專利名稱：肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法及采樣試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)用于肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作及分析方法，特別是以半乳糖單點(diǎn)法(GSP)、半乳糖排除能力法(GEC)以及其它半乳糖法檢驗(yàn)肝功能時(shí)，血液檢測(cè)樣品的制作及分析方法。
背景技術(shù)：
半乳糖單點(diǎn)法(Galactose Single Point Method，GSP)是用于評(píng)估肝病患者的殘余肝功能(residual liver function)的方法，該方法可測(cè)定肝功能以及檢驗(yàn)特殊代謝缺失對(duì)于新藥品藥效學(xué)的影響。
常規(guī)的半乳糖單點(diǎn)法為靜脈注射0.5g/kg的半乳糖，并于60分鐘后，測(cè)量血漿中的半乳糖濃度(Tang H.S.et al.(1992)Digestion，52222-231；Ranek L.etal.(1983)Clin.Physiol.3173-178)。其測(cè)量的方式是根據(jù)不同半乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其吸光值的關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時(shí)將抽取的血液添加HClO4振蕩混合，離心取上清液，于上清液中加入KOH振蕩混合后再離心取上清液，上清液中再加入半乳糖去氫酶(galactose dehydrogenase)，為避免顏色反應(yīng)不準(zhǔn)確而置于暗室60分鐘以制作血液檢測(cè)樣品，測(cè)定其吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線找出其濃度值。
上述方法中，每個(gè)血液檢測(cè)樣品均以分階段添加藥劑的方式制作，且每加一次藥劑都需經(jīng)振蕩、混合、離心的過程，再加上置于暗室60分鐘的避光操作，其缺點(diǎn)為1)制作過程繁復(fù)耗時(shí)，使用的藥劑種類及用量較多；2)無法于較短時(shí)間制作及分析大量的血液檢測(cè)樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法及采樣試紙，利用簡(jiǎn)易的程序，使用較少的藥劑種類及用量，大量制作血液檢測(cè)樣品并縮短其制作時(shí)間。
本發(fā)明所提供的肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法，包括如下步驟步驟一，提供一種半乳糖組合物；步驟二，注射適量該半乳糖組合物進(jìn)入受測(cè)者體內(nèi)；步驟三，經(jīng)一段間隔時(shí)間，抽取受測(cè)者血液，滴加適量于特定采樣試紙上陰干；步驟四，將采樣試紙上的陰干血液溶出，制成血液檢測(cè)樣品。
其中，步驟一所述半乳糖組合物包含有1wt％至50wt％半乳糖粉末，緩沖液及抗氧化劑；其pH值為4.0至9.0；其中，所述抗氧化劑為亞硫酸氫鈉，所述緩沖液選自下列任一種或一種以上的緩沖液檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、碳酸緩沖液及三乙醇胺緩沖液。
上述半乳糖組合物中，所述半乳糖含量為總量的4wt％至40wt％。所述緩沖液添加量為總量的0.001wt％至5wt％。所述抗氧化劑添加含量為總量的0.001wt％至5wt％。
步驟二所述半乳糖組合物注射量為每人每公斤體重注入0.5g。
步驟三所述受測(cè)者血液滴加量?jī)?yōu)選為50～200微升，更優(yōu)選為100微升。
步驟三所述滴加受測(cè)者血液時(shí)需一次滴加完畢，不可于陰干后再重復(fù)滴加。步驟三所述間隔時(shí)間為60分鐘。
步驟四所述溶出過程的溶出液包含檢測(cè)試劑、酶制劑及呈色劑。其中，所述檢測(cè)試劑為三氯乙酸。所述酶制劑包含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)輔酶溶液和半乳糖去氫酶溶液。所述酶制劑包含體積百分比為75％的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)輔酶溶液、體積百分比為1.25％的半乳糖去氫酶溶液和體積百分比23.75％的稀釋液。
本發(fā)明所提供的肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的采樣試紙，是由紙漿制作的特定濾紙，所述紙張厚度達(dá)0.4mm以上，應(yīng)用于上述的肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法中，用以制作肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品。
本發(fā)明方法與現(xiàn)有的常規(guī)方法相比，具備下列特性及優(yōu)點(diǎn)分析及測(cè)定過程簡(jiǎn)易，所使用的藥劑種類及用量均較少；可于短時(shí)間內(nèi)制作及測(cè)量大量的血液檢測(cè)樣品。


圖1為本發(fā)明的流程圖；圖2為滴加不同體積全血的干血點(diǎn)，其半乳糖濃度分析圖；圖3為重復(fù)滴加血液對(duì)干血點(diǎn)半乳糖濃度的分析圖；圖4為干血點(diǎn)的穩(wěn)定性分析圖；圖5為半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6為本發(fā)明方法與半乳糖單點(diǎn)法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性圖。
其中，圖1中數(shù)字代表步驟1制備半乳糖組合物2實(shí)施靜脈注射3 60分鐘后抽血4滴于濾紙上并陰干形成干血點(diǎn)5添加三氯乙酸
6添加酶溶液7添加呈色劑8完成血液檢體之制作具體實(shí)施方式
(一)血液檢測(cè)樣品的制備本發(fā)明的血液檢測(cè)樣品的制作方法主要是運(yùn)用于檢驗(yàn)血液中半乳糖濃度，以之作為肝功能的指針。
如圖1所示的流程圖，首先配制半乳糖組合物(步驟1)，是將1wt％至50wt％(wt％在本發(fā)明中表示為g/100ml)，優(yōu)選為4wt％至40wt％的半乳糖粉末，與緩沖液及抗氧化劑混合后，調(diào)整pH值為4.0至9.0而成的；其中抗氧化劑占總量的0.001wt％至5wt％，可選用亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)；緩沖液占總量的0.001wt％至5wt％，可選自下列緩沖液中的任一種或一種以上檸檬酸緩沖液(citrate buffer)、磷酸緩沖液(phosphate buffer)、醋酸緩沖液(acetate buffer)、碳酸緩沖液(carbonate buffer)及三乙醇胺緩沖液(triethanolamine buffer)。接著注射(步驟2)該半乳糖組合物進(jìn)入受測(cè)者體內(nèi)；注射量可視狀況不同而調(diào)整適量，一般為每人每公斤體重須注射0.5g半乳糖，受測(cè)者需空腹八小時(shí)以上。注射約60分鐘后，取受測(cè)者血液(步驟3)數(shù)滴約0.5mL。
每個(gè)血液檢測(cè)樣品的制作是滴加100μL受測(cè)者血液于特定濾紙或GSP專用檢驗(yàn)試紙上，如圖2所示，滴加不同體積受測(cè)者血液于此專用濾紙上，其中滴加50μL及100μL樣品所測(cè)出的半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線兩者較相近，而滴加25μL樣品所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線誤差太大則無法使用；此外，由表1可看出不同材質(zhì)及厚度的濾紙，對(duì)干血點(diǎn)濃度分析的影響使用紙漿制作的濾紙，其干血點(diǎn)分布較其它材質(zhì)均勻，且紙張厚度須達(dá)0.4mm以上，所測(cè)出的半乳糖濃度的誤差百分比才會(huì)在±15％以內(nèi)。滴加血液時(shí)需一次滴加完畢，不可陰干后再重復(fù)滴加；如圖3所示，先滴加25μL受測(cè)者血液于特定濾紙上，陰干后再重復(fù)滴加一次，與一次滴加完畢相比，該干血點(diǎn)的半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，會(huì)隨分布位置不同而有誤差。
表1不同材質(zhì)的濾紙對(duì)干血點(diǎn)濃度分析的影響



滴加受測(cè)者血液于特定試紙后，陰干約2小時(shí)后形成干血點(diǎn)(步驟4)，將之裁下收于包裝袋中，保存于4℃下備用，可保存約2個(gè)月。由圖4可看出特定試紙上的干血點(diǎn)的穩(wěn)定性。為溶出試紙上的干血點(diǎn)，將之裁下置于具U形底的微盤(U bottom shapemicroplate)中，添加50μL的檢測(cè)試劑，例如3％(重量百分比)三氯乙酸(TCA)(步驟5)，以400rpm振蕩30分鐘后，取40μL置于平底盤中；再添加100μL酶溶液(步驟6)(working enzyme reagent)后，仍以400rpm振蕩30分鐘，最后添加100μL呈色劑(color reagent)(步驟7)制成血液檢測(cè)樣品(步驟8)。上述酶溶液可以75％(體積百分比)的輔酶溶液(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，stockcoenzyme reagent)、1.25％(體積百分比)的半乳糖去氫酶(D(+)Galactose Dehydrogenasesuspension)溶液及23.75％(體積百分比)的稀釋液(enzyme diluent)配制。
(二)半乳糖濃度的測(cè)定肝功能的檢驗(yàn)是以一微盤讀取器(microplate reader)，選擇在570nm吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定以上述方法制作的血液檢測(cè)樣品的吸光值，配合半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算得到半乳糖濃度。
如圖5所示，為一條半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別配制濃度為100、300、500、600、800、1000μg/ml的半乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其相對(duì)應(yīng)的吸光值，所繪制的半乳糖濃度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.9990以上。
另以已知濃度為100、200、450、900μg/ml半乳糖溶液作為質(zhì)控管，以測(cè)試操作人員的檢驗(yàn)技術(shù)，確保所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度。
(三)實(shí)施人體肝功能檢驗(yàn)選擇34位受測(cè)者實(shí)施人體肝功能檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法包含以上述方法制作的血液檢測(cè)樣品以及進(jìn)行血液檢測(cè)樣品中半乳糖濃度的測(cè)定，并與常規(guī)的半乳糖單點(diǎn)法檢驗(yàn)結(jié)果相比較。
表2顯示已知濃度的半乳糖溶液以常規(guī)的半乳糖單點(diǎn)法及本發(fā)明方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，常規(guī)半乳糖單點(diǎn)法的誤差范圍為0～14％，而本發(fā)明方法的誤差范圍為2～11％。
表2配制已知濃度檢測(cè)樣品以常規(guī)半乳糖單點(diǎn)法或本發(fā)明方法進(jìn)行分析比較


表3顯示以常規(guī)半乳糖單點(diǎn)法及本發(fā)明方法檢驗(yàn)受測(cè)者血液中半乳糖濃度，兩者的相關(guān)性如圖6所示，呈顯著正相關(guān)。
表3受試者血中半乳糖濃度以常規(guī)半乳糖單點(diǎn)法或本發(fā)明方法分析的比較

權(quán)利要求
1.一種肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法，包括如下步驟步驟一，提供一種半乳糖組合物；步驟二，注射適量該半乳糖組合物進(jìn)入受測(cè)者體內(nèi)；步驟三，經(jīng)一段間隔時(shí)間，抽取受測(cè)者血液，滴加適量于特定采樣試紙上陰干；步驟四，將采樣試紙上的陰干血液溶出，制成血液檢測(cè)樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟一所述半乳糖組合物包含有1wt％至5wt％半乳糖粉末，緩沖液及抗氧化劑；其pH值為4.0至9.0；其中，所述抗氧化劑為亞硫酸氫鈉，所述緩沖液選自下列任一種或一種以上的緩沖液檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、碳酸緩沖液及三乙醇胺緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于所述半乳糖含量為總量的4wt％至40wt％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于所述緩沖液添加量為總量的0.001wt％至5wt％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于所述抗氧化劑添加含量為總量的0.001wt％至5wt％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟二所述半乳糖組合物注射量為每人每公斤體重注入0.5g。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟三所述受測(cè)者血液滴加量?jī)?yōu)選為50～200微升，更優(yōu)選為100微升。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟三所述滴加受測(cè)者血液時(shí)需一次滴加完畢，不可于陰干后再重復(fù)滴加。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟三所述間隔時(shí)間為60分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于步驟四所述溶出過程的溶出液包含檢測(cè)試劑、酶制劑及呈色劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制作方法，其特征在于所述檢測(cè)試劑為三氯乙酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制作方法，其特征在于所述酶制劑包含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)輔酶溶液和半乳糖去氫酶溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制作方法，其特征在于所述酶制劑包含體積百分比為75％的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)輔酶溶液、體積百分比為1.25％的半乳糖去氫酶溶液和體積百分比23.75％的稀釋液。
14.一種肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的采樣試紙，是為紙漿制作的特定濾紙，所述紙張厚度達(dá)0.4mm以上，應(yīng)用于權(quán)利要求1中所述的肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品制作方法上，用以制作肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝功能測(cè)定的血液檢測(cè)樣品的制作方法及采樣試紙。本發(fā)明的方法是注射一種半乳糖組合物進(jìn)入受測(cè)者體內(nèi)；經(jīng)一段間隔時(shí)間后，適量取受測(cè)者血液滴于濾紙上陰干；將濾紙上陰干血液利用三氯乙酸溶出，并以一種酶溶液溶出，制成血液檢測(cè)樣品，最后再以微盤分析儀分析此血液檢測(cè)樣品中的半乳糖濃度。
文檔編號(hào)G01N33/66GK1786683SQ20041009844
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者胡幼圃, 熊正輝, 薛孟娟, 鮑力恒 申請(qǐng)人:雅各生技有限公司