專利名稱：分離的編碼t細胞誘導(dǎo)因子或白介素－21的核酸分子,其編碼的蛋白和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新分離的核酸分子及其應(yīng)用。該核酸分子顯示可被白介素-9(“IL-9”)上調(diào)。本文還公開了這些核酸分子所編碼的蛋白。這些分子曾被稱為“T細胞衍生的誘導(dǎo)因子”或“TIFs”；但是現(xiàn)在它們被稱為“白介素-21”或“IL-21”，也叫做“IL-TIF”。為此，這些術(shù)語在本文中是可以相互替換的。這些核酸分子編碼的蛋白可誘導(dǎo)細胞中STAT活化。它們可用于如刺激靶組織再生。而且，它們的抑制劑或拮抗劑(antagonist)可用于延遲、阻滯或抑制其它組織的分化。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)在過去十年中，對免疫系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)作用的了解不斷深入。其中一個倍受矚目的領(lǐng)域是對調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白和糖蛋白的研究。這些分子中最了解的家族之一是細胞因子。這些分子參與細胞間“通信”。細胞因子家族的個別成員參與了更廣泛的病理過程，如癌癥和過敏癥。一方面細胞因子參與病理過程，另一方面它們也具有治療價值。
白介素是其中一類細胞因子。有關(guān)白介素的文獻很多。不可能窮舉本領(lǐng)域的全部專利，僅示范性地舉例包括Mertelsmann等的U.S.Patent No.4,778,879；Stern的U.S.Patent No.4,490,289；Mark等的U.S.PatentNo.4,518,584；以及Miyaji等的U.S.Patent No.4,851,512，它們都涉及白介素-2或“IL-2”。涉及白介素-1(“IL-1”)的其它專利，如Cosman的U.S.Patent No.4,808,611。所有這些專利均全文引入作為參考。涉及不同白介素的更近期專利包括U.S.Patent No.5,694,234(IL-13)；5,650,492(IL-12)；5,700,664；5,371,193和5,215,895(IL-11)；5,728,377；5,710,251；5,328,989(IL-10)；5,580,753，5,587,302，5,157,112，5,208,218(IL-9)；5,194,375，4,965,195(IL-7)；5,723,120，5,178,856(IL-6)和5,017,691(IL-4)。對專利文獻的粗略回顧顯示，白介素家族成員的特定多樣?？梢栽O(shè)想更大的細胞因子家族將顯示更多的多樣性。參見，如Aggarwal等的Human CytokinesHandbook For Basic AndClinical Research(Blackwell Scientific Publications，1992)，Paul編，F(xiàn)undamental Immunology(Raven Press，1993)，763-836頁，“T-CellDerived Cytokines And Their Receptors”，以及“ProinflammatoryCytokines and Immunity”。所有引用的文獻均全文引入作為參考。
各種細胞因子之間的關(guān)系很復(fù)雜。從引用的文獻可見，特定細胞因子水平的增高或降低可以直接或間接影響受試者所產(chǎn)生的其它分子的水平。受影響的分子有些是其它細胞因子。
白介素-9，曾被稱為“P40”，是T細胞衍生的分子，最初被鑒定為支持T4細胞系的持久抗原非依賴性生長的因子。見如Uyttenhove等，Proc.Natl.Acad.Sci.856934(1988)，和Van Snick等，J.Exp.Med.169363(1989)，以及Simpson等，Eur.J.Biochem.183715(1989)，均引入作為參考。
首先觀察到IL-9對限制性T4細胞系的活性，但未觀察到對CTL或新分離的T細胞的活性。見如Uyttenhove等，同上，和Schmitt等，Eur.J.Immunol.1921679(1989)。當實驗確定IL-9和稱作T細胞生長因子III(“TCGF III”)的分子與MEA(肥大細胞生長增強活性)作用相同時，其活性范圍擴大了，其中MEA是可增強骨髓來源的肥大細胞對IL-3的增殖應(yīng)答的因子，可見于Hültner等，Eur.J.Immunol.和U.S.Patent No.5,164,317，這兩篇文獻均引入作為參考。還發(fā)現(xiàn)人型IL-9刺激成巨核細胞白血病的增殖。可參見Yang等，Blood741880(1989)。對IL-9的研究顯示其還可以支持紅細胞集落形成(Donahue等，Blood 75(12)2271-2275(6-15-90))；促進髓系紅細胞爆發(fā)形成的增殖(Williams等，Blood 78(8)306-311(9-1-90))；支持成人和胎兒來源的BFU-E’s的克隆成熟(Holbrook等，Blood 77(10)2129-2134(5-15-91))。IL-9的表達還與霍奇金病和大細胞退行性淋巴瘤有關(guān)(Merz等，Blood 78(8)1311-1317(9-1-90))。對易患或不易患支氣管過度反應(yīng)的小鼠的遺傳分析揭示，這一模型與IL-9基因的聯(lián)系，及IL-9產(chǎn)量與易感性的關(guān)系(Nicolaides等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413175-13180，1997)。人類遺傳學(xué)研究也指出IL-9和IL-9R基因是哮喘的候選基因(Doull等，Am.J.Respir.Crit.CaTe Meded.，153，1280-1284，1996；Horoyd等，Genomics52，233-235，1998)。同樣，對IL-9轉(zhuǎn)基因小鼠的研究證實IL-9表達增加導(dǎo)致肺肥大細胞增生病，嗜酸細胞增多癥，支氣管過度反應(yīng)和高水平的IGE(Temann等，J.Exp.Med.188，1307-1320，1998；Godfraind 等，J.Immunol.160，3989-3996，1998；McLane等，Am.J.Resp.Cell.Mol.19713-720(1999))。綜上所述，這些觀察有力地說明IL-9在該疾病中發(fā)揮重要作用。另有研究表明IL-9及其突變蛋白與哮喘和過敏有關(guān)。見PCT申請US96/12757(Levitt等)和PCT US97/21992(Levitt等)，均引入作為參考。
已知IL-9能夠影響受試者體內(nèi)其它分子的水平。參見Louahed等，J.Immunol.1545061-5070(1995)；Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710-4716(1996)，均引入作為參考。還認識到受影響的分子在生物系統(tǒng)中具有自己的功能。例如，Demoulin等顯示IL-9的眾多已知活性由STAT轉(zhuǎn)錄因子的活化介導(dǎo)。因此，一直在嘗試對其存在和/或水平受其它分子如細胞因子影響的分子進行鑒定。
以下內(nèi)容將描述這類分子。發(fā)現(xiàn)編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子在IL-9存在時表達，缺乏IL-9時不表達。因此，這些分子尤其是受試者中IL-9的表達或效應(yīng)的“標志”。這些曾被稱為T細胞衍生的誘導(dǎo)因子或“TIF”的分子現(xiàn)在被稱為白介素-21，或“IL-21”。下面的描述將顯示本發(fā)明的這些及其它特點。
優(yōu)選實施例詳述實施例1已知小鼠淋巴細胞系BW5147可在體外生長，且其培養(yǎng)基中不需加入任何細胞因子。為確定經(jīng)IL-9誘導(dǎo)的基因，BW5147樣品用或不用IL-9(200U/ml)培養(yǎng)24小時。然后，用異硫氰酸胍裂解，CsCl梯度離心，分離總RNA。這些是本領(lǐng)域公知技術(shù)。之后，用oligo(dT)纖維素柱從總RNA中純化多聚腺苷化RNA。然后用分離的polyA RNA生成雙鏈cDNA。使用商業(yè)可獲得的oligo(dT)引物。3-5μg polyA RNA的任意部位與1μg寡聚dT加熱至70℃，10分鐘，然后與5x第一鏈緩沖液(250mM HCl(pH8.3)，375mMKCl，15mM MgCl2)，10mM二硫蘇糖醇，500μM脫氧核苷三磷酸，和800U逆轉(zhuǎn)錄酶一起孵育。反應(yīng)總體積是20μl，37℃反應(yīng)1小時。由此合成第一條cDNA鏈。加入30μl的5x第二鏈緩沖液(100mM Tris-HCl(pH6.9))，450mM KCl，23mM MgCl2，0.75mMβ-NAD+，50mM(NH4)2SO4，60U大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶，2U的大腸桿菌RNase H，10U的大腸桿菌DNA連接酶，和250μM脫氧核苷三磷酸，終體積150μl，來實現(xiàn)第二鏈的合成?；旌衔镌?6℃孵育2小時。
產(chǎn)物用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。cDNA終產(chǎn)物重懸于200μl TE。
對接受刺激的BW5147細胞(下文中稱為“試驗物”(tester))，和平行的未受刺激的BW5147(下文中稱為“對照物”(driver))進行這些步驟。實施例2根據(jù)已知的方法將實施例1中制備的cDNA進行扣除克隆(sub tractloncloning)。為此，制備了6個寡核苷酸5′-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3(SEQ ID NO1)；5′-GATCTGCGGT GA-3′(SEQ ID NO2)；5′-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3′(SEQ ID NO3)；5′-GATCTGTTCA TG-3′(SEQ ID NO4)；5′-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3′(SEQ ID NO5)；和5′-GATCTTCCCT CG-3′(SEQ ID NO6).
這些序列作如下使用。雙鏈cDNA(2μg)用限制性內(nèi)切酶DpnII消化，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，重懸于20μl TE(100mM Tris-HCl(pH7.5)；1mM EDTA)中。12μl酶切的cDNA(1.2μg)與4μl脫鹽的SEQ ID NO1(2mg/ml)，4μl脫鹽的SEQ ID NO2(1mg/ml)，10μl 5x銜接子緩沖液(330mM Tris-HCl，pH7.6，50mM MgCl2，5mM ATP，7μl DDT(100mM)，和28μl水混合，使所述cDNA連接到雙鏈SEQ ID NO1和2。加熱該混合物到50℃，使寡核苷酸之間及與樣品DNA間退火，然后冷卻到10℃ 1小時以上，再加入5μl T4 DNA連接酶，在12-16℃孵育12-14小時。加入140μl TE稀釋。然后用200μl樣品以如下方式進行PCR。實施例3為進行PCR，取200μl樣品與2μg SEQ ID NO1在72℃加熱3分鐘，去除與實施例2中產(chǎn)物雜交的SEQ ID NO2，其中所述樣品是含有2μl連接產(chǎn)物的66mM Tris-HCl，pH8.8，4mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，33μg/ml BSA，0.3mM各種dNTP(濃度500μM)的緩沖液。用5U的Taq聚合酶(72℃，5分鐘)填平3’端。擴增20個循環(huán)(每個循環(huán)95℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘)，將產(chǎn)物匯總后，酚抽提，乙醇沉淀，重懸于TE緩沖液，使其濃度為0.5μg/μl。下文中將其稱為代表產(chǎn)物(representation)。實施例4然后代表產(chǎn)物經(jīng)DpnII消化，去除其中的SEQ ID NO1，準備扣除雜交。消化產(chǎn)物經(jīng)酚抽提，乙醇沉淀。所用為未刺激的樣品時即產(chǎn)生對照物，所用為刺激的樣品時則產(chǎn)生試驗物。部分試驗物(20μg)經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠純化和分離。用上述連接SEQ ID NO1和SEQ ID NO2同樣的方法，將樣品(2μg)與SEQ ID NO3和SEQ ID NO4連接起來。
在扣除雜交的首次循環(huán)中，將0.4μg已連接了SEQ ID NO3和4的試驗物樣品與40μg對照物cDNA混合?；旌衔锝?jīng)酚抽提，乙醇沉淀，溶于2μl3xEE緩沖液(30mM EEPS pH8.0)，3mM EDTA；pH8.0，3mM EDTA。加蓋30μl礦物油，在98℃變性5分鐘。加入5M NaCl(0.5μl)，然后，DNA在67℃雜交20小時。用TE和tRNA載體稀釋反應(yīng)混合物到200μl。樣品72℃孵育3分鐘，使SEQ ID NO4解鏈，然后進行4個PCR反應(yīng)(200μl)。這包括20μl經(jīng)稀釋的無引物的雜交混合物，用于填平重新退火的試驗物末端，加入SEQID NO3樣品后，進行10個擴增循環(huán)(每個循環(huán)95℃ 1分鐘，70℃ 3分鐘)，將產(chǎn)品匯總后，酚抽提，乙醇沉淀，重懸于40μl 0.2x TE緩沖液。將20μl該材料用20U綠豆核酸酶處理30分鐘以降解單鏈DNA，此步驟的總體積為40μl。用50mM Tris-HCl，pH8.9稀釋樣品(1∶5)，然后98℃加熱5分鐘使酶失活。用20μl上述產(chǎn)物，2μl SEQ ID NO3(1mg/ml)，和1μl(5U)Taq DNA聚合酶進行第二輪PCR。共進行18輪循環(huán)(每個循環(huán)95℃ 1分鐘，70℃ 3分鐘)。將產(chǎn)物匯總，酚抽提，乙醇沉淀，重懸至0.5-1μg/μl。該產(chǎn)物稱為“DP1”，或第一個示差產(chǎn)物(difference product)。實施例5
DP1如上述用內(nèi)切酶DphII消化，與SEQ ID NO5和6連接，過程同SEQ ID NO1，2，3和4的描述。重復(fù)實施例4描述的扣除雜交和選擇性擴增，則產(chǎn)生了第二個示差產(chǎn)物，或“DP2”。這些實驗中50ng的DP1是試驗物。對照物(40μg)如上所述。重復(fù)上述過程，用SEQ ID NO3和4作接合物，產(chǎn)生第三個示差產(chǎn)物。為產(chǎn)生第三個示差產(chǎn)物，將100pg的試驗物與40μg對照物混合。重復(fù)上述所有實驗步驟，但最后擴增22輪循環(huán)，其中每個循環(huán)為95℃1分鐘，70℃3分鐘。如此產(chǎn)生最終示差產(chǎn)物。實施例6用DpnII消化最終示差產(chǎn)物。克隆到商業(yè)可獲得載體pTZ19R的BamHI位點。制備雙鏈DNA質(zhì)粒，然后用常規(guī)方法測序。其序列用BLAST檢索程序與GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫的已知序列進行比較。
在扣除過程的最后，確定了一段短cDNA片段，即，約200個堿基對長度的片段。這個片段用于篩選BW5147細胞的cDNA文庫。對最大的克隆進行測序。下面將對其進行討論。其不與任何已知序列相符。
核苷酸序列(SEQ ID NO7)長1119個堿基對，包括537個堿基對的開放閱讀框，其編碼長179個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白的預(yù)計分子量是20,093。另有兩個ATG密碼子，假如作為起始密碼子，將分別產(chǎn)生長172和167個氨基酸的蛋白，分子量分別為19,335和18,770道爾頓。該蛋白的每中形式的特征在于有一段疏水氨基酸序列，該序列在穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時被切除，從而產(chǎn)生成熟蛋白。
對該序列的分析顯示具有三個富含AT的基序(TTATTTAT)。常在細胞因子和癌基因的5’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)這些基序。Kruys等，Science 245852(1989)顯示這些重復(fù)區(qū)可以調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性。實施例7以上述實施例6中分離和分析的cDNA作探針，鑒定TIFα的基因組DNA。
采用標準方法用SEQ ID NO7篩選小鼠品系129的基因組文庫。將一個陽性克隆的EcoRI片段亞克隆到pZERO質(zhì)粒中，并部分測序。這部分序列稱為SEQ ID NO8。實施例8上面實施例7中所述陽性克隆的第二個EcoRI片段也被亞克隆。同源性很高，但序列不相同。具體而言，這個序列的內(nèi)含子1與SEQ ID NO8有98％相同，內(nèi)含子2有100％相同，內(nèi)含子3有92％相同。
令人驚訝的時，該序列中的啟動子均無同源性，說明其調(diào)節(jié)是獨立的。5’非翻譯區(qū)有92％相同。TIFα的第一外顯子分為外顯子1α和外顯子1β。第一編碼外顯子(TIFα外顯子1b和TIFβ外顯子1)有99.5％相同，第二外顯子100％相同，第三外顯子97％相同，第四外顯子98.5％相同，第五外顯子是96％相同。非翻譯區(qū)中的同源性為96％。實施例9用上述實施例8中的信息，推測出所述第二個克隆的cDNA序列，稱為TIFβ，如SEQ ID NOSEQ ID NO9所示。還用上述同樣的方法確定了基因組DNA序列，如SEQ ID NO42所示。其氨基酸序列如SEQ ID NO41所示。
與TIFα相比，TIFβ的編碼區(qū)有6個沉默改變。有兩個改變導(dǎo)致不連續(xù)的氨基酸改變(在36位和113位，TIFα的Val變?yōu)門IFβ的Ile)。在112位有一個更顯著的改變，由Gln變?yōu)锳rg。實施例10用實驗研究TIF的表達。用重組小鼠IL-9(200U/ml)刺激BW5147細胞達不同時長(0.2，0.5，1，2和24小時)。用標準方法和試劑分離總RNA。使用5μg總RNA和oligo(dT)引物進行逆轉(zhuǎn)錄。對應(yīng)于20ng總RNA的cDNA樣品用不同引物擴增25個循環(huán)。(每個循環(huán)94℃ 4分鐘，57℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘)。TIF引物為5’-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3’(SEQ ID NO10)和5’-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3’(SEQ ID NO11)(分別是有義鏈和反義鏈)它們分別對應(yīng)于SEQ ID NO7的107-127和766-786核苷酸。B-肌動蛋白作為對照也進行擴增，擴增18個循環(huán)(第一個循環(huán)94℃ 4分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘。后續(xù)循環(huán)是94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘)。
擴增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分析，用放射標記的內(nèi)部探針印記證實特異性擴增。TIF探針為5’-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3’(SEQ ID NO12)所示條件和探針并非特異于TIF的某一種形式；然而，TIFα的擴增產(chǎn)物包含一個KpmI限制位點，而TIFβ無此限制位點。用KpnI消化擴增產(chǎn)物顯示，IL-9誘導(dǎo)的主要(如果不是全部)TIF mRNA是TIFα，說明經(jīng)IL-9迅速誘導(dǎo)TIFα的表達。刺激30分鐘后可以檢出TIFα的mRNA，在1-24小時內(nèi)達到平臺期。實施例11進行實驗，該實驗顯示上述IL-9對TIF mRNA的誘導(dǎo)不需要合成蛋白。在這些實驗中，如實施例10所述，從刺激24小時的細胞中抽提總RNA，用或不用10μg/ml的蛋白合成抑制劑放線菌酮作用4.5小時。在一組平行實驗中，細胞未受刺激。如實施例10所述抽提總RNA并進行RT-PCR擴增。用EB染色的1％瓊脂糖凝膠分析PCR后的產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍缀铣杀蛔钄鄷r，IL-9的誘導(dǎo)仍會發(fā)生。因此IL-9的作用是直接作用，不需要蛋白介導(dǎo)物的合成。實施例12在這些實驗中，用BW5147細胞系的衍生物來研究STAT蛋白對TIF mRNA的誘導(dǎo)作用。第一個細胞系，BWh9R，表達野生型人IL-9受體。BW-Phe116細胞系是具有單個突變(在116位)的轉(zhuǎn)染子，它使受體不能活化STAT轉(zhuǎn)錄因子。另一個細胞系BW-mut6，具有一個突變，它使受體不能活化STAT5，但仍有活化STAT1和STAT3的能力。最后，細胞系BW-mut7具有一個突變，它使IL-9受體不能活化STAT1和STAT3，但仍有活化STAT5的能力。
如實施例10所述，刺激細胞，分離總RNA，逆轉(zhuǎn)錄并擴增cDNA(細胞被刺激24小時，使用人和鼠重組IL-9)。如上所述，PCR產(chǎn)物在EB染色的1％瓊脂糖凝膠上分析。
分析顯示，人IL-9不能誘導(dǎo)BW-Phe116的表達，說明其涉及STAT轉(zhuǎn)錄因子。已發(fā)現(xiàn)IL-9在BW-mut6突變體中可誘導(dǎo)TIF表達，但在mut7變異體中不能誘導(dǎo)，說明其與STAT1或STAT3有關(guān)，而不涉及STAT5。實施例13研究正常小鼠脾細胞中TIF mRNA的表達。
培養(yǎng)來自10-12周齡的Balb/c小數(shù)的脾細胞24小時，所用培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基或補充有20μg/ml LPS(其可活化B淋巴細胞和巨噬細胞)，或ConA(其可活化T細胞)，或ConA加1％抗小鼠IL-9的阻斷抗血清的對照培養(yǎng)基，以β-肌動蛋白作為對照。如上純化RNA，進行RT-PCR分析。
數(shù)據(jù)顯示，TIF在休眠的脾細胞中表達很弱，不受LPS誘導(dǎo)，但受ConA的強烈誘導(dǎo)。抗IL-9的抗血清不能影響ConA的誘導(dǎo)作用，說明該效應(yīng)不經(jīng)IL-9介導(dǎo)，或經(jīng)其它細胞因子介導(dǎo)。
用RT-PCR產(chǎn)物的序列分析ConA活化的脾細胞，發(fā)現(xiàn)這些細胞主要表達TIFα，或排它性地表達TIFα。實施例14進一步的研究顯示，即使在缺乏IL-9誘導(dǎo)時，TIF mRNA仍能表達。用尼龍毛(wool)柱從來自5周齡FVB小鼠的脾細胞中富集T細胞。然后在補充有ConA(一種T細胞活化物)或PMA(其能夠在大多數(shù)細胞中激活PKC)的培養(yǎng)基中，加入或不加入IL-9的情況下，刺激所述細胞24小時。
用標準技術(shù)分離總RNA，10μg樣品在含有2.2M甲醛的1.3％瓊脂糖凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，標記，按Van Snick等，J.Exp.Med.，169363(1989)的雜交實驗進行分析，該文獻引入作為參考。
結(jié)果顯示，ConA對TIF的誘導(dǎo)不能被修飾，而IL-9在PMA活化的脾細胞中不能誘導(dǎo)TIF RNA。實施例15檢測各種細胞系中TIF mRNA的表達。在這些實驗中，用特定的細胞因子刺激小鼠細胞系至少一天。具體為，9T7是一種T細胞淋巴瘤，其可對IL-2，IL-4或IL-9產(chǎn)生應(yīng)答。TS3和TS6細胞系是來自T輔助細胞克隆，并在IL-2或IL-9存在下增殖。MC9和LI38是肥大細胞系，其在IL-3或IL-9存在下增殖。
刺激后，用常規(guī)的異硫氰酸胍裂解和CsCl梯度離心制備總RNA。
然后用Northern印記分析9T7細胞系，用上述RT-PCR方法分析其它細胞系。
發(fā)現(xiàn)IL-9可上調(diào)T輔助細胞和肥大細胞中TIF的表達。IL-2和IL-3則不能。然而，無論是否存在細胞因子，9T7細胞系中顯示大致相同的表達水平，說明IL-9對于TIF的表達不是必須的。實施例16然后研究B細胞系中TIF mRNA的表達。A20，70Z/3和BCL-1是B細胞白血病細胞系，它們體外生長不需要細胞因子。這些細胞用IL-4和IL-9刺激24小時，用標準方法分離總RNA。如上述經(jīng)RT-PCR擴增35個循環(huán)，然后經(jīng)印記和雜交來分析其表達。
結(jié)果顯示，在B細胞中檢出TIF的表達，IL-9和IL-4存在時最多僅有很弱的上調(diào)。實施例17研究本發(fā)明分子在T輔助細胞系中的表達。TS2和TS1是已知的T輔助細胞系，它們來自T輔助細胞克隆，在IL-9或IL-2(TS2)和IL-9或IL-4(TS1)存在下增殖。具體為，存在列出的細胞因子時，TS2或TS1細胞可生長至少10天，然后用已知方法抽提RNA。用上述的實驗方法，經(jīng)RT-PCR(35個循環(huán))研究這些分子的表達。IL-4和IL-9均可誘導(dǎo)TS1細胞TIF的表達，IL-2不能誘導(dǎo)TS2表達TIF。實施例18研究不同小鼠器官TIF mRNA的表達。用標準的異硫氰酸胍方法和CsCl梯度離心，從肝，腎，心，腦，腸，脾，胸腺，肺，肌肉和骨髓中制備總RNA。用上述方案進行40個循環(huán)的RT-PCR。在胸腺組織者發(fā)現(xiàn)最強表達，腦組織中發(fā)現(xiàn)次強的信號，在其它組織者表達比這兩者弱。實施例19以下實驗描述了293-EBNA細胞中產(chǎn)生TIFα。
TIFα的互補DNA如上所述。將其亞克隆到商業(yè)可獲得的pCEP-4表達載體并與CMV啟動子操縱性連接。用標準脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)方法將所獲的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293-EBNA細胞。轉(zhuǎn)染后，細胞在不含蛋氨酸但補充了35S標記蛋氨酸的培養(yǎng)基中孵育24小時。收集上清，進行丙烯酰胺凝膠電泳。膠干燥后放射自顯影1天。將cDNA以反義方向克隆到相同質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染細胞作為對照。
發(fā)現(xiàn)用TIF正向轉(zhuǎn)染的細胞有一條大約25-30kd的異質(zhì)性帶。在本系統(tǒng)中，預(yù)測分子量與實際分子量之間的偏差以及異質(zhì)性均歸因于糖基化。在一組平行實驗中，編碼人TIF的cDNA的表達方式與小鼠cDNA的表達方式相同。除了cDNA的改變，所以實驗參數(shù)均相同。實施例20進一步進行實驗來研究COS細胞中TIFα的產(chǎn)生。具體為，將TIFα的cDNA亞克隆到上述Demoulin等描述的質(zhì)粒pEF-BOS.puro中，與EF-1α啟動子操縱性連接。采用上述同樣的脂轉(zhuǎn)染胺方法將質(zhì)粒cDNA轉(zhuǎn)染到COS細胞。細胞在不含蛋氨酸但補充了35S標記蛋氨酸的培養(yǎng)基中孵育24小時，之后用上面實施例19所述方法處理上清。再次觀察到一條25-30kd的異質(zhì)性帶，還有一條18kd的帶，其很可能代表該分子的非糖基化形式。實施例21從以下實驗發(fā)現(xiàn)TIF能夠誘導(dǎo)腎小球膜細胞、神經(jīng)元黑色素瘤細胞和肝癌細胞中STAT的活化。已知當細胞因子活化STAT因子時，這些因子形成二聚體，從胞漿移至核內(nèi)，與啟動子的靶序列結(jié)合。實驗細節(jié)如下。
如上述轉(zhuǎn)染的293-EBNA細胞在正常培養(yǎng)基中孵育48小時備用，對照上清也如上述處理。使用小鼠腎小球膜細胞系(下文中稱為“MES13”)樣品，大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系(下文中稱“PC12”)，4種不同的人黑色素瘤細胞(SK23，AUMA，NA-8mel和MULL)，人肝癌細胞(HepG3)和大鼠肝癌細胞(H-4-II-K)。在1％的上清存在下，刺激細胞樣品(0.5×106)5-10分鐘。根據(jù)已引入作為參考的Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710(1996)制備核提取物。簡言之，用PBS洗滌細胞，然后重懸于冰冷卻的1ml低滲緩沖液15分鐘。(緩沖液是10mM HEPES緩沖液，pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，5％甘油，0.5mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM二硫蘇糖醇和1mM Pefabloc，1mMNa3V4，和5mM NaF)。加入65μl的NP-40裂解細胞，然后離心。14000rpm離心30秒沉淀核，用補充有HEPES(20mM)，甘油(20％)和NaCl(420mM)的緩沖液抽提。離心2分鐘除去核碎片。根據(jù)上述Demoulin等的方法確定DNA結(jié)合活性，使用稱為“GRR”的32P標記雙鏈寡核苷酸，它包含F(xiàn)cγRI基因啟動子的STAT結(jié)合位點，即5’-ATGTATTTCCCAGAAA-3’(SEQ ID NO13)和5’-CCTTTTCTGGGAAATAC-3’(SEQ ID NO14)其對應(yīng)于GRR探針中結(jié)合位點的上鏈和下鏈。簡言之，5μl的核提取物在結(jié)合緩沖液(12mM HEPES，pH7.6，10mM KCl，0.5mM EDTA，2.5％甘油，0.1mg poly(dI-dC)/ml)中孵育5分鐘。加入放射標記的GRR探針(105cpm；約0.5ng)，繼續(xù)孵育25分鐘，然后上樣至非變性聚丙烯酰胺凝膠。
還注意到上述MES13細胞中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合物在凝膠中的遷移被抗STAT5和抗STAT3抗體導(dǎo)致部分改變(overshift)，這表明(i)所檢測的細胞是TIF的靶目標，(ii)STAT5和STAT3是TIF活化的復(fù)合物中重要成分。與上述實施例12比較，STAT圖譜的差異歸因于細胞來源的不同(人和小鼠相比)。還觀察到人TIF可在小鼠細胞中起作用，反之亦然。實施例22本實施例詳述編碼人TIF的核酸分子的分離和克隆。首先，用標準的密度梯度離心制備人外周血單核細胞。隨后，以3×106個細胞/ml的密度培養(yǎng)24小時，其間加入或不加抗CD3單抗(該抗體是商業(yè)可獲得的OKT3單抗，為1/500稀釋的腹水)。使用該抗體是因為T細胞來源的細胞因子通常只在CD3特異性抗體的活化下表達。
采用標準異硫氰酸胍/CsCl超速離心技術(shù)從這些細胞中分離總RNA。用oligo(dT)引物逆轉(zhuǎn)錄10μg的RNA樣品。
如上述方法制備cDNA，用PCR擴增與100ng總RNA相當?shù)腸DNA，所用引物如下5’-AGGTGCTGAACTTCACCCTGGA-3’(SEQ ID NO15)5’-CCACTCTCTCCAAGCTTTTTCA-3’(SEQ ID NO16)它們均基于小鼠cDNA序列(即SEQ ID NO7)。進行30個循環(huán)的PCR，每個循環(huán)是94℃ 1分鐘，42℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘。用標準方法經(jīng)瓊脂糖凝膠分離擴增產(chǎn)物，然后測序。結(jié)果顯示擴增的是cDNA片段。從而進行第二個反應(yīng)，除用SEQ ID NO17替換SEQ ID NO16外，其余物質(zhì)相同，SEQID NO17為；5’-CAAGTCTACCTCTGGTCTCAT-3’第二個PCR反應(yīng)進行25個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 1分鐘，45℃ 1分鐘，72℃2分鐘。擴增產(chǎn)物的處理同第一個反應(yīng)。418個核苷酸的片段被擴增，該片段被發(fā)現(xiàn)于抗CD-3刺激的細胞中，但未見于休眠的(resting)PBMCs中。該片段的核苷酸序列如SEQ ID NO18所示。實施例23制備擴增產(chǎn)物后，用標準的5’-RACE技術(shù)分離5’端cDNA。簡言之，以SEQ ID NO19(如下)作為引物制備cDNA第一鏈5’-TGGCCAGGAAGGGCACCACCT-3’這個引物基于實施例22的序列信息。簡言之，5’-RACE法實施如下將上述制備的1μg總RNA，2.5pM的SEQ ID NO19，逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2.5μl的dNTP混合物(10mM)，2.5μl MgCl2(25mM)，和2.5μl DDT(0.1M)混合。反應(yīng)完成后，加入RnaseH和RnaseT1除去原始RNA。還除去未摻入的dNTP，引物和蛋白。用末端轉(zhuǎn)移酶，或“TdT”給cDNA加尾。如下所述，該酶為縮短的錨定引物產(chǎn)生3’結(jié)合位點。通過加入純化的cDNA第一鏈，TdT，緩沖液(10mM Tris-HCl，25mM KCl，1.5mM MgCl2)和200μM dCTP進行加尾。
下面是加尾反應(yīng)，用下述引物進行PCR反應(yīng)5′-CCTATCAGAT TGAGGGAACA G-3′(SEQ ID NO20)和5’-RACE縮短的錨定引物5′-GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3′(SEQ ID NO21)。
擴增35個循環(huán)(每個循環(huán)為94℃ 1分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘)。隨后對1/100稀釋的擴增產(chǎn)物5μl，以SEQ ID NO20和縮短的通用擴增引物進行巢式擴增(nested amplification)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’(SEQ ID NO22)擴增30個循環(huán)(每個循環(huán)為94℃1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘)。用標準方法克隆PCR產(chǎn)物，并測序。
這三個實驗，即上述兩個產(chǎn)生片段的實驗，和上述5’-RACE PCR可使擴增產(chǎn)物已測序的序列進行對比排列，以產(chǎn)生完全的序列。
排列后得到推測的開放閱讀框側(cè)翼的寡核苷酸序列5’-CCTTCCCCAGTCACCAGTTG-3’(SEQ ID NO23)和5’-TAATTGTTATTCTTAGCAGG-3’(SEQ ID NO24)。
這些引物用于擴增完整開放閱讀框，所用mRNA來自上述CD3特異性單抗刺激的細胞。擴增25個循環(huán)，(每個循環(huán)為94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘)。
人cNDA的完整序列見SEQ ID NO25。其含有537個堿基對的ORF，該ORF編碼179個氨基酸的蛋白。與鼠蛋白的長度相同。人蛋白與鼠蛋白具有79％的氨基酸同一性，而IL-10具有25％同一性。人和鼠蛋白分別如SEQID NO43和40所列。實施例24這些實驗詳細描述與上述cDNA對應(yīng)的人基因組DNA。
根據(jù)該cDNA序列，將引物設(shè)計為與SEQ ID NO25的51-70位核苷酸和631-650位核苷酸相對應(yīng)。用標準方法進行PCR。具體為，以來自CESS細胞(EBV轉(zhuǎn)染，類淋巴母細胞細胞系)的100ng的基因組DNA作模板，擴增33個循環(huán)(每個循環(huán)為94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 5分鐘)。分離序列并測序，將其示于SEQ ID NO26。該序列長約4.8Kb，被認為包含編碼TIF分子的完整基因組序列，僅缺少5’側(cè)翼區(qū)，啟動子區(qū)和3’末端。分析顯示其含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，與小鼠的基因組序列相同。
使用標準方法進行Southern印記雜交。顯示基因組只含有TIF基因的單一拷貝。實施例25有必要確定上述基因組DNA是否位于人基因組中。為此采用兩種不同的方法。在第一個方法中，用熒光標記上述SEQ ID NO26序列作為探針，采用標準的原位雜交(“FISH”)探查人的基因組。
第二個方法中，用SEQ ID NO25的51-70位核苷酸以及5’-ATCAGATGGATTACTGAATG-3’(SEQ ID NO27)作探針篩選一組放射性雜合克隆。用25ng的基因組DNA作模板進行PCR，擴增35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘。
兩種方法均顯示該基因位于染色體12q15。一些研究發(fā)現(xiàn)，哮喘相關(guān)疾病與該位點有關(guān)。參見Nat.Genet.15398-392(1997)；Ober等，Hum.MolGenet.7(9)1393-1398(1998)；Nickel等，Genomic 46(1)159-162(1997)；Takahashi等，Genomics 44(1)1502(1997)；Barnes等，Genomics 37(1)41-50(1996)，均引入作為參考。
訪問公共數(shù)據(jù)庫，確定該序列是否已存在于其中。在BAC克隆中發(fā)現(xiàn)了TIF的末尾的一個外顯子，其衍生自染色體12q15。(序列號AC007458；191，111堿基對，BAC RDCI11-444B24)。在該克隆中鑒定到這個末尾的外顯子說明TIF基因位于距IFN基因約90Kb堿基處，距AK155基因不超過30Kb堿基，該AK155是IL-10相關(guān)的細胞因子(Knappe等，J.Virol 743881-3887(2000))。實施例26這些實驗描述與TIF蛋白結(jié)合的抗體的制備。為此，用標準方法將SEQID NO7編碼的氨基酸40-61組成的肽與KLH載體蛋白偶聯(lián)，比例為1mg肽比1mg載體蛋白。用150μg該復(fù)合物以兩周的間隔免受試動物(兔)3次。第一次注射時，免疫原經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，后二次用不完全弗氏佐劑。
末次注射后1個月第一次放血，用已知方法制備血清。
用標準Western印跡檢測血清。簡言之，從轉(zhuǎn)染SEQ ID NO7或SEQ IDNO25的細胞取上清10μl，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，然后印跡至PVDF膜?？寡?∶500稀釋，在標準Western印記方案中使用，還用到抗兔抗體作為二抗，用市售的檢測試劑盒。
發(fā)現(xiàn)該血清確實可以識別TIF蛋白。實施例27本實施例描述為鑒定可與人TIF反應(yīng)的細胞系所進行的實驗。在轉(zhuǎn)染前，以3×105個細胞/孔每天的量將如上所述HEK293-EBNA人胚胎腎細胞接種到6孔板。用2μg含有人TIF cDNA的pCEP-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細胞，該質(zhì)粒是在CMV啟動子的調(diào)控下。轉(zhuǎn)染后細胞在1.5ml正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，為使重組人TIF的產(chǎn)量達到最大。
可以假定，人TIF能夠以與小鼠因子相同的方式誘導(dǎo)STAT轉(zhuǎn)錄因子的激活。接下來進行上述實施例21的方案。向核提取物的混合物中加入抗-STAT抗體(0.75μg抗-STAT1，1μg抗-STAT3，或1μl抗-STAT5b)以及標記探針，并孵育，進行遷移率的實驗。
當使用肝細胞系HepG2時，可以觀察到TIF誘導(dǎo)的帶遷移。上述的抗體用于進一步突出該反應(yīng)的特點?？?STAT-3抗體最大程度地改變了復(fù)合物的滯后，而抗-STAT-1抗體則改變了較弱的其余復(fù)合物的遷移率?？?STAT-5抗體沒有任何作用。這說明STAT-3以及，更小范圍而言，抗-STAT-1是TIF激活的主要轉(zhuǎn)錄因子。使用人肝細胞系HepG3以及肝細胞系H4IIE也得到這些結(jié)果。實施例28本實施例描述通過報道基因測定STAT激活而設(shè)計的實驗。報道基因是“pGRR5”，其含有實施例21中所列序列的5個拷貝，TK啟動子調(diào)控下的熒光素酶基因的上游。對照是pRL-TK載體，其含有在TK啟動子調(diào)控下的remilla熒光素酶基因。
將106HepG2細胞與15μg pGRR5，1μg Pr1-TK(250V，74Ω，1,200μF)混合，進行該試驗。將轉(zhuǎn)染株匯集物分到24孔板中(42,000細胞/孔)。
1小時后，用人TIF(1％HEK293細胞上清)，與300U/ml人IL-6，來自假轉(zhuǎn)染HEK239細胞的1％上清一起，或者僅僅用培養(yǎng)基，刺激細胞。
2小時后，將細胞制成球狀，并溶解。使用標準方法監(jiān)測熒光素酶活性。結(jié)果說明用本發(fā)明的分子進行刺激可以提高含有STAT結(jié)合位點的啟動子轉(zhuǎn)染活性。實施例29已知IL-6這樣的細胞因子激活STAT-3可導(dǎo)致肝細胞中急性期蛋白的誘導(dǎo)。為測定TIF是否也具有相同活性，用來自瞬間轉(zhuǎn)染的HEK293-EBNA細胞的1％上清，刺激5×106HepG2細胞2，13或24小時。在一些試驗中使用10μg/ml的蛋白合成抑制劑放線菌酮，與細胞和上清共同孵育。刺激后，使用標準方法分離總RNA，使用oligo(dT)引物，用10μg總RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄。然后，相應(yīng)于20ng RNA的cDNA，與人血清淀粉狀蛋白A(“SAA”)特異性的引物一起，被擴增18個循環(huán)，引物為agctcagcta cagcacagat(有義鏈，SEQ ID NO28)cctgccccat ttattggcag(反義鏈，SEQ ID NO29)人α1抗胰凝乳蛋白酶tgtcctctgc caccctaaca(有義鏈，SEQ ID NO30)taattcacca ggaccatcat(反義鏈，SEQ ID NO31)人結(jié)合珠蛋白的gtggactcag gcaatgatgt(有義鏈，SEQ ID NO32)acatagagtgt taaagtggg(反義鏈，SEQ ID NO33)人β-肌動蛋白的gctggaaggt ggacagcgag(有義鏈，SEQ ID NO34)tggcatcgtg atggactccg(反義鏈，SEQ ID NO35)對于SAA，Tm為54℃，而對于人α1抗胰凝乳蛋白酶和結(jié)合珠蛋白是52℃，β-肌動蛋白是56℃。使用標準方法用溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。
結(jié)果顯示TIF強有力地誘導(dǎo)SAA和α1抗胰凝乳蛋白酶以及，更小范圍的說，結(jié)合珠蛋白。為檢測TIF是否直接上調(diào)SAA或是否需要蛋白合成，在放線菌酮存在下，如上所述刺激HEPG2細胞。SAA的表達未受影響，說明蛋白合成對于TIF的活性而言并不是必須的。實施例30上述的結(jié)果顯示TIF和IL-6對于急性期蛋白反應(yīng)物顯示出類似的活性。由于IL-6的活性是通過gp130介導(dǎo)，所以進行試驗來檢測是否TIF的活性也是通過gp130介導(dǎo)。
為檢測是否如此，如上所述，用熒光素酶報道基因轉(zhuǎn)染HepG2細胞，然后在多克隆，抗gp130抗體的存在下，用TIF或IL-6刺激，這些抗體已預(yù)先被鑒定為可以阻斷gp130相互作用的細胞因子的活性。
結(jié)果顯示多克隆僅能夠阻斷IL-6的活性。
進行平行試驗來檢測IL-10Rβ鏈是否相關(guān)。在-IL-10Rβ抗體的存在下，TIF的活性被徹底阻斷，而IL-6的活性不受影響。對于SAA表達進行的試驗中也觀察到相同的效果。實施例31這些實驗是為檢測TIF體內(nèi)調(diào)節(jié)急性期蛋白的能力而設(shè)計。
將各種劑量的重組鼠TIF(50，12.5，3.2，0.8，或0.2μg)腹膜注射到內(nèi)毒素抗性的雌性小鼠C3H/HeJ(10-12周齡)內(nèi)。注射6小時后，處死小鼠，接受了50μg TIF的小鼠除外，該小鼠在1，3，6，12或24小時后被處死。取出肝臟并直接冷凍在液氮中。然后使用標準方法分離總RNA，之后在含有2.2ml/升甲醛的1.3％瓊脂糖凝膠中分離10μg總RNA樣品。然后樣品被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
使用商業(yè)可獲得的標記試劑盒制備鼠SAA探針。根據(jù)Van Snick等，J.Exp.Med 169363-368(1989)進行雜交實驗，將其并入作參考。探針本身是如上所述，使用如上述的來自小鼠肝臟的cDNA，通過PCR制備。制備探針所用的引物為tctgctccct gctcctggga(有義鏈SEQ ID NO36)以及tccaggaggt ctgtagtaat(反義鏈SEQ ID NO37)結(jié)果顯示最高劑量的小鼠TIF(50μg)在短至腹膜注射后1小時后，即誘導(dǎo)了SAA的表達。最長的作用時期可達到6小時。在注射后24小時，SAA的表達水平降低。
使用各種劑量TIF的實驗數(shù)據(jù)說明使用3.2μg劑量時，仍可獲得最大程度的SAA誘導(dǎo)。當使用低至0.8μg劑量時，仍可檢測到SAA信使(message)。實施例32起初，TIF被鑒定為一種T細胞衍生的細胞因子。多數(shù)調(diào)節(jié)肝臟急性期蛋白的細胞因子主要在炎癥期間產(chǎn)生。為鑒定TIF能否在炎癥刺激中體內(nèi)產(chǎn)生，將2μg E.coli脂多糖抗原腹膜注射到12周齡的雌性BALB/c小鼠中。2小時后處死小鼠，器官被冷凍在液氮中。使用標準方法分離總RNA，使用oligo(dT)引物對10μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后，相應(yīng)于20ng總RNA的cDNA，與TIF特異性的引物一起，被擴增25個循環(huán)，引物為ctgcctgctt ctcattgccc t(有義鏈SEQ ID NO38)以及caagtctacc tctggtctca t(反義鏈SEQ ID NO39)其Tm為55℃。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
結(jié)果說明LPS在所有受檢測的器官中都誘導(dǎo)TIF表達，說明TIF與炎癥過程相關(guān)。
以上實施例描述了本發(fā)明，其中一方面是分離的核酸分子，其編碼TIF蛋白如具有核苷酸序列SEQ ID NO7，25或26所編碼氨基酸序列的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認同，遺傳密碼的簡并性有利于制備可能與SEQ ID NO7，25或26的核苷酸序列不同，但編碼相同蛋白的核酸分子。當然，SEQ ID NO7，25或26是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但其它實施方案也是本發(fā)明的一部分?；蚪MDNA，互補DNA和RNA，如mRNA均包括在內(nèi)。從其它動物物種，包括其它哺乳動物分離的核酸分子也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的一個優(yōu)選方面為分離的核酸分子，其互補物可在嚴謹條件下與SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO25或SEQ ID NO26雜交。使用的“嚴謹條件”如在緩沖液(3.5×SSC)，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.1％SDS，2mM EDTA中65℃雜交，然后室溫2×SSC洗滌，然后在如65℃的高溫下0.1×SSC/0.2×SSC中洗滌。也可使用更嚴謹?shù)臈l件，如0.1×SSC。這些核酸分子編碼約17-22kD的蛋白，如SDS-PAGE所測，它們可活化STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5。經(jīng)SDS-PAGE測定，這些蛋白的糖基化形式約為17到30kD。本發(fā)明另一部分是分離的核酸分子，其編碼蛋白與SEQ ID NO7，25或26，所編碼的蛋白具有至少30％，優(yōu)選至少45％，更優(yōu)選至少60％，最優(yōu)選90％的氨基酸同一性例如SEQ ID NO42。
本發(fā)明另一方面為包含本發(fā)明核酸分子的表達載體，所述核酸分子與啟動子操縱性連接，從而可促進所述DNA的表達。制備這類載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
所述載體及核酸分子本身均可用于制備原核或真核的重組細胞，這些重組細胞中摻入了所述表達載體，或是核酸分子本身。根據(jù)本發(fā)明這一方面可使用的細胞類型有E.coli細胞，COS細胞，CHO細胞等。
本發(fā)明另一方面為上述核酸分子所編碼的蛋白，優(yōu)選其分離的形式?！暗鞍住敝负怂岱肿颖磉_的直接產(chǎn)物，其糖基化形式，和多聚體形式，如二聚體，三聚體等。本發(fā)明還有一個部分是多聚體，如二聚體，其至少包含本發(fā)明的一個蛋白分子，和至少一個不同的蛋白分子。優(yōu)選該不同的蛋白分子是細胞因子，如IL-10。本發(fā)明還有一個方面的構(gòu)建體，如融合蛋白，其中上述蛋白的全部或一部分以某種形式，如融合蛋白的形式，與至少一種其它蛋白或多肽，或氨基酸序列相連。例如，“融合配對物”可以是直接或間接提供識別信號的分子，如FLAG肽，β-半乳糖苷酶，熒光素酶等。這些融合配對物優(yōu)選與上述位于蛋白N端和/或C端的分子連接；但應(yīng)理解已知有許多的技術(shù)可將分子與氨基酸連接，這些方法中任一個或全部均可嘗試屬于本發(fā)明的一部分的構(gòu)建體。
如上所述，本發(fā)明的每個蛋白分子優(yōu)選經(jīng)SDS-PAGE測定分子量約17-30kD。當然在多聚體形式中，復(fù)合物的分子量會有變化，但其中所含TIF分子的分子量經(jīng)SDS-PAGE測定均應(yīng)為17-30kD。
這些蛋白優(yōu)選包含至少約120個氨基酸，不超過約200個氨基酸。優(yōu)選這些氨基酸序列由SEQ ID NO7，8，9，25或26編碼的氨基酸序列組成，或包括其全部或部分。更優(yōu)選該氨基酸序列包含上述各序列所編碼的除約前40個氨基酸以外的所有氨基酸。甚至更優(yōu)選它包含這些序列所編碼的除約前20個氨基酸以外的所有氨基酸。最優(yōu)選地，該蛋白包含SEQ ID NO40或41所示的氨基酸，以及上述這些氨基酸所定義的蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認同，上述核苷酸分子所編碼蛋白的是本發(fā)明的特征，并可用于根據(jù)標準方法產(chǎn)生抗體。這些單克隆或多克隆形式的抗體，以及所述抗體的片段、嵌合形式、人源化形式、重組形式等均構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明的特征還有免疫原，其包含本發(fā)明蛋白分子的全部或部分氨基酸序列，優(yōu)選與佐劑，如完全或不完全弗氏佐劑組合。這些蛋白序列的部分可與其它分子如匙孔血藍蛋白連接，以增加其免疫原性。這些抗體可用于如確定是否有本發(fā)明蛋白存在。這是本發(fā)明的另一特征?，F(xiàn)進行描述。實施例中已顯示，存在IL-9時本發(fā)明核酸分子表達。因此本發(fā)明的另一特征是確定IL-9是否存在或已經(jīng)存在的一種方法，其中可用抗體檢測本發(fā)明蛋白，或用本發(fā)明核酸分子作探針檢測mRNA?？芍苯訙y定mRNA，或其cDNA形式。這些探針可標記或不標記，取決于使用者。因此，可通過測定本發(fā)明核酸分子的存在來確定給予IL-9后細胞因子是否仍有效。這類試驗可用于如定量研究，其中可確定細胞是否對IL-9敏感，如果是，敏感程度如何。還可利用本發(fā)明的蛋白使STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5磷酸化。這樣可使STAT蛋白形成二聚體，然后移至細胞核，從而激活這些STAT蛋白對細胞的作用。
可將這些分子施用于受試者，如患淋巴瘤，免疫系統(tǒng)疾病如過敏，獲得性免疫缺陷綜合癥，自身免疫性糖尿病，甲狀腺炎或任何其他疾病的受試者，從而檢驗IL-9激動劑(agonist)或拮抗劑的效力，所述疾病可參見U.S.Patent No.5,830,454；5,824,551，以及1997年9月8日提交，現(xiàn)在被批準的申請08/925348，均引入作為參考。這些分子也可用于介導(dǎo)IL-9在這些或其它疾病中的作用。由于IL-9誘導(dǎo)TIF，所以TIF是IL-9活性的有效介導(dǎo)物。因此，本發(fā)明另一方面是在如哮喘，過敏和淋巴瘤等與IL-9活性過度有關(guān)的情況下，測定內(nèi)源性IL-9活性的方法。還可使用例如反義分子，與TIF結(jié)合的抗體或這些分子的其它拮抗劑，通過阻斷或抑制TIF或TIF活性來阻斷或抑制IL-9活性，例如TIF突變蛋白可與TIF受體結(jié)合但不能活化該受體，因此可抑制IL-9誘導(dǎo)的活性，它是本發(fā)明的又一特征?？捎眠@類TIF突變蛋白治療的疾病有過敏，哮喘等。本發(fā)明的突變蛋白可根據(jù)Weigel等，Eur.J.Biochem180(2)295-300(1989)和Epps等，Cytokine 9(3)149-156(1997)所述制備，均引入作為參考。這類突變蛋白可用于治療哮喘，過敏或二者。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，上述分子還可用于篩選合適的突變蛋白。調(diào)節(jié)IL-9活性的能力對于上述疾病，以及凋亡，包括可地松誘導(dǎo)的凋亡，涉及BCL-3的核表達等疾病(condition)很重要，因為已知IL-9誘導(dǎo)這種表達。本文中“抗體”是指于TIF結(jié)合的抗體的任何部分，包括嵌合抗體和人源化抗體。
本發(fā)明的另一特征涉及本發(fā)明TIF型分子在其效應(yīng)組織上刺激再生或抑制分化的能力。如上已示，TIF可靶向多種腫瘤和正常細胞系(即腎小球膜細胞，神經(jīng)元細胞，以及黑色素瘤細胞和肝癌細胞)。因此可在需要通過TIF分子的作用使組織再生的樣品中，加入一定量的TIF型分子，從而刺激組織再生。該方法在體內(nèi)，體外均可使用。同樣，需要抑制特定組織，如黑色素瘤細胞或肝癌細胞分化時，可加入TIF拮抗劑。
如實施例25所述，編碼TIF的基因定位于12號染色體。已知這一染色體與哮喘有關(guān)。還公知12q15區(qū)域與其它炎癥疾病相關(guān)。因此，本發(fā)明另一實施方案是測定疾病，如哮喘或與哮喘有關(guān)的疾病易感性的方法，其是通過確定TIF基因位點是否存在畸變，如多態(tài)性，缺失，添加等。這類畸變可以指示哮喘，過敏性疾病，或一或多種相關(guān)疾病的易感性或存在。檢測DNA序列中的異常是本領(lǐng)域已知的，在此不再贅述。優(yōu)選用標準技術(shù)，如PCR，并用上述方法和引物檢測所述異常。
以上所列數(shù)據(jù)，特別是LPS對本發(fā)明分子表達的誘導(dǎo)，以及該分子對急性期蛋白的調(diào)節(jié)，都指示著本發(fā)明的分子與炎癥反應(yīng)十分相關(guān)。因此本發(fā)明的另一特征涉及使用IL-TIF/IL-21來鑒定促炎癥以及抗炎癥試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知IL-TIF/IL-21能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。該調(diào)節(jié)的一個優(yōu)選方面是，通過施用IL-TIF/IL-21或其拮抗劑來調(diào)節(jié)器官，例如肝臟所產(chǎn)生的急性期蛋白。參見如Janeway等，Immunobiology(4th版)，并入作為參考。Janeway解釋了各種細胞因子如IL-1，IL-6和TNF-α激活肝細胞合成急性相蛋白，如c-反應(yīng)蛋白，甘露聚糖結(jié)合凝集素，以及上面實施例描述的那些。
IL-TIF/IL-21激活急性期蛋白的功能還可通過測定在推定的激動劑或拮抗劑以及IL-TIF/IL-21存在下，急性期蛋白產(chǎn)量的改變，用于鑒定IL-TIF/IL-21激動劑或拮抗劑的方法。
本發(fā)明的另一部分是鑒于IL-TIF/IL-21與白介素-10受體的關(guān)系來調(diào)節(jié)其活性的方法。如上所示，IL-10Rβ拮抗劑，如抗體，能夠抑制IL-TIF/IL-21活性。因此，本發(fā)明的另一特征是應(yīng)用IL-10受體的激動劑和拮抗劑，如IL-10Rβ激動劑和拮抗劑，來調(diào)節(jié)IL-TIF/IL-21的產(chǎn)量。
本發(fā)明的其它特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，無需贅述。
所用術(shù)語和表達方式旨在說明，并非限制，無意用這些術(shù)語和表達排除本發(fā)明所示和所述特征或其部分的任何等價體，應(yīng)理解各種修改均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表序列表<110>勞爾.杜穆蒂爾(Dumoutier，Laure)瓊-克里斯托弗.雷諾爾德(Renauld，Jean-Christophe)<120>分離的編碼T細胞誘導(dǎo)因子或白介素-21的核酸分子，其編碼的蛋白和其應(yīng)用<130>LUD 5664 PCT<140><141><150>US09/419,568<151>1999-10-18<150>US09/354,243<151>1999-07-16<150>US09/178,973<151>1998-10-26<160>43<210>1<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>1agcactctcc agcctctcac cgca24<210>2<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>2gatctgcggt ga12<210>3<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>3accgacgtcg actatccatg aaca24<210>4<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>4gatctgttca tg12<210>5<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>5aggcaactgt gctatccgag ggaa24<210>6<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>6gatcttccct cg12<210>7<211>1119<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>7taaacaggct ctcctctcac ttatcaactg ttgacacttg tgcgatctct gatggctgtc60ctgcagaaat ctatgagttt ttcccttatg gggactttgg ccgccagctg cctgcttctc120attgccctgt gggcccagga ggcaaatgcg ctgcccgtca acacccggtg caagcttgag180gtgtccaact tccagcagcc gtacatcgtc 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權(quán)利要求
1.刺激STAT轉(zhuǎn)錄因子表達的方法，包括使能夠進行所述表達的細胞與一定數(shù)量的IL-TIF/TL-21相接觸，使所述細胞足夠刺激所述表達。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述STAT轉(zhuǎn)錄因子是STAT3或STAT1。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述STAT轉(zhuǎn)錄因子是STAT3。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳動物IL-TIF/IL-21。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述哺乳動物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21是由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所編碼。
7.誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生急性期蛋白的方法，包括使所述細胞與一定數(shù)量IL-TIF/IL-21相接觸，該數(shù)量足夠誘導(dǎo)所述急性期蛋白的產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細胞是肝臟細胞。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述急性期蛋白是人血清淀粉狀蛋白A，α1胰凝乳蛋白酶或結(jié)合珠蛋白。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳動物IL-TIF/IL-21。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所編碼。
13.調(diào)節(jié)IL-TIF/IL-21分子活性的方法，包括使IL-TIF/IL-21活性易感性的細胞與一定數(shù)量的IL-TIF-IL-21調(diào)節(jié)物相接觸，所述數(shù)量足夠調(diào)節(jié)IL-TIF/IL-21活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述調(diào)節(jié)物是能夠與IL-10Rβ分子結(jié)合的物質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述調(diào)節(jié)物是能夠特異性結(jié)合IL-10Rβ分子的抗體。
16.權(quán)利要求16的方法，其中所述調(diào)節(jié)物是IL-10R分子的拮抗劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10R分子的激動劑。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述分子是IL-10R分子的激動劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10Rβ。
20.檢測暴露于炎癥物質(zhì)的方法，包括檢測來自相信暴露于炎癥的受試者的樣品中IL-TIF/IL-21的表達，其中TIF的表達指示著暴露于炎癥物質(zhì)。
21.鑒定IL-TIF/IL-21調(diào)節(jié)物的方法，包括將確信為IL-TIF/IL-21調(diào)節(jié)物的物質(zhì)與IL-TIF/IL-21源和表達急性期蛋白的細胞相接觸，并測定所述細胞產(chǎn)生的急性期蛋白，其中與在缺乏所述物質(zhì)情況下所述細胞產(chǎn)量相比，所述急性期蛋白產(chǎn)量的改變，指示所述物質(zhì)是IL-TIF/IL-21調(diào)節(jié)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸分子的分離，其表達經(jīng)IL－9上調(diào)。對應(yīng)于該核酸分子的蛋白的氨基酸顯示出細胞因子的某些結(jié)構(gòu)特征。除核酸分子和蛋白之外，還公開了所述這些分子的多種用途。這些分子可稱作T細胞誘導(dǎo)因子。這些分子涉及STAT分子的激活，急性期蛋白和炎癥。
文檔編號G01N33/566GK1443241SQ01813125
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月27日
發(fā)明者勞爾·杜穆蒂爾, 瓊-克里斯托弗·雷諾爾德 申請人:路德維格癌癥研究院