專利名稱：用于由大腸桿菌向培養(yǎng)基中分泌來制備Leu－水蛭素的信號序列的制作方法
來源于水蛭的產(chǎn)品Refludan在臨床試驗中顯示出良好的治療特性(The Lancet，第353卷，429-438頁)。由此得出將來對該產(chǎn)品的需要量可能比較大的結論。該產(chǎn)品中的生物活性成分是[Leu1，Thr2]-63-脫硫水蛭素，該成分被記載在歐洲專利0 324 712中并在下文中被簡稱為“Leu-水蛭素?！睔W洲專利0 448 093記載了一種制備水蛭素的方法。該專利優(yōu)選的實施方案包括N-末端氨基酸由丙氨酸構成的水蛭素。將該水蛭素融合到α-環(huán)糊精糖基轉移酶(CGT酶)的信號序列上，并按照該專利中記載的方法將編碼該融合蛋白的表達載體轉化到大腸桿菌(E.coli)分泌突變體中，這樣能夠以高于2g/L的粗產(chǎn)率制備Ala-水蛭素。歐洲專利0549 915記載了穩(wěn)定性得到改善的Ala-水蛭素的變體。利用大腸桿菌分泌系統(tǒng)制備這些變體的產(chǎn)率是每升數(shù)克。因此該產(chǎn)率明顯高于由Dodt等描述的水蛭素變體HV1的產(chǎn)率(FEBS LETTERS，第202卷，373-377頁，1986)。美國專利5,573,929中記載了通過pUC載體代替Dodt等描述的源自pBR322的載體以已知方式來對表達盒進行表達，該表達產(chǎn)率與由Dodt等描述的水蛭素變體HV1的產(chǎn)率相比，只有微乎其微的增加量。Bender等(應用微生物學生物技術(Appl.MicrobiolBiotechnol)34，203-207頁，1990)描述了由變青鏈霉菌進行Thr-水蛭素的分泌，Thr-水蛭素的分泌已被記載在歐洲專利0 171 024中。但是，該產(chǎn)率與歐洲專利0 448 093和0 549 915中提到的產(chǎn)率相比，也有明顯的降低。這還適用于在由P.de Taxis du Poet等發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌B中通過大腸桿菌的信號序列Ompa表達分泌水蛭素變體HV1。這些作者發(fā)現(xiàn)水蛭素的產(chǎn)率在胞質中是300mg/l，而在細胞上清液中大約為40mg/l。在所述文章中還記載了在昆蟲細胞系統(tǒng)中的表達非常低(400μg/l)。
采用酵母表達系統(tǒng)多形漢遜氏酵母或巴斯德畢赤氏酵母獲得的產(chǎn)率與歐洲專利0 448 093和0 549 915中記載的利用啤酒糖酵母獲得的產(chǎn)率最接近。
Rosenfeld等(蛋白質表達和純化8，476-482，1996)描述了酵母菌巴斯德畢赤氏酵母對水蛭素的表達和分泌。在這種情況下，獲得的產(chǎn)率大約為1.5g/l培養(yǎng)液。采用多形漢遜氏酵母能夠獲得相似數(shù)量級的產(chǎn)率(應用微生物學生物技術(Appl.Microbiol Biotechnol)44，377-385頁，1995)。然而，這種表達系統(tǒng)的主要缺點在于發(fā)酵時間明顯長于大腸桿菌系統(tǒng)的發(fā)酵時間。因此如果象Ala-水蛭素一樣，由大腸桿菌分泌制備Leu-水蛭素將是有利的。
然而，采用歐洲專利0 448 093中記載的系統(tǒng)是不可能的。由于這個原因，在該專利中建議通過三肽Ala-Thr-Arg延伸Leu-水蛭素序列來制備一種前Leu-水蛭素，與胰蛋白酶發(fā)生反應后該Leu-水蛭素最終被轉化為天然活性成分Leu-水蛭素。按照這個建議進行振蕩搖瓶實驗，結果粗產(chǎn)率明顯低于所述Ala-水蛭素的產(chǎn)率。因此，初步看起來，與后來的酵母表達系統(tǒng)相比，不具備明顯的優(yōu)勢。
因此本發(fā)明的目的是制備一種融合蛋白，在該融合蛋白中信號序列與Leu-水蛭素的結合使得對Leu-水蛭素直接進行加工并隨后由大腸桿菌以高產(chǎn)率分泌天然Leu-水蛭素成為可能。對于建立一種通過提高水蛭素的初始濃度而降低Refludan的發(fā)酵和后續(xù)純化生產(chǎn)成本的方法，這是先決條件。目前已驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在能夠由大腸桿菌直接分泌Leu-水蛭素的信號序列，并且在這種情況下的分泌實際上比歐洲專利0 448093中記載的那種分泌看起來更有效。因此有可能建立一種不需要高成本就能得到大量Leu-水蛭素的方法。本發(fā)明正是如此。
為了找到有利的信號序列，引進一種PCR-輔助信號序列篩選方法。該方法利用編碼目的蛋白的DNA作為模板以及利用一種確定的反向PCR引物和可變正向引物，該正向引物可以進行一種DNA片段的合成，該DNA片段編碼一種與目的基因偶合的信號序列。反應按照附

圖1中描述的方案進行?？梢愿鶕?jù)待合成的信號序列的長度來改變反應步驟的數(shù)目對于本技術領域的技術人員來說是清楚的。短信號序列可以通過一個反應步驟來制備，而較長的信號序列可以通過兩個、三個或多個反應步驟來制備。另外，反應步驟的數(shù)目還取決于用來合成作為引物的寡核苷酸的設備。以這種方式合成的融合信號肽基因然后可以被識別限制位點1和2的酶特異切割并被插入到相應打開的表達載體中。當選擇水蛭素作為目的基因時，該系統(tǒng)變得具有普遍意義。而且可變選擇水蛭素的N-端氨基酸是可能的。盡管這對水蛭素與凝血酶的結合有一定影響(結合常數(shù)發(fā)生變化)，但與凝血酶活性有關的水蛭素的抑制作用仍然是可測的。
專利EP-B1 0 448 093記載了水蛭素向培養(yǎng)上清液中的分泌。上清液中的水蛭素濃度可以直接通過著名的凝血酶抑制試驗來測定。水蛭素濃度是分泌效率的直接度量，因而是信號序列消除的直接度量。然而，該專利記載了，例如，起始于亮氨酸的水蛭素不能通過CGT酶的信號序列有效地釋放到上清液中。利用上述方法，目前有可能找到有效進行分泌的信號序列。以類似的方式，目前有可能對起始于其它19種氨基酸中的一種氨基酸的水蛭素的分泌進行研究。結果產(chǎn)生了針對一系列信號序列的各種情況，所述信號序列能夠以一種模式對信號肽的羧基端氨基酸和與其連接的肽殘基進行有效加工。因此可以對將目的蛋白有效分泌到胞質中的信號肽進行預選，因而增加了建立一種有效制備蛋白質方法的可能性。本發(fā)明同樣也涉及這些。通過以下步驟可以加快所述方法的進程或可以使所述方法自動進行在選擇培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)作為液體培養(yǎng)物的配體混合物和感受態(tài)細胞的轉化混合物，第二天，采用實施例11中所述細胞的等分樣品接種含有用來進行誘導的誘導物的培養(yǎng)基，但是離心大部分培養(yǎng)物并凍結細胞沉淀。如果表達時發(fā)現(xiàn)了水蛭素活性，則相應的表達質粒可以被從所述細胞中再分離出來，然后被線性化并通過凝膠電泳被從任何自連接產(chǎn)物中分離出來。然后所述線性質粒DNA被再連接和再轉化到宿主菌株中。然后可以分離出單個菌落并檢測它們的表達效率。這種方法可以按照工藝滿足藥品審批標準的方式進行。
所述方法的另一個優(yōu)點在于能容易地同時對不同信號肽變體有效分泌水蛭素的能力進行研究，如在各個種間進行氨基酸交換的進化過程中出現(xiàn)的信號肽變體。
通過利用Nielsen等描述的計算機程序(蛋白質工程(ProteinEngineering)10，1-6，1997)進行比較，所述方法也是有利的，借助該方法可以預測信號序列和目的蛋白間的切割位點。然而，發(fā)現(xiàn)以此進行的預測在每種情況下都不正確，因此有利的結合可能容易被忽略。另外，正確加工的預測和能準確獲得的產(chǎn)率之間沒有關系。
本發(fā)明一方面涉及一種含有信號序列的水蛭素前體，該信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、熒光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白(由λ受體(lamB)基因編碼)和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，優(yōu)選地選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，所述信號序列上具有C-端連接的Leu-水蛭素的序列。
本發(fā)明的另一方面涉及一種制備Leu-水蛭素的方法，其中如上所述的水蛭素前體以中間體的形式存在，其中(a)制備一種含有編碼水蛭素前體的DNA序列的表達質粒；(b)在適當?shù)拇竽c桿菌細胞中表達得自于(a)的表達質粒；(c)水蛭素前體從大腸桿菌中分泌出來并同時被加工；和(d)從培養(yǎng)基中直接分離Leu-水蛭素。
本發(fā)明還涉及上述水蛭素前體用于制備Leu-水蛭素的用途，優(yōu)選地是在上述方法中的用途。
另外本發(fā)明還涉及尋找用于在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的合適信號肽的方法，其中(a)在大腸桿菌中表達水蛭素或一種水蛭素衍生物，該水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其與一種待測信號肽進行N-端連接的N末端具有一個確定的氨基酸aax；(b)通過測定培養(yǎng)上清液中的水蛭素活性來確定表達率；
(c)采用各種信號肽重復步驟(a)和(b)；(d)通過比較由步驟(b)中測到的水蛭素活性表示的表達率來選擇合適的信號肽。
本發(fā)明還涉及水蛭素或一種水蛭素衍生物用于尋找一種信號肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一個確定的氨基酸aax，所述信號肽能夠有效分泌一種由所述信號肽和任何其它目的蛋白組成的前體蛋白并且同時能夠去除源于大腸桿菌的信號肽，所述目的蛋白具有N末端氨基酸aax，特別是其中aax是亮氨酸。
而且本發(fā)明還涉及一種通過在大腸桿菌中的分泌表達來制備任何目的蛋白的方法，其中(a)通過尋找一種合適信號肽的方法尋找一種合適的信號肽；(b)在大腸桿菌中表達一種編碼一種前體蛋白的核酸構建體，所述前體蛋白由得自(a)的合適信號肽和目的蛋白組成；和(c)從培養(yǎng)上清液中分離所述的目的蛋白。
尤其是，其中所述目的蛋白的N-端氨基酸是亮氨酸，并且所述表達通過一種核酸構建體來進行，該核酸構建體中包括信號肽的序列編碼一種選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、熒光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白(由λ受體(lamB)基因編碼)和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號肽。
通過實施例方式來描述能夠有效合成和分泌Leu-水蛭素的信號序列的合成。同時還描述了沒有達到目標或產(chǎn)率結果較差的其它信號序列的合成。所述實施例目的在于通過以Leu-水蛭素為基礎的信號序列的選擇解釋本發(fā)明的構思而非對本發(fā)明進行限制。
所述方法可被用于Refludan的純化；這一點，例如，在實施例11中進行了描述。
實施例1編碼由Leu-水蛭素和粘質雷沙氏菌的外膜蛋白的信號序列組成的融合蛋白的融合基因的合成所使用的表達質粒是載體pJF118，該載體被記載在歐洲專利0 468539中的圖1中，原因是該載體的基本結構與歐洲專利0 448 093中記載的載體pCM7053相同。
所使用的模板是質粒pK152，該質粒被記載在歐洲專利0 448 093中的實施例1中并且含有相應于歐洲專利0 171 024的水蛭素序列。
膜蛋白已由Braun，G.和Cole，S.T.進行了描述(分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)。
為了合成所需的DNA片段，制備三種寡核苷酸序列。
寡核苷酸hirrev具有以下序列5′TTTTTTT AAG CTTGGGCTGC AGGTC 3′[SEQ ID NO1]HindIII所述引物與表1中所述水蛭素基因的區(qū)域227-210 bp雜交。
引物smompaf1具有下列序列5′-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3′[SEQ ID NO2]所述引物與表1中所述水蛭素序列的第1-19個核苷酸雜交。引物序列的雜交部分用小寫字母來表示。所述序列的其余部分與由Braun，G.和Cole，S.T.(分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)公開的序列的區(qū)域229 bp-263 bp雜交。
引物smompaf2具有下列序列5′-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3′[SEQ ID NO3]所述引物序列從13 bp位點向前與由Braun，G.和Cole，S.T.公開的201 bp-245 bp序列雜交并因而與引物序列smompaf2重疊。所述引物的1-12位點含有一個識別限制酶EcoRI的位點并且與6個T核苷酸鄰接以便被潛在的酶所識別。
在標準的PCR(如，例如，94℃10″，50℃30″，72℃45″，25個循環(huán))中，以含有表1所述序列的質粒pK152的DNA作為模板，并采用引物hirrev和smompaf1，通過細菌的部分信號序列來延伸水蛭素序列。然后在相同條件下，將反應產(chǎn)物作為第二次PCR的模板與引物hirrev和smompaf2反應。反應產(chǎn)物是一種編碼融合蛋白的DNA片段，所述融合蛋白由通過目的信號序列延伸的水蛭素序列組成。在其5’端有一個識別限制酶EcoR1的位點而在3’端有一個識別限制酶HindIII的位點。
從第二次PCR得到的反應產(chǎn)物以一種雙重消化混合物的形式與兩種限制酶反應并且在T4 DNA連接酶反應中以EcoR1/HindIII片段的形式被插入到載體DNA中，該載體DNA已被所述兩種酶打開鏈。大腸桿菌菌株Mc1061或其分泌突變株WCM100的感受態(tài)細胞被所述連接混合物轉化并在含氨芐青霉素的平板上于選擇壓力下進行培養(yǎng)。第二天早晨，將實施例6中所述的表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.5倍。
實施例2Leu-水蛭素與源于熒光假單胞菌的oprF基因產(chǎn)物的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼oprF基因的所需信號序列(De，E.等；FEMS Microbial.Lett.127，267-272，1995)。
引物pfuf1具有下列序列5′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3′0[SEQ ID NO4]
引物pfuf2具有下列序列5′ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3′[SEQ ID NO5]在這種情況下，引物pfuf1按照實施例1被用于PCR1中而引物pfuf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.1倍。通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶并測定水蛭素的N-端序列。結果發(fā)現(xiàn)所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用于鑒定推定的信號肽酶識別位點的程序可預測由纈氨酸延長了水蛭素。
實施例3Leu-水蛭素與源于大腸桿菌的lamB基因產(chǎn)物的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼lamb基因的所需信號序列(Clement.J.M.和Hofnung，M.細胞(Cell)27，507-514，1981)。
引物lambbf1具有下列序列5′GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO6]引物lambbf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3′[SEQ ID NO7]
在這種情況下，引物lambbf1按照實施例1被用于PCR1中而引物lambbf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達與對比試驗中的表達處于同一水平。通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶并測定水蛭素的N-端序列。結果發(fā)現(xiàn)所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用于鑒定推定的信號肽酶識別位點的程序沒有預測出水蛭素的正確加工。
實施例4Leu-水蛭素與源于腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基的前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于腐敗希瓦氏菌的所需信號序列(Pealing S.L.等生物化學(Biochemistry)31，12132-12140，1992)。由于所述出版物只記載了蛋白質序列，所以按照密碼子表將氨基酸序列翻譯成DNA序列因而引物spfccf1的序列如下所示5′CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO8]引物spfccf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3′[SEQ ID NO9]在這種情況下，引物spfccf1按照實施例1被用于PCR1中而引物spfccf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達比對比試驗中的表達強大約1.5倍。通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶并測定水蛭素的N-端序列。結果發(fā)現(xiàn)所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。這一結果令人驚奇的原因是用于鑒定推定的信號肽酶識別位點的程序可預測對水蛭素序列的位點6上的半胱氨酸的羧基側進行加工。
實施例5Leu-水蛭素與源于pBR322的β-內(nèi)酰胺酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼β-內(nèi)酰胺酶前體蛋白的所需信號序列(Sutcliffe J.G.；ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90(1978))。
引物blatf1具有下列序列5′CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO10]引物blatf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3′[SEQ ID NO11]在這種情況下，引物blatf1按照實施例1被用于PCR1中而引物blatf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的50％-90％。通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶并測定水蛭素的N-端序列。結果發(fā)現(xiàn)所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。這一結果是由用于鑒定推定的信號肽識別位點的程序預測出的。
實施例6Leu-水蛭素與源于大腸桿菌的堿性磷酸酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于大腸桿菌的堿性磷酸酶蛋白的所需信號序列(Shuttleworth，H.，Taylor，J.和Minton，N.核酸研究(Nucleic Acids Res.)14(21)，8689(1986))。
引物linkphoaf1具有下列序列5′GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.12]引物linkphoaf2具有下列序列5′ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3′[SEQ ID NO.13]所述兩種引物在對大腸桿菌的密碼子選擇方面被優(yōu)化，即它們與起始基因的天然序列不完全一致。
在這種情況下，引物linkphoaf1按照實施例1被用于PCR1中而引物linkphoaf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM 100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的一小部分。通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進行凝膠電泳進行分級分離，分離水蛭素電泳帶并測定水蛭素的N-端序列。結果發(fā)現(xiàn)所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。這一結果是由用于鑒定推定的信號肽識別位點的程序預測出的。然而，令人驚奇地是，產(chǎn)率非常低。
實施例7Leu-水蛭素與源于弗格森埃希氏菌的堿性磷酸酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于弗格森埃希氏菌的堿性磷酸酶蛋白的所需信號序列(Du Bose，R.F.和Hartl，D.L.分子生物學進展(Mol.Biol.Evol.)7，547-577(1990))。
這個信號序列在5個位點與源于大腸桿菌的堿性磷酸酶不同。
引物fergusf1具有下列序列5′GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.14]引物fergusf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3′[SEQ ID NO.15]所述兩種引物在對大腸桿菌的密碼子選擇方面被優(yōu)化，即它們與起始基因的天然序列不完全一致。在這種情況下，引物fergusf1按照實施例1被用于PCR1中而引物fergusf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的一小部分。而且表達率比源于大腸桿菌堿性磷酸酶的信號肽與Leu-水蛭素的構建物的表達率低大約50％。
實施例8Leu-水蛭素與源于浸麻類芽孢桿菌的環(huán)糊精葡聚糖轉移酶前體的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf 1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于浸麻類芽孢桿菌的環(huán)糊精葡聚糖轉移酶基因的所需信號序列(Takano，T.，F(xiàn)ukuda，M.Monma，M.，Kobayashi，S.，Kainuma，K.和Yamane，K.J.細菌學(Bacteriol.)166，1118-1122(1986))。
引物baccdgf1具有下列序列5′CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3′[SEQ ID NO.16]引物baccdgf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCTTTCGCTGAGT ATGGC 3′[SEQ ID NO.17]在這種情況下，引物baccdgf 1按照實施例1被用于PCR1中而引物baccdgf 2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率僅為在對比試驗中所獲得的表達率的四分之一。所合成的水蛭素在凝血酶抑制測定試驗中的作用與Leu-水蛭素相似。這意味著所述信號肽已被正確地進行了加工。這與通過理論分析得到的期望值不一致，其表明延伸了8個氨基酸或者在N-端平截了2個氨基酸。
實施例9Leu-水蛭素與源于大腸桿菌PCF020菌毛蛋白前體蛋白(fotA)的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于大腸桿菌PCF020菌毛蛋白前體蛋白(fotA)的所需信號序列(Viboud，G.l.，Jonson，G.，Dean-Nystrom，E.和Svennerholm，A.M.傳染免疫學(Infect.Immun.)64(4)，1233-1239(1996))。
引物pcf1-ala具有下列序列5′TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTACGTATACTGAC TGCAC 3′[SEQ ID NO.18]引物p-pcf2具有下列序列5′TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGCTTTAGTAAGC 3′[SEQ ID NO.19]在這種情況下，引物pcf1-ala按照實施例1被用于PCR1中而引物p-pcf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率為在對比試驗中所獲得的表達率的約40％。
實施例10Leu-水蛭素與源于鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白(fimD)的信號序列的融合蛋白的合成按照實施例1中所述的方案進行構建，其中不同的是使用兩種新引物代替引物smompaf 1/f2，所述兩種新引物在對水蛭素基因的特異性方面和被限制酶EcoR1識別的序列方面與smompa引物具有相同的特征但編碼源于鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白的所需信號序列(Rioux，C.R.，F(xiàn)riedrich，M.J.和Kadnet，R.J.；細菌學雜志(J.Bacteriol.)172(11)，6217-6222(1990))。
引物styfimf1具有下列序列5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3′[SEQ ID NO.20]引物styfimf2具有下列序列
5′ttttttgaattca TGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGGT GAGTCTC 3′[SEQ ID NO.21]在這種情況下，引物styfimf1按照實施例1被用于PCR1中而引物styfimf2被相應地用于PCR2中。所述表達與利用大腸桿菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表達進行比較。結果發(fā)現(xiàn)所獲得的表達率為在對比試驗中所獲得的表達率的約10％。
實施例11在大腸桿菌中的表達本實施例描述了水蛭素的表達。為了達到這一目的，將轉化體的細胞接種到1-5ml的多份LB培養(yǎng)基中并在28℃下利用培養(yǎng)搖床以220rpm振蕩培養(yǎng)大約20小時，所述LB培養(yǎng)基含25mg/ml氨芐青霉素和0.5-2mM的IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。接著，測定光密度，然后離心細胞懸液并測定澄清的上清液中的水蛭素。
歐洲專利0 448 093中記載的Ala-水蛭素通過該專利所記載的分泌突變體WCM100中質粒pCM7053的表達與Refludan的表達平行進行。這使得直接進行表達率的比較成為可能。
如美國專利5,616,476中記載的，能夠進行大規(guī)模的表達。Refludan然后能夠通過該專利的實施例5和6中描述的方法來純化。
實施例12水蛭素濃度的測定通過GrieBbach等的方法(血栓形成研究(Thrombosis Research)37，347-350，1985)進行水蛭素濃度的測定。為了達到這個目的，在測量系列中包括確定量的Refludan標準品以建立校準曲線。因而可以直接以mg/l表述產(chǎn)率。表1編碼水蛭素的DNA序列以及翻譯成的氨基酸1 CTTACGTATACTGACTGCACTGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGATCTAAC60L T Y T D C T E S G Q N L C L C E G S N -61 GTTTGCGGCCAGGGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTT 120V C G Q G N K C I L G S D G E K N Q C V -121 ACTGGCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCCT 180T G E G T P K P Q S H N D G D F E E I P -181 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGCTCGTCGACCTGCAGCCCAAGCTT227(SEQ ID NO.22]E E Y L Q * * ----------------------------[SEQ ID NO.23]
表2
序列表<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH<120>用于由大腸桿菌分泌到培養(yǎng)基中來制備Leu-水蛭素的信號序列<130>1999/L055<140>DE 19944870.1<141>1999-09-18<150>19944870.1<151>1999-09-18<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>1tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31<210>2<211>54<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>2tggcactggc aggtttcgct accgtagcgc aagcccttac gtatactgac tgca 54<210>3<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>3ttttttgaat tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57<210>4<211>58<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>4ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58<210>5<211>56<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>5ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctcttat tgccgc 56<210>6<211>61<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>6gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgta tactgactgc 60a 61<210>7<211>59<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>7ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcggttgc cgtcgcagc 59<210>8<211>63<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>8ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg tatactgact 60gca63<210>9<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>9ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 60<210>10<211>61<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>10ctgatcccgt tctttgcagc gttctgcctg ccggttttcg cgcttacgta tactgactgc 60a 61<210>11<211>56<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>11ttttttgaat tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt ctttgc 56<210>12<211>53<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>12gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact gca 53<210>13<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>13ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttc 57<210>14<211>53<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>14gctgagctgc ctgatcaccc cggtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 53<210>15<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>15ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc 57<210>16<211>64<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>16ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtatactgac 60tgca 64<210>17<211>65<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>17ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60atggc 65<210>18<211>55<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>18tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgctcttac gtatactgac tgcac 55<210>19<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>19ttttgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 60<210>20<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>20cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ccttacgtat actgactgca 60<210>21<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>21ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 57<210>22<211>267<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述基因<400>22cttacgtata ctgactgcac tgaatctggt cagaacctgt gcctgtgcga aggatctaac 60tytdctsgnc cgsngtttgc ggccagggta acaaatgcat ccttggatcc gacggtgaaa 120agaaccagtg cgttvcggnk cgsdgkncva ctggcgaagg taccccgaaa ccgcagtctc 180ataacgacgg cgacttcgaa gagatccctt ggtkshndgd gaggaatacc ttcagtaata 240gagctcgtcg acctgcagcc caagctt 267<210>23<211>5<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述肽<400>23Glu Glu Tyr Leu Gln1 5<210>24<211>30<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>24Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser1 5 10 15Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gln Thr Ile Ala
202530<210>25<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>25Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20<210>26<211>22<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>26Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Ser Phe Gly Val Leu Ala20<210>27<211>25<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>27Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala20 25<210>28<211>25<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>28Met Lys Lys Met Asn Leu Ala Val Cys Ile Ala Thr Leu Met Gly Thr1 5 10 15Ala Gly Leu Met Gly Thr Ala Val Ala20 25<210>29<211>23<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>29Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala1 5 10 15Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala20<210>30<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>30Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr1 5 10 15Pro Val Thr Lys Ala20<210>31<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>31Met Lys Gln Ser Ala Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Ile Thr1 5 10 15Pro Val Ser Gln Ala20<210>32<211>27<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>32Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala20 25<210>33<211>24<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信號<400>33Met Ser Phe His His Arg Val Phe Lys Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Leu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala20
權利要求
1.一種含有一種信號序列的水蛭素前體，該信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、熒光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列，所述信號序列上具有C-端連接的Leu-水蛭素的序列。
2.如權利要求1所述的水蛭素前體，其中所述信號序列選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號序列。
3.一種制備Leu-水蛭素的方法，其中如權利要求1或2所述的水蛭素前體以中間體的形式存在，其中，(a)制備一種含有編碼水蛭素前體的DNA序列的表達質粒；(b)在適當?shù)拇竽c桿菌細胞中表達得自于(a)的表達質粒；(c)水蛭素前體從大腸桿菌中分泌出來并同時被加工；和(d)從培養(yǎng)基中分離Leu-水蛭素。
4.如權利要求1或2所述的水蛭素前體用于制備Leu-水蛭素的用途。
5.如權利要求4所述的水蛭素前體的用途，其被用于如權利要求3所述的方法中。
6.一種尋找用于在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的合適信號肽的方法，其中(a)在大腸桿菌中表達水蛭素或一種水蛭素衍生物，該水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其與一種待測信號肽進行N-端連接的N末端具有一個確定的氨基酸aax；(b)通過測定培養(yǎng)上清液中的水蛭素活性來確定表達率；(c)采用各種信號肽重復步驟(a)和(b)；(d)通過比較由步驟(b)中測到的水蛭素活性表示的表達率來選擇合適的信號肽。
7.水蛭素或一種水蛭素衍生物用于尋找一種信號肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一個確定的氨基酸aax，所述信號肽能夠有效分泌一種由所述信號肽和任何其它目的蛋白組成的前體蛋白并且同時去除源于大腸桿菌的信號肽，所述目的蛋白具有N-末端氨基酸aax。
8.如權利要求7所述的方法，其中aax是亮氨酸。
9.一種通過在大腸桿菌中的分泌表達來制備任何目的蛋白的方法，其中(a)通過如權利要求6所述的方法尋找一種合適的信號肽；(b)在大腸桿菌中表達一種編碼一種前體蛋白的核酸構建體，所述前體蛋白由得自(a)的合適信號肽和目的蛋白組成；和(c)從培養(yǎng)上清液中分離所述的目的蛋白。
10.如權利要求9所述的在大腸桿菌中制備任何目的蛋白的方法，其中所述目的蛋白的N-端氨基酸是亮氨酸，并且所述表達通過一種核酸構建體來進行，所述核酸構建體中的編碼信號肽的序列編碼一種選自粘質沙雷氏菌的外膜蛋白、熒光假單胞菌的oprF蛋白、大腸桿菌的lamb B蛋白和腐敗希瓦氏菌的延胡索酸還原酶的信號肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有一種信號序列和Leu－水蛭素序列的水蛭素前體及其制備方法和用途,并涉及一種尋找用于在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的信號序列的方法和用于在大腸桿菌中分泌表達任何目的蛋白的方法。
文檔編號G01N33/50GK1374970SQ00812955
公開日2002年10月16日 申請日期2000年9月1日 優(yōu)先權日1999年9月18日
發(fā)明者P·哈伯曼, R·班德 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司