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly His Ile Ala Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Glu Met Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Asp Ile Phe Leu Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120<210>9<211>50<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Forward oligonucleotide primer for a mutant IL13 sequence<400>9aagctttccc caggccctgt gcctccctct acagccctca ggaagctcat50<210>10<211>30<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Reverse Oligo nucleotide primer of a mutant IL13 sequence<400>10ctcgaggttg aaccgtccct cgcgaaaaag 30<210>11
<211>22<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Forward degenerate oligonucleotide primer for monkey IL13<400>11gyyctrggcy ycatggcgct yt 22<210>12<211>25<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Reverse degenerate oligonucleotide primer for monkey IL13<400>12tttcagttga accgtccyty gcgaa 25<210>13<211>399<212>DNA<213>Macaca fascicularis<400>13atggcgctct tgttgaccat ggtcattgct ctcacttgcc tcggcggctt tgcctcccca60agccctgtgc ctccctctac agccctcaag gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120cagaaccaga aggccccgct ctgcaatggc agcatggtgt ggagcatcaa cctgacagct 180ggcgtgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240aagacccaga ggatgctgaa cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300agcttgcgtg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctcgta 360catttaaaga aactttttcg caatggacgg ttcaactga 399<210>14<211>34<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Forward oligonucleotide primer for cynomologus monkey IL13<400>14aagcttcacc atggcgctct tgttgaccat ggtc34<210>15
<211>40<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Reverse oligonucleotide primer for cynomologus monkey IL13<400>15tcacaagatc tgggctcctc gaggttgaac cgtccattgc 40<210>16<211>23<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Forward oligonucleotide primer for Fc gammal<400>16ctcgaggagc ccagatcttg tga23<210>17<211>35<212>DNA<213>ARTIFICIAL<220>
<223>Reverse oligonucleotide primer for Fc gamma 1<400>17gctctagagc ctcatttacc cggagacagg gagag 35<210>18<211>8<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>EPITOPE BINDING SITE<400>18Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly1 5<210>19<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>EPITOPE BINDING SITE
<400>19Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser1 5 10<210>20<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 228B/C-1<400>20Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys20<210>21<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 TEMPLATE HT2<400>21Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>22<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT B<400>22Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20<210>23<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT J<400>23Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>24<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT L<400>24Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>25<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT HT-NEW #300<400>25Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20
<210>26<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT HT2-DP27 #29<400>26Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>27<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT HT2-DP27 #53<400>27Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>28<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRLl VARIANT HT2-DP27 #66<400>28Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys20<210>29<211>15<212>PRT
<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL2 228B/C<400>29Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>30<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 288 B/C<400>30Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys20 25 30<210>31<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 HT2<400>31Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>32<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT B<400>32
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr CyS20 25 30<210>33<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT J<400>33Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>34<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT L<400>34Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>35<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT N<400>35Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15
Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>36<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT P<400>36Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>37<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT R<400>37Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>38<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #1<400>38Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30
<210>39<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #9<400>39Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>40<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #14<400>40Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>41<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 HT2-NEW #21<400>41Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>42
<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #67<400>42Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>43<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #74<400>43Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>44<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #78<400>44Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>45<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #322<400>45Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>46<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-NEW #162<400>46Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>47<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #7<400>47Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>48<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #57
<400>48Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>49<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #73<400>49Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>50<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #92<400>50Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Thr Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>51<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #118<400>51
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>52<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #123<400>52Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>53<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #83<400>53Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Asp Pro Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>54<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #135<400>54Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>55<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #273<400>55Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>56<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT HT2-DP27 #301<400>56Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>57<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL4 228 B/C<400>57Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala1 5 10<210>58<211>11
<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL4 HT2<400>58Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg1 5 10<210>59<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL4 VARIANT B<400>59Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10<210>60<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 228 B/C<400>60Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn20 25 30<210>61<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 DP27<400>61Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser20 25 30<210>62<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 NEW<400>62Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser20 25 30<210>63<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 VARIANT HT2-NEW #73<400>63Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser20 25 30<210>64<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 HT2-DP27 #7<400>64Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn20 25 30
<210>65<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 VARIANT HT2-DP27 #40<400>65Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser20 25 30<210>66<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 VARIANT HT2-DP27 #268<400>66Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn20 25 30<210>67<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 228 B/C<400>67Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly1 5 10<210>68<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>FRH2 DP27<400>68Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala1 5 10<210>69<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 NEW<400>69Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly1 5 10<210>70<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT 1<400>70Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly1 5 10<210>71<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT 3<400>71Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly1 5 10<210>72<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT HT2-DP27 #7<400>72Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly1 5 10<210>73<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT HT2-DP27 #43<400>73Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala1 5 10<210>74<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT HT2-DP27 #50<400>74Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala1 5 10<210>75<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT HT2-DP27 #100<400>75Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala1 5 10<210>76<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 228 B/C
<400>76Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys1 5 10 15Met Ser Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>77<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 DP27<400>77Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>78<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 NEW<400>78Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg1 5 10 15Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>79<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 1<400>79
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>80<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 3<400>80Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>81<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 4<400>81Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>82<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 HT2-NEW #1<400>82Arg Leu Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Arg1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>83<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-NEW #9<400>83Arg Leu Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Arg1 5 10 15Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>84<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-NEW #14<400>84Arg Val Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg1 5 10 15Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>85<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #26<400>85Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30
<210>86<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #275<400>86Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>87<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #301<400>87Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>88<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #580<400>88Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>89
<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #345<400>89Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>90<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT HT2-DP27 #634<400>90Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr1 5 10 15Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly20 25 30<210>91<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH4 228B/C<400>91Trp Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>92<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH4 DP27
<400>92Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>93<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL5<400>93Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>94<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN OF CL5<400>94Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>95<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-13<400>95Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>96<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN OF CL-13<400>96Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Lys20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ser Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>97<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-50<400>97Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>98<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN OF CL-50<400>98Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Lys20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>99<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L1 228B/C<400>99Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His1 5 10 15<210>100<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L1 VARIANT 1<400>100Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Gln Ser Phe Met His1 5 10 15<210>101<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L1 VARIANT 2<400>101Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Gln Ser Phe Leu His
1 5 10 15<210>102<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L1 VARIANT 3<400>102Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Met His1 5 10 15<210>103<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L1 VARIANT 4<400>103Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Leu His1 5 10 15<210>104<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 228B/C<400>104Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5<210>105<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 1<400>105Leu Ala Ser Asn Leu Asn Ser1 5
<210>106<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 2<400>106Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser1 5<210>107<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 3<400>107Leu Ala Thr Asn Leu Glu Ser1 5<210>108<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 4<400>108Leu Ala Ser Asn Leu Lys Ser1 5<210>109<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 5<400>109Leu Ala Ser Asn Leu Glu Lys1 5
<210>110<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 6<400>110Leu Ala Ser Arg Leu Glu Ser1 5<210>111<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 7<400>111Leu Ala Ser Asn Leu His Ser1 5<210>112<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 8<400>112Leu Ala Ser Asn Leu Ser Ser1 5<210>113<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 9<400>113Leu Ala Ser Phe Leu Glu Ser1 5
<210>114<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L2 VARIANT 10<400>114Leu Ala Asn Asn Leu Glu Ser1 5<210>115<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L3 228B/C<400>115Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Arg Thr1 5<210>116<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-L3 VARIANT 1<400>116Gln Gln Asn Ala Glu Asp Pro Arg Thr1 5<210>117<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 228B/C<400>117Ala Tyr Ser Val Asn1 5<210>118
<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 VARIANT 1<400>118Ala Lys Ser Val Asn1 5<210>119<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 VARIANT 2<400>119Ala Asn Ser Val Asn1 5<210>120<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 VARIANT 3<400>120Gly Tyr Ser Val Asn1 5<210>121<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 VARIANT 4<400>121Ala His Ser Val Asn1 5<210>122<211>5
<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H1 VARIANT 5<400>122Ala Arg Ser Val Asn1 5<210>123<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 228B/C<400>123Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>124<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 1<400>124Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Ser Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>125<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 2<400>125Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Glu Ser1 5 10 15<210>126<211>16<212>PRT
<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 3<400>126Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>127<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 4<400>127Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser1 5 10 15<210>128<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 5<400>128Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Val Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>129<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 6<400>129Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Glu Leu Lys Ser1 5 10 15<210>130<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 7<400>130Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>131<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 8<400>131Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Glu1 5 10 15<210>132<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 9<400>132Met Val Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>133<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 10<400>133Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Ala Ser1 5 10 15<210>134<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>CDR-H2 VARIANT 11<400>134Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Lys Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser1 5 10 15<210>135<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 228B/C<400>135Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn1 5 10<210>136<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 1<400>136Asp Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn1 5 10<210>137<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 2<400>137Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn1 5 10<210>138<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 3<400>138Asp Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn1 5 10<210>139<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 4<400>139Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ser Asn1 5 10<210>140<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 5<400>140Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ala Asn1 5 10<210>141<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDR-H3 VARIANT 6<400>141Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Leu Asp Asn1 5 10<210>142<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-89
<400>142Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>143<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN CL-276G<400>143Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>144<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN OF RL-36<400>144Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>145<211>118<212>PRT
<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL-36<400>145Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>146<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL-19<400>146Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ser Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30
Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>147<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL-11<400>147Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>148<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL-8<400>148Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>149<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL-45<400>149Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Thr Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>150<211>112<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE LIGHT CHAIN RL-36-L1，59<400>150Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr20 25 30Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn85 90 95Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>151<211>118<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>VARIABLE HEAVY CHAIN RL36-L1，59<400>151Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210>152<211>248<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>SINGLE CHAIN FV<400>152Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr20 25 30Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu65 70 75 80Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro130 135 140Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg145 150 155 160Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr165 170 175Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser
180 185 190Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly195 200 205Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala210 215 220Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly225 230 235 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg24權(quán)利要求
1.一種治療表達(dá)和/或結(jié)合IL13的腫瘤的方法，包括給予有效量的抗IL13抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或片段特異性并高親和性地結(jié)合糖基化和非糖基化的人IL13，并且以約1∶2(MAb∶IL13)的摩爾比率中和人IL13活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是由稱為PTA-5657的雜交瘤產(chǎn)生的228B/C。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體與權(quán)利要求2的抗體結(jié)合相同的表位。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是由稱為PTA-5656的雜交瘤產(chǎn)生的228A-4，由稱為PTA-5654的雜交瘤產(chǎn)生的227-26，或者是由稱為PTA-5655的雜交瘤產(chǎn)生的227-43。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體通過吸入、全身性、推注、或者持續(xù)灌注而給予。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人抗體、嵌合抗體、單域抗體或者人源化抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是一種片段如Fv、Fab和F(ab′)2片段，單鏈抗體如scFv，及各種鏈組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是單域抗體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包含一種生理學(xué)可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤疾病選自霍奇金淋巴瘤、皮膚癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、頭頸部癌癥、腎細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、AIDS-相關(guān)的Kaposi′s癌、及腦癌。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性而介導(dǎo)殺傷。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體包含至少一個可變輕鏈區(qū)，所述可變輕鏈區(qū)包含式為FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中FRL1由SEQ ID NO20-25中的任一個序列組成；CDRL1由SEQ ID NO99-103中的任一個序列組成；FRL2由SEQ ID NO29組成；CDRL2由SEQ ID NO104-114中的任一個序列組成；FRL3由SEQ ID NO30-56中的任一個序列組成；CDRL3由SEQ ID NO115-116中的任一個序列組成；FRL4由SEQ ID NO57-59中的任一個序列組成。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體包含至少一個可變輕鏈區(qū)，所述可變輕鏈區(qū)包含SEQ ID NO3、5、7、93、95、97、142、144和150中任一個氨基酸序列。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述可變輕鏈區(qū)進(jìn)一步包含一個恒定區(qū)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述可變輕鏈區(qū)進(jìn)一步包含一個恒定區(qū)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體包含至少一個可變重鏈區(qū)，所述可變重鏈區(qū)包含式為FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中FRH1由SEQ ID NO60-66中的任一個序列組成；CDRH1由SEQID NO117-122中的任一個序列組成；FRH2由SEQ ID NO67-75中的任一個序列組成；CDRH2由SEQ ID NO123-134中的任一個序列組成；FRH3由SEQ ID NO76-90中的任一個序列組成；CDRH3由SEQ ID NO135-141中的任一個序列組成；FRH4由SEQ IDNO91-92中的任一個序列組成。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體包含至少一個可變重鏈區(qū)，所述可變重鏈區(qū)包含SEQ ID NO4、6、8、94、96、98、143、145、146、147、148和149中的任一個序列。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述可變重鏈區(qū)進(jìn)一步包含一個恒定區(qū)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述恒定區(qū)來自IgG抗體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述IgG抗體是IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或者IgG4抗體。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包含權(quán)利要求16的重鏈。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包含權(quán)利要求17的重鏈。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體包含具有SEQ ID NO142所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和具有SEQ ID NO143所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
24.權(quán)利要求22的抗體，其中所述抗體包含具有SEQ ID NO150所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和具有SEQ ID NO151所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是具有SEQ ID NO152所示序列的單鏈抗體。
26.一種治療霍奇金病的方法，包括給予需要這種治療的患者有效量的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體特異性并高親和性地結(jié)合糖基化和非糖基化的人IL13，且以約1∶2(mAb∶IL13)的摩爾比率中和人IL13的活性。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗體是228B/C，并由稱為PTA-5657的雜交瘤產(chǎn)生。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是288B/C的嵌合抗體或人源化抗體。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體與一種細(xì)胞毒性劑聯(lián)合。
31.權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是放射性同位素或者化療劑。
32.一種抑制哺乳動物中腫瘤細(xì)胞的IL-13依賴性增殖的方法，包括給予有效量的抑制IL-13的生物學(xué)活性的抗體或其結(jié)合片段的步驟，其中所述抗體或其片段特異性并高親和性地結(jié)合糖基化和非糖基化的人IL13，且以約1∶2(MAb∶IL13)摩爾比率中和人IL13的活性。
33.一種診斷過表達(dá)IL13的癌癥或腫瘤的方法，包括使用權(quán)利要求2-4或者12-25任一項的抗IL13抗體檢測取自懷疑患有所述癌癥或腫瘤的患者的生物學(xué)樣品中IL13的過表達(dá)情況。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL13依賴性腫瘤疾病的治療，包括給予新的抗IL13抗體。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的抗體檢測患者體內(nèi)的IL13過表達(dá)而診斷這類腫瘤或癌癥。
文檔編號G01N33/53GK1898264SQ200480038820
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者馮錫忠, 馬修·莫伊爾 申請人:泰勒公司