專利名稱：鏈霉素elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及動(dòng)物性食品安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)中藥物殘留量的檢測(cè)試劑盒，特別是檢測(cè)動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中鏈霉素殘留量的試劑盒。
背景技術(shù)：
鏈霉素是氨基糖甙類抗生素，是美國(guó)瓦克斯曼研究所1945年研制成功的，臨床中主要用于對(duì)結(jié)核菌感染性疾病的治療，它的問世結(jié)束了結(jié)核病無藥可醫(yī)的歷史。以后隨著新藥(如對(duì)氨水楊酸、異煙肼、乙胺丁醇、氨硫脲、利福平、吡嗪酰胺、卡那霉素等)的發(fā)明和鏈霉素對(duì)人體聽力損害的發(fā)現(xiàn)，其在治療結(jié)核病上的地位逐漸被取代。但因鏈霉素對(duì)雞、羊、牛、豬的各類炎癥(如雞傳染性鼻炎、豬急性支氣管炎、豬白痢、奶牛子宮內(nèi)膜炎等)有很好的療效，所以現(xiàn)在經(jīng)常被添加到動(dòng)物的飼料中應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。但凡使用過鏈霉素的動(dòng)物，在一定時(shí)期內(nèi)其產(chǎn)品都有殘留，因其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，所以在動(dòng)物食品中殘留會(huì)對(duì)人類健康造成威脅和影響，歐美國(guó)家及我國(guó)均要求對(duì)其限量使用。目前，我國(guó)對(duì)食品中鏈霉素殘留的測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)、微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。采用HPLC法雖然是一種較理想的藥物殘留分析方法，但鏈霉素分子中沒有紫外發(fā)光團(tuán)和熒光團(tuán)，在化學(xué)分析中需將它轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤獍l(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)的衍生物才能進(jìn)行分析，這給檢測(cè)工作帶來了極大困難，而且測(cè)定儀器昂貴、操作要求和技術(shù)含量高。而微生物檢測(cè)法是我國(guó)近年來才開始的研究，該方法的可靠檢測(cè)限可達(dá)0.1μg/ml，低于國(guó)家規(guī)定殘留量的最高限量0.2μg/ml(鏈霉素在牛奶中殘留檢測(cè).郭文欣，王國(guó)忠，李朝華等.中國(guó)獸藥雜志2001，3524～26)。雖然該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但其涉及微生物培養(yǎng)，還需培訓(xùn)專門技術(shù)人才和建立專用實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)含量仍然很高，一般檢測(cè)單位很難做到。ELISA法是食品檢驗(yàn)的常用方法，但國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)藥物殘留的研究很少，用于檢測(cè)鏈霉素的ELISA試劑盒更是一項(xiàng)空白。
(三)實(shí)驗(yàn)新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的是提供一種小巧輕便的鏈霉素殘留檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中鏈霉素含量的測(cè)定。
本實(shí)驗(yàn)新型的技術(shù)方案是采用96孔聚苯乙烯試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原制成檢測(cè)板，將40ml濃縮洗滌液、11ml過氧化物酶標(biāo)記物、6ml鏈霉素抗體、6ml顯色液A劑、6ml顯色劑B液、6ml終止液和6瓶500μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與試劑板、蓋板膜一同封裝在盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，即可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，樣本中的殘留物(鏈霉素)將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)鏈霉素抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物(鏈霉素)的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物(鏈霉素)的含量，其操作簡(jiǎn)便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度最低檢測(cè)限為0.5ppb，回收率牛奶為95％±15％、雞肉組織為70％±10％、蜂蜜為75％±15％，同雙氫鏈霉素和硫酸鏈酶素的交叉反映率分別為105％和98％。相對(duì)于其他鏈霉素殘留檢測(cè)，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩機(jī)和微量加樣器，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。
本實(shí)驗(yàn)新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于肉類食品和飼料中鏈霉素殘留的檢測(cè)。


圖1為本實(shí)驗(yàn)新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為12.8cm)；圖2為本實(shí)驗(yàn)新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖3為本實(shí)驗(yàn)新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8.55cm)；圖4為本實(shí)驗(yàn)新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)驗(yàn)新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)驗(yàn)新型固定泡沫模具的俯視圖。
參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶聯(lián)板的外框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶聯(lián)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)；白色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液，白色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝6ml顯色液A劑，紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝6ml顯色劑B液，鏈霉素抗體用綠色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝6ml鏈霉素抗體，黃色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝6ml終止液，黑色帽的透明玻璃試劑瓶(9)用于封裝500μl/瓶的標(biāo)準(zhǔn)液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(11)，6ml顯色液A劑瓶位(12)，6ml顯色劑B液瓶位(13)，6ml鏈霉素抗體瓶位(14)，6ml終止液瓶位(15)，6種500μl/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液瓶位(17)。
本實(shí)驗(yàn)新型的實(shí)施例1.牛奶中鏈霉素含量的測(cè)定1)樣本前處理取牛奶2ml，將其置5000rpm離心10min，去除上層脂肪；取下層1ml，用PH＝7.2，0.02M的PBS-0.1％Tween緩沖液稀釋40倍；取50μl進(jìn)行分析。
2)使用試劑盒的操作步驟①將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒中取出，置室溫(20～24℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；②配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸餾水或去離子水稀釋至800ml備用(按需量稀釋)；③取出需要數(shù)量的已包被抗原的微孔板及框架，將不用的微孔板重新密封，保存于2～8℃不要冷凍；④編號(hào)將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔⑤加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl/孔，然后加一抗工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，37℃水浴或恒溫箱反應(yīng)30min，取出，每孔加300μl洗滌液，洗板5次，拍干；⑥加酶標(biāo)二抗每孔加入100μl，用蓋板膜蓋板后置37℃水浴或恒溫箱反應(yīng)30min。取出，每孔加300μl洗滌液，洗板5次，拍干；⑦顯色每孔加入顯色劑A液50μl，再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃水浴或恒溫箱避光顯色15min；⑧測(cè)定每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè))，測(cè)定每孔OD值。
3)結(jié)果判定有兩種方法，定性判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含鏈霉素量成負(fù)相關(guān)。
①用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.6，樣品2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0ng/ml為1.500；0.5ng/ml為1.380；1.5ng/ml為1.200；4.5ng/ml為0.900；13.5ng/ml為0.700；40.5ng/ml為0.400。則樣品1的濃度范圍是13.5ng/ml-40.5ng/ml；樣品2的濃度范圍是1.5ng/ml-4.5ng/ml；②所獲得的標(biāo)準(zhǔn)值和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值再乘以100，因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100％并以百分比的形式給出吸光度值。計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)鏈霉素濃度(ng/ml)的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(ng/g)可以從校正曲線上讀出。
4)測(cè)定前的注意事項(xiàng)①使用之前將所有試劑回升至室溫20-24℃；②使用之后立即將所有試劑放回2-8℃；③在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)；④在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
2.雞肉等組織中鏈霉素含量的測(cè)定1)樣本前處理取2g去除脂肪的粉碎樣品與8mlPBS-0.1％Tween緩沖液混合5min.加入正己烷5ml充分上下混合10min。靜置1h。室溫離心15min 10000rpm。用移液器取中間層1ml，加入1ml正己烷，充分振蕩5min，離心15min 4000rpm。去除上層，取下層以1∶10倍稀釋(50μl上清+450μlPBS-0.1％Tween緩沖液)。組織樣品稀釋倍數(shù)40倍。
2)、3)、4)步驟同實(shí)施例1。
3.肝臟樣品中鏈霉素含量的測(cè)定1)樣本前處理5.0g去除脂肪的粉碎樣品與20ml PBS-0.1％Tween緩沖液混合30min。室溫離心10min10000rpm。2ml上清與3ml正己烷混合振蕩5min。室溫離心10min 4000rpm。去除上層脂肪層，用PBS-0.1％Tween緩沖液以1∶10稀釋(100μl上清+900μlPBS-0.1％Tween緩沖液)。取50μl水相進(jìn)行分析。
2)、3)、4)步驟同實(shí)施例1。
權(quán)利要求1.本實(shí)用新型涉及對(duì)動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中的鏈霉素殘留的檢測(cè)試劑盒。包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、12瓶試劑和放試劑的下凹瓶位。其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，12瓶試劑分別為標(biāo)準(zhǔn)液、過氧化物酶標(biāo)記物、鏈霉素抗體、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述涉及對(duì)動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中的鏈霉素殘留的檢測(cè)試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯板，放于真空鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉑袋內(nèi)；標(biāo)準(zhǔn)液均用黑色帽的透明玻璃瓶，過氧化物酶標(biāo)記物用紅色帽的白色塑料瓶，鏈霉素抗體用綠色帽的白色塑料瓶，顯色劑A液用白色帽的白色塑料瓶，顯色劑B液用紅色帽的黑色塑料瓶，終止液用黃色帽的白色塑料瓶，濃縮洗滌液用白色帽的半透明塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述涉及對(duì)動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中的鏈霉素殘留的檢測(cè)試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有12個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板一致；標(biāo)準(zhǔn)液6瓶均為(0ng/ml，0.5ng/ml，1.5ng/ml，4.5ng/ml，13.5ng/ml，40.5ng/ml)500μl/瓶，過氧化物酶標(biāo)記物11ml，鏈霉素抗體6ml，顯色液A液6ml，顯色液B液6ml，終止液6ml，濃縮洗滌液40ml。
專利摘要本實(shí)用新型是一種涉及動(dòng)物性食品安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)中藥物殘留的檢測(cè)試劑盒，特別是對(duì)動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中鏈霉素殘留的檢測(cè)試劑盒。由96孔聚苯乙烯酶聯(lián)板、40ml濃縮洗滌液、11ml過氧化物酶標(biāo)記物、6ml鏈霉素抗體、6ml顯色液A液、6ml顯色液B液、6ml終止液、6瓶不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和蓋板膜構(gòu)成。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物鏈霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK2694277SQ0320617
公開日2005年4月20日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者何方洋, 馮才偉, 萬宇平, 王兆芹 申請(qǐng)人:北京望爾生物技術(shù)有限公司