專利名稱：Dna－蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)用的試劑盒，適用于各種環(huán)境或化學(xué)因素引起的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA protein crosslinks，DPC)在正常的細(xì)胞中有一定的本底水平，也是細(xì)胞正常生長(zhǎng)所必須的，但在環(huán)境污染物或化學(xué)致癌物的作用下可形成超量的DPC，而超量的DPC是一種病理狀態(tài)是DNA分子的嚴(yán)重遺傳損傷，并且修復(fù)比較困難。在DNA的復(fù)制過(guò)程中容易造成某些重要基因的丟失。因此，DPC作為遺傳毒性的生物標(biāo)志物有非常重要的價(jià)值。
國(guó)內(nèi)外多年來(lái)一直致力于研究有效的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)檢測(cè)方法，現(xiàn)有的方法中有的檢測(cè)靈敏性較低；有的檢測(cè)靈敏度較高但只能間接檢測(cè)而不能對(duì)其精確定量；有的方法造成的測(cè)量誤差較大；有的需要昂貴的設(shè)備、特異性的抗體以及樣品的處理非常復(fù)雜。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的KCl-SDS沉淀法在檢測(cè)DPC時(shí)具有簡(jiǎn)便有效的特點(diǎn)，但需要稱量和配制的試劑較多而使用非常不方便，且會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)人員及儀器的準(zhǔn)確性等原因產(chǎn)生較大的系統(tǒng)誤差。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)可用于DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的任務(wù)是在KCl-SDS沉淀法的基礎(chǔ)上加以修飾，并提供一套預(yù)先由生產(chǎn)廠家稱量配制和分裝好，臨用時(shí)只需簡(jiǎn)單操作即能使用的試劑盒。因而可以有效的克服上述缺點(diǎn)，提供靈敏、簡(jiǎn)便、不需要昂貴的試劑和設(shè)備的DPC檢測(cè)方法，并且樣品處理簡(jiǎn)單不受DNA-DNA交聯(lián)和DNA鏈斷裂等其他DNA損傷的影響，可廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境化學(xué)因素所致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測(cè)。
本實(shí)用新型所采用的技術(shù)方案是裂解待測(cè)細(xì)胞樣品，獲取長(zhǎng)度統(tǒng)一的DNA片段。通過(guò)十二烷基硫酸鈉與蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)合，沉淀DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物從而將游離的DNA分離出來(lái)，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質(zhì)使DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物中結(jié)合態(tài)DNA游離出來(lái)，并用熒光法測(cè)定結(jié)合態(tài)DNA的含量以及游離DNA的含量，進(jìn)而得到DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度。
本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)為一種DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒，包括盒體、盒蓋和固定板，盒體內(nèi)置放著試劑瓶1、2、3、4、5、6、7和8，八個(gè)試劑瓶由固定板分隔固定，每個(gè)試劑瓶上有說(shuō)明標(biāo)簽，試劑瓶?jī)?nèi)封閉包裝著固定重量比配和準(zhǔn)確稱量的試劑，試劑瓶1中裝有小牛胸腺DNA，試劑瓶2中裝有十二烷基硫酸鈉，試劑瓶3中裝有Tris-HCl和KCl配制的pH為7.5的溶液，試劑瓶4中裝有蛋白酶K，試劑瓶5中裝有熒光染料Hoechst33258，試劑瓶6中裝有NaH2PO4和Na2HPO4，試劑瓶7中裝有KCl和Na2EDTA及Tris-HCl，試劑瓶8中裝有Tris-HCl，試劑瓶5為棕色玻璃瓶。試劑瓶1、2、3、4、6、7和8為玻璃瓶或白塑料瓶本DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒的盒體和盒蓋用硬紙或簿塑料板制作，固定板用硬紙或塑料泡末板制作。
使用本實(shí)用新型時(shí)，操作者按照試劑盒說(shuō)明書配制好試劑，并按照給定的操作步驟進(jìn)行使用，就可以檢測(cè)各類細(xì)胞樣品DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。本實(shí)用新型簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作中的很多繁雜步驟，能節(jié)約實(shí)驗(yàn)者的時(shí)間，較好地滿足實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)單化和提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。


圖1DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)圖圖中序號(hào)表示1、2、3、4、5、6、7和8為試劑瓶，9為固定板，10為盒體、11為盒蓋具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型的構(gòu)成與使用方法，做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成試劑瓶1白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量準(zhǔn)確稱量的小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)品，其凈重為1mg，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。此為試劑I。
試劑瓶2白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)裝按固定重量準(zhǔn)確稱量的十二烷基硫酸鈉，50T凈重為0.6g，100T凈重1.2g，臨用前用雙蒸水加熱溶解，配成濃度為2％的溶液，用于裂解細(xì)胞。此為試劑II。
試劑瓶3白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量和配比配成的Tris-HCl-KCl溶液，其中Tris-HCl濃度為20mmol/L，KCl的濃度為1.0mol/L，試劑的pH為7.5，溶液的體積50T為6mL，100T為12mL。此為試劑III。
試劑瓶4白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量準(zhǔn)確稱量的蛋白酶K，試劑的凈重量50T為12mg，100T為24mg，臨用前用清洗緩沖液配制成濃度為0.4mg/mL的溶液，用于分離交聯(lián)的DNA。此為試劑IV。
試劑瓶5棕色玻璃瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量準(zhǔn)確稱量的熒光染料Hoechst33258，試劑的凈重量為1mg，臨用前用染料稀釋液配成濃度為400ng/mL的染色液。此為試劑V。
試劑瓶6白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量和配比準(zhǔn)確稱量的NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合試劑，試劑的凈重50T為1.9548g，100T為3.9102g，臨用前用雙蒸水溶解配制重懸緩沖液，其中兩種試劑的濃度均為0.2mol/L。此為試劑VI。
試劑瓶7白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量和配比準(zhǔn)確稱量的KCl和Na2EDTA及Tris-HCl混合試劑，試劑的凈重量50T為2.2109g，100T為3.7256g，臨用前用雙蒸水溶解配制清洗緩沖液，其中KCl濃度為0.1mol/L，EDTA濃度為0.1mmol/L，Tris-HCl濃度為20mmol/L，pH為7.5。此為試劑VII。
試劑瓶8白色塑料瓶，瓶?jī)?nèi)封閉包裝按固定重量準(zhǔn)確稱量的Tris-HCl試劑，用來(lái)配制染料稀釋液，試劑的凈重量50T為0.394g，100T為0.788g，臨用前用雙蒸水配制成濃度為20mmol/L的溶液，pH為7.5。此為試劑VIII。
上述八個(gè)試劑瓶一同放入一個(gè)由硬紙材料制成的長(zhǎng)方形盒子10中，并用帶有圓孔的泡末板9固定各試劑瓶，然后用盒蓋11蓋好加封。
檢測(cè)試劑盒的使用方法一、試劑的配制1.從冰箱中取出試劑I，用清洗緩沖液配制終濃度分別為0ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，300ng/mL，400ng/mL 500ng/mL，750ng/mL，1000ng/mL，2000ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL的DNA標(biāo)準(zhǔn)液。在DNA標(biāo)準(zhǔn)液的配制時(shí)，先將1mg的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶于2mL的清洗緩沖液中配成母液然后再取少量做梯度稀釋至所需濃度。
2.試劑II加入雙蒸水加熱溶解。中其50T加30mL雙蒸水；100T加60mL雙蒸水。
3.臨用前從冰箱中取出試劑IV，加入清洗緩沖液溶解，并放入4℃恒溫箱中備用。其中50T加30mL緩沖液；100T加，60mL緩沖液。
4.臨用前從冰箱中取出試劑V，加入稀釋液2.5mL溶解，再稀釋1000倍，并放入4℃恒溫箱中備用。其中50T取120μL用稀釋液稀釋至120mL；100T取240μL用稀釋液稀釋至240mL。
5.從冰箱中取出試劑VI，用雙蒸水溶解配制成所需體積。
6.從冰箱中取出試劑VII，將其50T溶解于200mL雙蒸水；100T的溶于350mL雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值至7.5，并放入4℃恒溫箱中備用。
7.從冰箱中取出試劑VIII用雙蒸水配制成所需體積，調(diào)節(jié)pH至7.5，放入4℃恒溫箱中備用。
檢測(cè)步驟1.取配制好的DNA標(biāo)準(zhǔn)液1mL，加入1mL新鮮配制試劑IV，置于暗處30分鐘，熒光分光光度計(jì)350nm和450nm，掃描各濃度標(biāo)準(zhǔn)液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.將染毒好的細(xì)胞在6000r/min的條件下離心3分鐘收集細(xì)胞，去掉上清液。
3.接著向每支離心管中加入0.5mL重懸緩沖液(試劑VI)重懸浮細(xì)胞，再分別加入0.5mL試劑II溶液并輕微振蕩。然后將混合液65℃水浴加熱10分鐘。
4.從水浴中取出加入0.1mL試劑III，將混合液六次穿過(guò)1mL的聚丙烯槍頭，在冰上冷凍樣品5分鐘后沉淀形成，然后10000r/min 4℃離心5分鐘收集沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入一5mL離心管a中。
5.加入1mL的清洗緩沖液(試劑VII)重懸浮沉淀(重懸時(shí)，先將樣品放入50℃-65℃的熱水中加熱約1分鐘至白色沉淀溶解，再將樣品旋渦混勻)，于65℃水浴加熱10分鐘，冰上驟冷5分鐘，然后按步驟3離心，清洗2次，每次離心的上清液均轉(zhuǎn)入上述離心管a中(其中包括游離的DNA)混勻后取出1mL于離心管b。
6.最終的沉淀重懸浮于0.5mL的試劑VII清洗緩沖液中，然后加入試劑IV0.5mL，于50℃水浴3小時(shí)，從水浴中取出冰上驟冷5分鐘，在12000r/min和4℃條件下離心10分鐘，收集上清液，其中包括DPC中的DNA，轉(zhuǎn)入5mL離心管c中。
7.緊接著向離心管b和c中加入1mL新鮮配制的試劑V，置于暗處30分鐘。染色后的樣品用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm。
8.將測(cè)定樣品的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出相應(yīng)的DNA濃度。
9.計(jì)算交聯(lián)系數(shù)％＝離心管c中DNA濃度/(離心管b中DNA濃度×3+離心管c中DNA濃度)×100％。
權(quán)利要求1.一種DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒，包括盒體(10)、盒蓋(11)和固定板(9)，其特征是盒體內(nèi)置放著試劑瓶(1、2、3、4、5、6、7和8)，八個(gè)試劑瓶由固定板(9)分隔固定，每個(gè)試劑瓶上有說(shuō)明標(biāo)簽，試劑瓶?jī)?nèi)密封包裝著固定重量配比和準(zhǔn)確稱量的試劑，試劑瓶(1)中裝有小牛胸腺DNA，試劑瓶(2)中裝有十二烷基硫酸鈉，試劑瓶(3)中裝有Tris-HCl和KCl配制的pH為7.5的溶液，試劑瓶(4)中裝有蛋白酶K，試劑瓶(5)中裝有熒光染料Hoechst33258，試劑瓶(6)中裝有NaH2PO4和Na2HPO4，試劑瓶(7)中裝有KCl和Na2EDTA及Tris-HCl，試劑瓶(8)中裝有Tris-HCl，試劑瓶(5)為棕色玻璃瓶，試劑瓶(1、2、3、4、6、7和8)為玻璃瓶或白塑料瓶。
2.按權(quán)利要求1所述的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒，其特征是盒體(10)和盒蓋(11)用硬紙或簿塑料板制成，固定板(9)用硬紙或塑料泡末板制成。
專利摘要本實(shí)用新型是一套適于定量檢測(cè)DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)的試劑盒。它以KCl－SDS沉淀法為原理，制備出一種可簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)各類細(xì)胞樣品DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)水平的試劑盒。該試劑盒是一套由8瓶試劑共同配套使用的DPC定量檢測(cè)試劑盒，8瓶試劑中試劑II為液體，其余為固體；每個(gè)試劑瓶中裝有固定重量和特定配比的試劑；這8瓶試劑一起裝入一個(gè)由硬紙等材料制成的適當(dāng)大小的長(zhǎng)方形盒子10中，并用帶有一定大小和秩序的圓孔的泡末板9來(lái)固定各試劑瓶。其使用不需要昂貴的設(shè)備，樣品處理簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境化學(xué)因素所致DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK2750319SQ20042011138
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者劉英帥, 魯志松, 楊旭 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)