專利名稱：用光合生物生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法及其產(chǎn)物和組合物的制作方法
用光合生物生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法及其產(chǎn)物和組合物交叉參考本申請要求美國臨時申請?zhí)?0/971，418、60/971，412(兩者于2007年9月11提 交)、60/973，924(2007年9月20日提交)和61/130，892 (2008年6月2日提交)的權(quán)益， 這些申請通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
燃料產(chǎn)品，如油料、石油化學(xué)產(chǎn)品及對石化產(chǎn)品生產(chǎn)有用的其它物質(zhì)，對它們的需 求不斷增長。當(dāng)今大多數(shù)燃料產(chǎn)品是從化石燃料中生產(chǎn)的，所述化石燃料被認(rèn)為是不可再 生的能量來源，因為它們是有機(jī)物質(zhì)在上百萬年的過程中被連續(xù)的沉積層覆蓋的結(jié)果。也 存在增長的減少對進(jìn)口原油依賴的期望。關(guān)于污染和環(huán)境危害的公共意識也已經(jīng)提高。因 此，對生產(chǎn)燃料產(chǎn)品的替代方法，已經(jīng)存在增長的興趣和需要。所以，對開發(fā)燃料產(chǎn)品的替 代方法存在緊迫的需要，所述燃料產(chǎn)品是可再生的，可持續(xù)的，并且對環(huán)境危害較小。通過引用并入本說明書中提到的所有出版物和專利申請在此通過引用被并入，其程度如同每一 份單獨的出版物或?qū)＠暾埍惶囟ㄇ覇为毜刂该魍ㄟ^引用而并入。發(fā)明概述本文公開的是一種組合物，其包括包含氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子 為所述組合物重量的至少80%，并且其中組合物的δ 13C分布為小于-32%。。在一些情況 下，組合物進(jìn)一步包括異戊二烯單元。對于本文描述的一些組合物來說，氫和碳原子為組合 物重量的至少90%。仍在另外的組合物中，氫和碳原子為組合物重量的至少95%或99%。 而在另外的組合物中，氫和碳原子為組合物重量的100%。在一些情況下，組合物為液體。 在另外的情況下，組合物是燃料添加劑或燃料產(chǎn)品。在一些實施方式中，組合物是萜。在其 他實施方式中，組合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在一些實施方式中，組合物的δ 13C分布小 于-35%。或小于-40%。。在其他情況下，組合物的辛烷值為85-120。仍在其他情況下，組合 物的辛烷值大于90。本文還描述的是包括組合物和燃料成分的燃料產(chǎn)品，所述組合物包括含有氫和碳 原子的分子，其中所述氫和碳原子為所述組合物重量的至少80%，并且其中所述組合物的 δ 13C分布小于-32%。。在一些情況下，燃料成分是調(diào)合燃料，其可以是礦物燃料、燃料調(diào)合 的混合物、汽油、柴油、乙醇、噴氣式發(fā)動機(jī)燃料或其任何組合。仍在另外的情況下，調(diào)合燃 料具有大于-32%。的δ 13C分布。對于本文描述的一些燃料產(chǎn)品來說，燃料成分是燃料添加 劑，其可以是ΜΤΒΕ、抗氧化劑、抗靜電劑、緩蝕劑和它們的任何組合。在一些情況下，組合物 成分進(jìn)一步包括異戊二烯單元。在另一情況下，氫和碳原子為組合物成分重量的至少90%。 仍在另外的情況下，氫和碳原子為組合物成分重量的至少95%或99%。而在另外的情況 下，氫和碳原子為組合物成分重量的100%。對于一些燃料產(chǎn)品來說，組合物成分是萜。在 一些實施方式中，組合物成分為液體。在另外的情況下，組合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在 另一情況下，組合物不是甲烷。本公開進(jìn)一步提供了產(chǎn)生二氧化碳的方法，其包括燃燒組合物因而產(chǎn)生二氧
5化碳，其中所述二氧化碳具有小于_32%。的δ 13C分布。在一些情況下，二氧化碳具有小 于-35%。的δ 13C分布。在另外的情況下，二氧化碳具有小于_40%。的δ 13C分布。燃燒步 驟可以在汽油發(fā)動機(jī)、在柴油發(fā)動機(jī)或在噴氣式發(fā)動機(jī)中進(jìn)行。在一些實施方式中，方法進(jìn) 一步包括從無維管光合生物中提取組合物。公開的方法可以進(jìn)一步包括上調(diào)生物中酶的步 驟，其中所述酶的產(chǎn)物為所述組合物。在一些情況下，所述酶不是自然存在于生物中。本文提供的另外的方法是標(biāo)記組合物的方法，其包括獲得組合物的δ 13C分布的 測量；并且利用該測量標(biāo)記組合物。在一些實施方式中，標(biāo)記包括指示組合物的S13C分布 以及組合物的S 13C分布的測量小于-32%。。在一種情況下，組合物為可以包括燃料成分的 燃料產(chǎn)品。在一些方面，本文描述的方法可以進(jìn)一步包括跟蹤組合物的步驟。在一些情況下， 跟蹤包括1)將未知組合物的碳同位素分布與測量進(jìn)行比較；2)確定組合物的位置，和/ 或3)用計算機(jī)系統(tǒng)檢測所述組合物。本公開也提供了從無維管光合生物產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法，其包括培養(yǎng)無維管光 合生物，其中所述生物產(chǎn)生第一燃料產(chǎn)品；使所述生物與無機(jī)碳源接觸；以及使來自無機(jī) 碳源的碳摻入第一燃料產(chǎn)品中，其中所述第一燃料產(chǎn)品具有小于-32%。的δ 13C分布。在一 些情況下，無機(jī)碳源包括含有13C的二氧化碳和含有12C的二氧化碳。在一些情況下，使生 物與無機(jī)碳源接觸包括使生物與過量的無機(jī)碳源接觸。在一些實施方式中，生物包括一個 或多個核酸，所述一個或多個核酸編碼終產(chǎn)物為第一燃料產(chǎn)品的一種或多種酶。在另外的 實施方式中，核酸是異源的。第一燃料產(chǎn)品可以不是由生物天然產(chǎn)生的。在一些情況下，第 一燃料產(chǎn)品具有小于-32%。的δ 13C分布。在另外的情況下，第一燃料產(chǎn)品包括萜。礦物燃 料無機(jī)碳可以具有大于-32%。的δ 13C分布。在一些實施方式中，第一燃料產(chǎn)品從生物中提 取。第一燃料產(chǎn)品可以經(jīng)歷裂化。在一些情況下，本文的方法進(jìn)一步包括向第一燃料產(chǎn)品 添加燃料成分。在一些情況下，這些方法進(jìn)一步包括燃燒第一燃料產(chǎn)品和產(chǎn)生富S 13C的無 機(jī)碳。在一些情況下，該富S 13C的無機(jī)碳具有小于-32%。的δ 13C分布。本文還提供了出售碳信用額(carbon credit)的商業(yè)方法，其包括獲得組合物 的S13C分布的測量；和將組合物的δ 13C分布與參照δ 13C分布進(jìn)行比較；如果組合物的 δ 13C分布小于參照δ 13C分布，那么出售碳信用額給實體，其中所述實體是組合物的所有者 或使用者。在一些情況下，參照δ 13C分布為大約-32%。。該方法可以進(jìn)一步包括利用測量 標(biāo)記組合物。該方法可以進(jìn)一步包括跟蹤組合物。如本文公開的產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法包括培養(yǎng)無維管光合生物；使所述生物與煙 道氣接觸；將來自所述煙道氣的碳摻入燃料產(chǎn)品中；和從所述無維管光合生物中提取所述 燃料產(chǎn)品。在一些情況下，該方法進(jìn)一步包括基因修飾生物的步驟。在另外的情況下，燃料 產(chǎn)品不是自然存在于生物中。燃料產(chǎn)品可以包括含有氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳 原子為該產(chǎn)物重量的至少90%，并且其中組合物的δ 13C分布為小于-32%。。在一些情況 下，方法包括精煉燃料產(chǎn)品的步驟。在一種情況下，精煉包括選自下述的至少一種方法加 氫裂解、催化裂化、蒸汽裂解、裂化、分餾、蒸餾、加氫處理和其任何組合。附圖簡述本發(fā)明的許多新特征在所附的權(quán)利要求中具體闡明。參考下面提出說明性實施方 式——其中使用了許多本發(fā)明的原理——的詳細(xì)描述，和附圖，將使本發(fā)明的示例性特征和益處得到更好的理解，在附圖中

圖1是核酸構(gòu)建物的圖示。圖2示出了用苧烯合酶轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻(C. reinhardtii)的蛋白質(zhì)印跡分析。圖3示出了用苧烯合酶轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻的氣相色譜_質(zhì)譜分析。圖4示出了用FPP合酶和倍半萜合酶轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻的蛋白質(zhì)印跡分析。圖5總結(jié)了測量各種樣品化合物——包括農(nóng)作物植物、氣體樣品、原油以及藻類樣 品的S 13C分布的實驗結(jié)果。發(fā)明詳述I.產(chǎn)品本文公開的是涉及利用光合生物制造產(chǎn)品的組合物和方法。產(chǎn)品的實例包括但不 限于，燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品以及殺蟲劑產(chǎn)品。產(chǎn)品可以是釋放分子儲存能量的任何物質(zhì)。在 一個實施方式中，產(chǎn)品是有機(jī)分子。在另一實施方式中，產(chǎn)品是烴。在一些情況下，產(chǎn)品不 包括氫。在一些情況下，產(chǎn)品不包括氧。在一些情況下，產(chǎn)品不包括抗體或蛋白質(zhì)。在一些 情況下，產(chǎn)品不包括脂肪酸。燃料產(chǎn)品的實例包括石化產(chǎn)品和它們的前體以及可能石化工業(yè)中有用的所有其 它物質(zhì)。燃料產(chǎn)品包括，例如，石油產(chǎn)品和石油產(chǎn)品的前體，以及它們的石化產(chǎn)品和前體。燃 料產(chǎn)品可以用于產(chǎn)生用于石化工業(yè)的物質(zhì)或材料，包括石油產(chǎn)品和石化產(chǎn)品。燃料或燃料 產(chǎn)品可以用于燃燒器如鍋爐、窯爐、干燥機(jī)或熔爐。燃燒器的其它實例是內(nèi)燃機(jī)如汽車引擎 或發(fā)電機(jī)，包括汽油發(fā)動機(jī)、柴油發(fā)動機(jī)、噴氣式發(fā)動機(jī)及其它。燃料產(chǎn)品也可以被用于生 產(chǎn)塑料、樹脂、纖維、高彈體、潤滑劑和凝膠。本文考慮的產(chǎn)品的實例包括烴產(chǎn)品和烴衍生物產(chǎn)品。烴產(chǎn)品是只由氫分子和碳分 子組成的產(chǎn)品。烴衍生物產(chǎn)品是具有一個或多個雜原子的烴產(chǎn)品，其中雜原子為不是氫或 碳的任何原子。雜原子的實例包括但不限于，氮、氧、硫和磷。一些產(chǎn)品是富烴的，其中按重 量計，產(chǎn)品的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%由碳和氫組成。在一個實施方式 中，產(chǎn)品是按重量計100%的碳和氫原子。在一些實施方式中，產(chǎn)品包括萜。在其它的實施 方式中，產(chǎn)品包括脂肪酸或脂肪酸甲酯。燃料產(chǎn)品如烴，可以是通常源自原油或石油的前體或產(chǎn)品，例如，但不限于，液態(tài) 石油氣、石腦油(naptha)(輕石油)、汽油、煤油、柴油、潤滑油、重瓦斯(heavy gas)、焦炭、 浙青、焦油和蠟。例如，燃料產(chǎn)品可以包括小的烷類(例如，1至大約4個碳)如甲烷、乙烷、 丙烷或丁烷，其可以用于加熱(如在烹飪中)或制造塑料。燃料產(chǎn)品也可以包括具有大約 5至大約9個碳原子的碳主鏈的分子，如石腦油或輕石油，或它們的前體。其它的燃料產(chǎn)品 可以是用作汽油或發(fā)動機(jī)燃料的大約5至大約12個碳原子或環(huán)烷。大約10至大約18個 碳的分子或芳香族如煤油或其前體，也可以是燃料產(chǎn)品。燃料產(chǎn)品也可以包括具有大于12 個碳的分子或它們的前體，如用于潤滑油。其它的燃料產(chǎn)品包括中重瓦斯或燃料油，或它們 的前體，典型地包括烷、環(huán)烷和大約20至大約70個碳原子的芳香族化合物。燃料產(chǎn)品也包 括來自原油的其它殘余物，如焦炭、浙青、焦油和蠟，其一般包含具有大約70或更多個碳的 多個環(huán)，和它們的前體。多種燃料產(chǎn)品可以通過多步加工進(jìn)一步精煉成用于終端用戶的終產(chǎn)品。精煉可以 通過分餾發(fā)生。例如，燃料產(chǎn)品的混合物，如具有不同的多種鏈長度的不同烴的混合物可以通過分餾被分離成多種成分。精煉也可以包括下列步驟的一個或多個裂化、整合(unifying)或改變?nèi)剂袭a(chǎn) 品。大的燃料產(chǎn)品，如大的烴類(例如，3C10)，可以通過裂化分解成更小的片段。裂化可 以通過加熱或高壓，如蒸汽、減粘裂化或焦化進(jìn)行。燃料產(chǎn)品也可以通過減粘裂化，例如，降 低重油的粘度進(jìn)行精煉。精煉也可以包括焦化，其中產(chǎn)生重的、幾乎純的碳?xì)堄?。裂化也?以通過催化方法進(jìn)行，以通過使用催化劑，例如但不限于沸石、水合硅酸鋁、礬土或二氧化 硅-氧化鋁來提高裂化反應(yīng)的速度。催化可以是流化催化裂化，由此，熱催化劑如沸石被用 于催化裂化反應(yīng)。催化也可以通過加氫裂解進(jìn)行，其中與流體催化裂化比較，一般使用更低 的溫度。加氫裂解典型地在升高的氫分壓的存在下發(fā)生。燃料產(chǎn)品可以通過催化裂化進(jìn)行 精煉以產(chǎn)生柴油、汽油和/或煤油。精煉也可以包括加氫處理。燃料產(chǎn)品也可以通過在整合步驟中將它們結(jié)合進(jìn)行精煉，例如，通過使用催化劑， 如鉬或鉬-錸混合物。整合過程典型地產(chǎn)生氫氣，其是可以用于裂化的副產(chǎn)品。燃料產(chǎn)品也可以通過將烴類改變或重排或重建成更小的分子來進(jìn)行精煉。存在許 多化學(xué)反應(yīng)，其發(fā)生在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的催化重整過程中。一般而言，催化重整在催化 劑和高的氫分壓的存在下進(jìn)行。一種普通的方法是烷基化。例如，丙烯和丁烯與催化劑如 氫氟酸或硫酸混合。燃料產(chǎn)品也可以被混合或組合成混合物以獲得終產(chǎn)物。例如，燃料產(chǎn)品可以被混 合以形成不同等級的汽油、含有或不含添加劑的汽油、不同重量和等級的潤滑油、不同等級 的煤油、噴氣式發(fā)動機(jī)燃料、柴油燃料、加熱油(heating oil)和制造塑料和其它聚合物的 化學(xué)品。本文描述的燃料產(chǎn)品的組合物可以與通過其它方法產(chǎn)生的燃料產(chǎn)品進(jìn)行組合或混
I=I ο本文公開的是包含下列的組合物包含氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子 為組合物重量的至少80%，并且其中所述組合物的δ 13C分布為小于-32%。。在一些情況 下，組合物進(jìn)一步包括異戊二烯單元。在一些情況下，組合物包括萜。在一些情況下，組合 物進(jìn)一步包括三酸甘油酯或脂肪酸。對于本文描述的一些組合物來說，氫和碳原子為組合 物重量的至少90%。例如，生物柴油或脂肪酸甲酯(其具有按重量計小于90%的氫和碳原 子)可以不是組合物的部分。仍在其它的組合物中，氫和碳原子為組合物重量的至少95% 或99%。而在其它組合物中，氫和碳原子為組合物重量的100%。在一些情況下，組合物為 液體。在其它情況下，組合物為燃料添加劑或燃料產(chǎn)品。在一些實施方式中，組合物是萜。 在其它實施方式中，組合物不是脂肪酸或脂肪酸酯。在另一實施方式中，組合物不是甲烷。 在一些實施方式中，組合物的S 13C分布為小于-35%。，或小于-40%。、-45%。、-50%。、-55% 或-60%。。在其它情況下，組合物的辛烷值為大約85-120。仍在其它的情況下，組合物的辛 烷值為大于90。碳固定是自養(yǎng)生物，例如，由光合作用驅(qū)動的生物的過程，由此無機(jī)碳被轉(zhuǎn)化為有 機(jī)物質(zhì)?？栁难h(huán)(Calvin Cycle)是最常見的碳固定方法。高等植物中的碳固定包括光 合作用過程中一些類型的碳固定。C3固定是來自植物的這樣的過程，其利用卡爾文循環(huán)作 為將無機(jī)碳摻入有機(jī)物中的初始步驟，形成3-碳化合物作為第一穩(wěn)定的中間體。大多數(shù)闊 葉植物和處于溫帶的植物都是C3。C4固定包括這樣的植物，其以無機(jī)碳摻入4-碳化合物 的反應(yīng)作為卡爾文循環(huán)的開端。C4植物可以具有不同的葉解剖學(xué)。C4途徑可以在具有強(qiáng)陽光的熱帶區(qū)域發(fā)現(xiàn)。熱帶的草，如甘蔗和玉米，是C4植物，但是有許多C4闊葉植物。一 些植物利用景天酸代謝(CAM)作為對干旱條件的適應(yīng)。夜間進(jìn)入氣孔的二氧化碳被轉(zhuǎn)化成 有機(jī)酸，其當(dāng)氣孔關(guān)閉時釋放二氧化碳，用于在白天的卡爾文循環(huán)。綠色植物和一些仙人掌 種類是CAM植物的實例。除了卡爾文循環(huán)，目前已知一些自養(yǎng)微生物利用一些其它的替代途徑來固定碳。 反向三羧酸循環(huán)(Krebs cycle)可以被描述為反向進(jìn)行的檸檬酸循環(huán)，并且例如，被一些無 機(jī)光能自養(yǎng)真細(xì)菌和一些化能無機(jī)自養(yǎng)硫酸鹽還原菌利用。還原乙酰輔酶A (CoA)途徑在 產(chǎn)甲烷古細(xì)菌和產(chǎn)乙酸菌以及一些硫酸鹽還原真細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)作為固定碳的途徑。3-羥基 丙酸鹽途徑在綠彎菌(Chloroflexus)屬的無機(jī)光能自養(yǎng)生長真細(xì)菌中和在一些化能無機(jī) 自養(yǎng)生長古細(xì)菌的改良形式中被發(fā)現(xiàn)作為固定碳的途徑。在一些情況下，本文考慮的產(chǎn)物(如燃料產(chǎn)品)包括一個或多個源自無機(jī)碳源的 碳。在一個實施方式中，如本文描述的，產(chǎn)物的碳的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 %、90 %、95 %或99 %源自無機(jī)碳源。無機(jī)碳源的實例包括但不限于，二氧化碳、碳 酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸。產(chǎn)物可以是這樣的有機(jī)分子，其具有來自在光合作用期間固定的無 機(jī)碳源的碳。本文的產(chǎn)物可以通過其碳同位素分布(Carbon Isotope Distribution(CID))進(jìn) 行描述。在分子水平，CID是分子內(nèi)的單個碳原子為天然存在的碳同位素(例如，12C、13C 或14C)之一的統(tǒng)計學(xué)可能性。在產(chǎn)物的批量水平，CID可以是含有至少一個碳原子的化合 物中天然存在的碳同位素(例如，12C、13C或14C)的相對多度。雖然注意到每一種礦物燃料 的CID可以根據(jù)其來源而不同，但是CID(fos)(例如，礦物燃料如石油、天然氣和煤中碳的 CID)可與CID(atm)(例如，當(dāng)前大氣二氧化碳中碳的CID)相區(qū)別。另外，CID(photo-atm) 是指近期歷史中光合作用產(chǎn)生的碳基化合物的CID，其中無機(jī)碳源是大氣壓中的二氧化碳。 CID(photo-fos)是指近期歷史中光合作用產(chǎn)生的碳基化合物的CID，其中基本上所有無機(jī) 碳的來源都是由礦物燃料(例如煤、天然氣和/或石油)的燃燒產(chǎn)生的二氧化碳。精確分布也是下述的特征1)產(chǎn)生分子的光合生物的類型和2)無機(jī)碳的來源。這 些同位素分布可以用于限定光合作用來源的燃料產(chǎn)品的組成。碳同位素在不同的化合物之間和之中不均勻分布并且同位素分布可以揭示碳轉(zhuǎn) 化所涉及的物理、化學(xué)和代謝過程的信息。光合生物組織中13C相對于12C的總多度一般小 于大氣二氧化碳的碳的多度，這表示碳同位素區(qū)別(carbon isotope discrimination)發(fā) 生在二氧化碳摻入光合作用生物質(zhì)時。大氣二氧化碳包含大約1. 的非放射性同位素13C和98. 9%的12C。在光合作用 期間，植物由于質(zhì)量不同所賦予的化學(xué)和物理特性的微小不同而排斥13C。在一些情況下， 這種排斥可以被用于將植物分成不同的光合作用組。在本文的一個實施方式中，該排斥被 用于確定提取自光合作用生物的烴源。二氧化碳的13C含量可以用專門設(shè)計用于高精度測量比率R的質(zhì)譜儀測定，通過下 式定義比率R
13CR=—
12C在一些情況下，在分析之前，可以例如通過燃燒將產(chǎn)物、光合生物或其它材料轉(zhuǎn)化
9為二氧化碳。在另一實例中，提取自光合生物的各個化合物通過化學(xué)或酶降解轉(zhuǎn)化成二氧 化碳。在許多天然材料(例如植物、動物和礦物)中，R為大約0.0112，具有小的方差或偏差。Rtis值可以被轉(zhuǎn)化成δ 13C的值，其中
S13C=[R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)]-1x1000其中是獲自石灰石的二氧化碳的標(biāo)準(zhǔn)，該石灰石被稱為PDB，其來自南卡羅萊 納州的Pee Dee地層，其中R = 0.01124。如本文公開的，所有指示δ的組合物都是相對于 PDB。δ 13C的單位是每千分之一(本文也稱為％。)。δ 13C的負(fù)值越大，表示組合物具有 越多的12C (例如，質(zhì)量越輕)，而δ 13C正值越大，表示組合物具有越多的13C (例如，質(zhì)量越 重)。大多數(shù)天然材料具有負(fù)的S 13C值，因為它們含有比PDB標(biāo)準(zhǔn)更少的13C。在水生光合生物中測量的碳同位素組合可以在-11%。and-39%。之間的范圍，這可 能導(dǎo)致錯誤的印象——C3和C4光合作用途徑都存在于水生植物。已經(jīng)開發(fā)了測定水生光 合生物中碳固定的量的模型。在一個實施方式中，從水生光合生物中提取組合物并且純化。 在一個實施方式中，從水生光合生物中產(chǎn)生組合物，其中所述組合物從所述生物中提取并 純化，并且燃料產(chǎn)品具有小于-32%。的S13C。光合生物含有的13C少于大氣中的13C,原因是與二氧化碳攝取有關(guān)的物理和化學(xué) 過程排斥13c。這種排斥的發(fā)生是由于13C重于12c，并且可以形成略微更強(qiáng)的化學(xué)鍵。此外， 由于質(zhì)量上的差異，13CO2的擴(kuò)散可以比12CO2的擴(kuò)散更慢。由于水生光合生物光合作用中擴(kuò)散的重要性，水生光合生物的δ 13C值比陸生植 物的S13C值更難以獲知。溶于水中的無機(jī)碳的分散比空氣中無機(jī)碳的擴(kuò)散慢數(shù)個數(shù)量級。 例如，在水生光合生物中，無機(jī)碳擴(kuò)散可能成為生物的同位素分餾的限制。雖然空氣中二氧 化碳的S13C值相對恒定，但溶解的二氧化碳的δ 13C值是可變的，并且溶解的二氧化碳與溶 解碳酸氫鹽有大約9%。的不同。研究已經(jīng)顯示，在具有混合和容易獲得的無機(jī)碳源的快速流 動的流中，混合和擴(kuò)散都不是水生光合生物的同位素分餾的速度限制。然而，在緩慢流動的 水中，已經(jīng)顯示同位素分餾是小的，表明無機(jī)碳擴(kuò)散是限制的同位素分餾。游離大氣的同位素組成也發(fā)生變化，緩慢地耗盡13C。逐步減少δ 13C由人為的燃 燒礦物燃料引起。從1956至1982，大氣中二氧化碳的δ 13C已經(jīng)從-6. 7%0 (在314ppm)降 低到-7. 9%0 (在 342ppm)。在正常的陸地光合作用中，由碳固定制造的碳化合物具有這樣的CID，其相對于無 機(jī)碳源富集12C。而且，CID(photo-fos)將具有比CID(ph0t0-atm)高的12C百分比。利用 礦物燃料源(其已經(jīng)通過遠(yuǎn)古的光合作用循環(huán)富集12C)從光合作用制備的化合物中的碳， 甚至?xí)ㄟ^另外的光合作用循環(huán)進(jìn)一步富集12c。14C是地球大氣中產(chǎn)生的碳的放射性同位素。14C的半衰期為大約5，730年。結(jié) 果，由于礦物燃料中無機(jī)碳已經(jīng)被隔離了數(shù)百萬年并且實質(zhì)上所有的14C已經(jīng)衰變，所 以CID(atm)具有比CID(fos)高得多的14C百分比。相似地，CID(photo-atm)具有比 CID(photo-fos)高得多的14C百分比，這反映了無機(jī)碳源中14C的差異。因此，CID(atm)具有比CID(fos)更高的14C百分比。此外，由于礦物燃料中天然存在的烴分子一般不是烯烴，所以石油源烴分子中的 碳立構(gòu)中心的分布接近外消旋混合物。因而，產(chǎn)物(例如燃料產(chǎn)品)可以是基本上純的或純的物質(zhì)，其具有至少兩個碳原 子、至少一個碳-碳鍵和以光合作用產(chǎn)生的物質(zhì)的CID特征，其中無機(jī)碳源是礦物燃料。在 一些情況下，該物質(zhì)可以具有至少一個雙鍵和/或具有獨特的立體化學(xué)/為非外消旋混合 物。產(chǎn)物可以為不是由光合生物如無維管的、真核光合生物自然產(chǎn)生的。產(chǎn)物也可以 是由重組生物如重組無維管的、真核光合生物產(chǎn)生的。在一些情況下，產(chǎn)物也包括氫原子，和任選地一個或多個雜原子如氧、氮和/或硫 原子。物質(zhì)中的碳原子可以具有這樣的同位素分布(例如％12C、%13c, %14c的)，其富 集12c，例如，水平與當(dāng)來自無機(jī)源的碳原子(例如，來自二氧化碳、碳酸鹽或碳酸)在光合 作用(例如無維管生物的)期間被固定時發(fā)生的碳同位素分餾過程一致。因此，產(chǎn)物如燃料產(chǎn)品可以直接從無機(jī)碳源(例如，從二氧化碳、碳酸鹽或碳酸)、 水和電磁輻射合成。該合成通過基因修飾的無維管光合生物執(zhí)行。修飾的生物包含一個或 多個對該生物異源的核酸。該異源核酸編碼一種或多種酶，所述酶的終產(chǎn)物是諸如燃料產(chǎn) 品的產(chǎn)物。燃料產(chǎn)品不是由生物自然產(chǎn)生的。終產(chǎn)物中的碳原子可以至少50%、90%、99% 或全部源自進(jìn)入細(xì)胞的無機(jī)碳源(例如，二氧化碳、碳酸鹽或碳酸)。燃料產(chǎn)品的合成通過 光合作用(例如，光驅(qū)動的碳固定)實現(xiàn)。在光合作用期間，來自無機(jī)源的碳原子被固定到有機(jī)碳分子中。進(jìn)行固定的化學(xué) 過程，如卡爾文-本森循環(huán)(Calvin-Benson Cycle)中RuBisCO酶的作用，有利于某些同位 素的摻入。例如，12C相對于13C優(yōu)先固定。因此，光合作用產(chǎn)生的有機(jī)碳分子富集12C。由這 種分餾過程引起的同位素的分布是光合作用來源的分子的特征。RuBisC0(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)是在加爾文循環(huán)中催化碳固定的 酶。碳固定是這樣的過程，通過該過程，使得大氣二氧化碳的原子可用于生物，形式為富能 量的分子如蔗糖。RuBisCO催化核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)與二氧化碳或氧的羧化作用或
氧合作用。RuBisCO可能是世界上最豐富的蛋白質(zhì)。RuBisCO催化無機(jī)碳進(jìn)入生物圈的化學(xué) 反應(yīng)。RuBisCO也是高等植物的葉中最豐富的蛋白質(zhì)。在一個實施方式中，如本文描述的生 物可以被基因修飾以調(diào)節(jié)生物中RuBisCO的產(chǎn)生。在植物、藻類、藍(lán)細(xì)菌以及向光性和化能自養(yǎng)變形菌中，RuBisCo通常由兩種類型 的蛋白亞基——稱為大鏈(大小大約為55kDa)和小鏈(大小大約為13kDa)組成。酶促活 性底物RuBP結(jié)合位點位于形成二聚體的大鏈中，其中來自每一個大鏈的氨基酸促成結(jié)合 位點。全部8個大鏈二聚體和8個小鏈裝配成大約540kDa的較大復(fù)合物。在一些變形菌 和溝鞭藻類(dinoflagellates)中，只由大的亞基組成的酶可以存在。鎂離子對于酶促活 性是必需的。鎂離子在酶活性位點中的正確定位涉及將活化二氧化碳分子添加到活性位點 中的賴氨酸，從而形成氨基甲酸酯。氨基甲酸酯的形成受益于堿性PH。流體區(qū)室(例如，葉 綠體基質(zhì))中的PH和鎂離子濃度在光下增加。在一個實施方式中，鎂離子可以在光合生物 的生長過程中添加。
在碳固定期間，RuBisCO的底物分子是RuBP、底物二氧化碳(例如，不同于活化的 二氧化碳)和水。RuBisCO也可以使反應(yīng)與分子氧而不是與底物二氧化碳發(fā)生。在一些情 況下，底物二氧化碳是來自煙道氣的二氧化碳。當(dāng)二氧化碳是底物時，羧化酶反應(yīng)的產(chǎn)物是高度不穩(wěn)定的六碳磷酸化的中間產(chǎn) 物，稱為3-酮基-2-羧基阿拉伯糖醇(carboxyarabinitol) 1,5- 二磷酸，其實際上瞬間分 解成兩個3-磷酸甘油酸分子。3-磷酸甘油酸可以被用于產(chǎn)生較大的分子如葡萄糖。當(dāng)分子 氧是底物時，加氧酶反應(yīng)的產(chǎn)物是磷酸羥乙酸和3-磷酸甘油酸。磷酸羥乙酸開始一系列稱 為光呼吸的反應(yīng)，其涉及位于線粒體和過氧化物酶體中的酶和細(xì)胞色素。在該過程中，兩個 磷酸羥乙酸分子被轉(zhuǎn)化成一個二氧化碳分子和一個3-磷酸甘油酸分子——其可以重新進(jìn) 入卡爾文循環(huán)。進(jìn)入該途徑的一些磷酸羥乙酸可以被植物保留以產(chǎn)生其它分子如甘氨酸。 在二氧化碳和氧的空氣水平，反應(yīng)物的比例為大約4 1，這導(dǎo)致僅僅3. 5的凈二氧化碳固 定。因而，酶沒有能力防止與氧反應(yīng)大大減小了許多植物的光合作用潛能。通過設(shè)計增加 酶周圍二氧化碳濃度的方法——包括C4碳固定、景天酸代謝，和使用淀粉核，一些植物、許 多藻類和光合細(xì)菌已經(jīng)克服了這種局限性。在一個實施方式中，光合生物被基因修飾以產(chǎn)生或上調(diào)RuBisCO途徑中的酶或 RuBisCO本身的產(chǎn)生。例如，生物可以隨后產(chǎn)生具有較低δ 13C分布的有機(jī)產(chǎn)物，例如本文 中描述的燃料產(chǎn)品。一些酶每秒鐘可以進(jìn)行數(shù)百萬次化學(xué)反應(yīng)。但是，RuBisCO是緩慢的，每秒鐘僅能 夠固定大約3個無機(jī)碳分子。然而，由于在光合生物中高濃度的RuBisCO，在大多數(shù)情況下， 以及在光不是另外限制光合作用時，RuBisCO反應(yīng)對不斷增加的二氧化碳濃度積極響應(yīng)，因 此，無機(jī)碳的濃度是限制性的?？栁难h(huán)的最終速度限制因子是RuBisCO，其不能由任何 其它因子在短時間內(nèi)改善。在一個實施方式中，以濃度不是限制性的并且由RuBisCO進(jìn)行 的碳固定可以繼續(xù)的足夠高的濃度將無機(jī)碳提供給光合生物。在一些情況下，由于卡爾文循環(huán)中幾種其它的酶的調(diào)節(jié)，在白天，RuBisCO通常具 有活性，因為RuBP不是在黑暗中產(chǎn)生的。此外，RuBisCO的活性以幾種方式與卡爾文循環(huán) 中其它酶的活性相配合。一旦照明葉綠體，由于跨類囊體膜產(chǎn)生的質(zhì)子梯度，基質(zhì)的PH從 7.0升至8.0。同時，鎂離子流出類囊體，增加了葉綠體基質(zhì)中的鎂濃度。RuBisCO具有高的 最佳pH(可以是>9.0，取決于鎂離子濃度)并且因此由于二氧化碳和鎂加入到活性位點而 變得活化，如本文描述的。在一個實施方式中，燃料產(chǎn)品可以由僅在光條件下生長的生物產(chǎn) 生。在本文方法的另一實施方式中，生物的生長培養(yǎng)基的PH可以調(diào)節(jié)。在一些情況下，需要另一種酶，RuBisCO活化酶(activase)，以使氨基甲酸酯在 RuBisCO的活性位點快速形成。需要活化酶是因為RuBP底物能夠更強(qiáng)烈地結(jié)合到缺乏氨基 甲酸酯的活性位點并且可以使活化過程慢下來。在光下，RuBisCO活化酶促進(jìn)抑制性RuBP 或一些觀點認(rèn)為是儲存RuBP從催化位點釋放。在一些植物(例如，煙草和許多豆類)中，也 需要活化酶，因為在黑暗中，RuBisCO被由這些植物合成的競爭性抑制劑——一種底物類似 物2-羧基-D-阿拉伯糖醇1-磷酸(CAlP)所抑制。CAlP緊緊地與氨基甲?；腞uBisCO 的活性位點結(jié)合并且抑制催化活性。在光下，RuBisCO活化酶也促進(jìn)CAlP從催化位點釋放。 在CAlP從RuBisCO釋放之后，其迅速地被光激活的CAlP-磷酸酶轉(zhuǎn)化成非抑制性的形式。 最后，一旦每隔幾百次反應(yīng)，則與二氧化碳或氧的正常反應(yīng)不被完成，而其它的抑制性底物類似物在活性位點形成。再一次，RuBisCO活化酶可以促進(jìn)這些類似物從催化位點釋放并 且保持該酶處于催化活性形式。活化酶的特性能夠限制高溫下植物的光合潛能。也已經(jīng)顯 示CAlP保持RuBisCO處于免于蛋白酶解的構(gòu)象。在一些實施方式中，RuBisCO活化酶可以 由光合生物上調(diào)。例如，生物可以被基因修飾以產(chǎn)生更多的RuBisCO活化酶。由于二氧化碳和氧在RuBisCO的活性位點競爭，所以可以通過增加含RuBisCO的 區(qū)室(例如，葉綠體基質(zhì))中二氧化碳水平來增強(qiáng)由RuBisCO進(jìn)行的碳固定。在一個實施 方式中，對生產(chǎn)燃料產(chǎn)品的光合生物進(jìn)行修飾可以增加基質(zhì)中的二氧化碳水平。當(dāng)RuBisCO 用氧作為底物時，這種過程可以是用于防止高光通量時段期間過載的機(jī)制。例如，當(dāng)氧與二 氧化碳的比達(dá)到這樣的閾值一一在該閾值，氧而不是碳被固定——時，處于亮光中的光合 生物可以具有零凈碳固定。在一個實施方式中，過多的無機(jī)碳可以被提供給光合生物，以便 光和溫度對于生物內(nèi)的碳固定是非限制性的。由于RuBisCO通常是植物中光合作用的速率限制，在本文的實例中，光合作用效 率可以通過修飾光合生物中的RuBisCO基因以增加其催化活性和/或減少氧化活性的比率 得到提高。在一個實施方式中，來自一種編碼RuBisCO的生物的異源核酸被轉(zhuǎn)化到另一光 合生物中。例如，修飾生物以產(chǎn)生具有小于-32%。的δ 13C的燃料產(chǎn)品可以包括增加RuBisCO 亞基的表達(dá)水平。在另一情況下，RuBisCO小鏈可以從葉綠體DNA表達(dá)。在另一實施方式 中，例如，編碼RuBisCO的核酸可以被修飾或改變，例如，以增加對二氧化碳的特異性或另 外增加碳固定的速率。在一個實施方式中，具有天然高特異性值——例如沒有來自紅藻Galdieria partita的限制的RuBisCO變體可以被轉(zhuǎn)化到光合生物中，用于生產(chǎn)具有一定量碳固定的 燃料產(chǎn)品。例如，通過提高生物中RuBisCO的特異性或碳固定，可能提高光合生物的光合效 率或生長。在一個實施方式中，水生光合生物與無機(jī)化合物源接觸，其中所述生物產(chǎn)生燃料 產(chǎn)品。無機(jī)碳源可以來自礦物燃料。例如，燃燒礦物燃料可以產(chǎn)生無機(jī)碳，其可以被提供該 水生光合生物。礦物燃料的燃燒可以產(chǎn)生煙道氣。煙道氣是經(jīng)由用于輸送來自壁爐、烤爐、 火爐、鍋爐或蒸汽發(fā)生器的廢氣的煙道例如管道或通道而排放到大氣中的氣體。在一個實 施方式中，煙道氣是指在發(fā)電廠產(chǎn)生的燃燒廢氣。煙道氣的組成取決于所燃燒的物質(zhì)，但是 主要可以由源自燃燒空氣的氮(一般大于三分之二)、二氧化碳和水蒸氣以及過量氧(也源 自燃燒空氣)組成。例如，對于在發(fā)電廠燃燒每噸油或煤燃料來說，煙道氣包含3至3. 5頓 二氧化碳。煙道氣可以是空氣污染物。在一個實施方式中，煙道氣包括二氧化碳，其δ 13C大于大氣二氧化碳的S13C。當(dāng) 水生光合生物與煙道氣接觸時(例如，通過使煙道氣鼓泡穿過生物反應(yīng)器或池)，水生光合 生物產(chǎn)生的有機(jī)碳可以具有接近煙道氣體二氧化碳的W。然而，如本文所述，無機(jī)碳源 進(jìn)入有機(jī)分子的生物碳固定可能受到無機(jī)碳源到生物中的擴(kuò)散限制。生物中碳固定的擴(kuò)散 限制在水生物種中是顯著的。例如，如果無機(jī)源僅僅被限制或不能以足夠快的速率擴(kuò)散到 生物中，那么生物不可能在碳固定過程中充分地優(yōu)選12C超過13C。藻類，其通過RuBisCO攝 取二氧化碳，顯示出隨環(huán)境二氧化碳濃度而改變的同位素分餾(例如，Kerby和Raven 1985 Adv. Bot. Res. 11 :71_123)。在實驗室實驗中，當(dāng)二氧化碳有限時，觀察到小的同位素分餾， 其也稱為Δ (有時接近0%。)，當(dāng)二氧化碳濃度高時，觀察到20%?；蚋叩姆逐s。在一些研
13究中，同位素分餾可以在該整個范圍內(nèi)變化，其中大多數(shù)的變化推測是由于二氧化碳利用 率的改變引起。在一種情況，藻類與煙道氣無機(jī)碳源接觸而生長并且產(chǎn)生δ 13C為大約_13%。的燃 料產(chǎn)品。在另一情況，藻類與煙道氣無機(jī)碳源接觸生長并且產(chǎn)生S 13C為大約_22%。的燃料 產(chǎn)品。而在另一情況，藻類與過多的煙道氣無機(jī)碳源接觸生長，以便擴(kuò)散不限制無機(jī)碳的碳 固定，并且該藻類產(chǎn)生S 13C為大約-52%。的燃料產(chǎn)品。在一個實施方式中，任何與過多的 礦物燃料無機(jī)碳源接觸生長的藻類都產(chǎn)生S 13C小于大約-32%。的燃料產(chǎn)品。在一些實施 方式中，過多的無機(jī)碳源是這樣的源，其沒有光合生物內(nèi)碳固定的擴(kuò)散限制。本文也描述的是包含組合物和燃料成分的燃料產(chǎn)品，所述組合物包括含 有氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子為組合物重量的至少80%，并且其中 組合物的S13C分布小于-32%。。在一些實施方式中，組合物的S13C分布小于大 約-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%?；?60%。。在一些情況，燃料成分是調(diào)合燃料，其可以 是礦物燃料、汽油、柴油、乙醇、噴氣式發(fā)動機(jī)燃料或其任何組合。仍在另外的情況下，調(diào)合 燃料具有大于-32%。的δ 13C分布。對于本文描述的一些燃料產(chǎn)品來說，燃料成分是燃料添 加劑，其可以是ΜΤΒΕ、抗氧化劑、抗靜電劑、緩蝕劑和它們的任何組合。在一些情況下，組合 物成分進(jìn)一步包括異戊二烯單元。在另一情況下，組合物包括萜。在一些情況下，組合物包 括三酸甘油酯或脂肪酸。在另外的情況下，氫和碳原子為組合物成分重量的至少90%。例 如，脂肪酸甲酯燃料或生物柴油典型地具有按重量計小于大約89. 5%的氫和碳含量。在一 些情況下，組合物不是脂肪酸或脂肪酸酯或甲烷。仍在另外的情況下，氫和碳原子為組合物 成分重量的至少95%或99%。而在另外的情況下，氫和碳原子為組合物成分重量的100%。 對于一些燃料產(chǎn)品來說，組合物成分是萜。在一些情況下，組合物成分為液體。如本文描述的燃料產(chǎn)品可以是通過混合組合物和燃料成分產(chǎn)生的產(chǎn)物。在一些情 況下，燃料產(chǎn)品具有大于-32%。的δ 13C分布。在其他的情況下，燃料產(chǎn)品具有小于_32%。 的S13C分布。例如，為了產(chǎn)生如本文所述的燃料產(chǎn)品，提取自生物的組合物在精練(例如 裂化)之前與燃料成分混合。所述組合物可以是如本文描述的組合物。所述組合物可以是 提取自生物的組合物，其包括這樣的組合物，其中氫和碳原子為組合物重量的至少80%，并 且其中組合物的δ 13C分布小于-32%。。如所述的，燃料成分可以是礦物燃料或用于產(chǎn)生燃 料產(chǎn)品的混合摻合物。例如用于燃料混合的混合物可以是烴混合物，其適合于與另一烴混 合物混合以產(chǎn)生燃料產(chǎn)品。例如輕烷烴的混合物可能不具有適合于一燃料類型的特定辛烷 值，但是其可以與高辛烷混合物混合以產(chǎn)生燃料產(chǎn)品。在一個實例中，具有小于_32%。的δ 13C分布的組合物與用于燃料混合的烴混合物 混合，以產(chǎn)生燃料產(chǎn)品。在一些情況下，單獨的組合物或燃料成分不適合作為燃料產(chǎn)品，然 而，當(dāng)組合時，它們組成燃料產(chǎn)品。在其他的情況下，單獨的組合物或燃料成分或兩者適合 作為燃料產(chǎn)品。而在另外的情況下，燃料成分是現(xiàn)有的石油產(chǎn)品，如汽油或噴氣式發(fā)動機(jī)燃 料。而在另外的情況下，燃料成分來源于可再生來源，如生物乙醇、生物柴油、生物汽油等。本公開進(jìn)一步提供了產(chǎn)生二氧化碳的方法，其包括燃燒組合物從而產(chǎn)生二氧化 碳，其中所述二氧化碳具有小于_32%。的δ 13C分布。在一些情況下，二氧化碳具有小于大 約-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%?；騙60%。的δ 13C分布。燃燒步驟可以在汽油發(fā)動機(jī)、 在柴油發(fā)動機(jī)或在噴氣式發(fā)動機(jī)中進(jìn)行。在一些實施方式中，該方法進(jìn)一步包括從無維管光合生物中提取組合物。無維管光合生物的實例包括但不限于，藻類、藍(lán)細(xì)菌和苔蘚植物。 在一個實施方式中，提取組合物包括從水生光合生物中提取組合物。公開的方法可以進(jìn)一 步包括上調(diào)生物中酶的步驟，其中所述酶的產(chǎn)物為所述組合物。在一些情況下，所述酶不是 自然存在于生物中。示例性酶在本文中進(jìn)一步討論。在另一實施方式中，示例性核酸序列 在本文中進(jìn)一步討論。公開了產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法，其包括培養(yǎng)無維管光合生物；使所述生物與煙道 氣接觸；將來自所述煙道氣的13C摻入燃料產(chǎn)品；以及從無維管光合生物提取所述燃料產(chǎn) 品。例如，無維管光合生物可以生長在生物反應(yīng)器中。在示例性實施方式中，生物可以通過 與煙道氣一起輸入生物反應(yīng)器(例如，將煙道氣鼓泡進(jìn)入包含生長無維管光合生物的液體 的生物反應(yīng)器中)而與煙道氣接觸。在一些情況下，無維管光合生物是藻類。在另外的情 況下，生物反應(yīng)器是敞開的池。在另外的情況下，生物反應(yīng)器是封閉的光生物反應(yīng)器。在一 些情況下，該方法進(jìn)一步包括基因修飾生物的步驟。基因修飾生物的示例性方法在本文中 描述。在一些情況下，基因修飾生物可以在生物體內(nèi)上調(diào)或產(chǎn)生生成燃料產(chǎn)品的酶。在其 他情況下，基因修飾生物可以改善生物的生長。而在另一情況下，基因修飾生物影響生物內(nèi) 的碳固定，例如，改變碳固定的速率或數(shù)量。在一些情況下，燃料產(chǎn)品不是自然存在于生物 中。燃料產(chǎn)品可以包括含有氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子為組合物重量的至少 90%，并且其中組合物的δ 13C分布小于-32%。。在一些情況下，方法包括精煉燃料產(chǎn)品的 步驟。示例性精煉方法在本文中描述。本公開也提供了從無維管光合生物產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法，其包括培養(yǎng)無維管光 合生物，其中該生物產(chǎn)生第一燃料產(chǎn)品；使所述生物與無機(jī)碳源接觸；將來自所述無機(jī)碳 源的碳摻入第一燃料產(chǎn)品，其中所述第一燃料產(chǎn)品具有小于-32%。的δ 13C分布。在一些情 況下，無機(jī)碳源包括含13C的二氧化碳和含12C的二氧化碳。在一些情況下，無機(jī)碳源是礦 物燃料無機(jī)碳。在另外的情況下，無機(jī)碳具有大于-32%。的δ 13C分布。在一些情況下，使 生物與無機(jī)碳源接觸包括使生物與過量的無機(jī)碳源接觸。例如，過量無機(jī)碳可以描述一定 量無機(jī)碳，以便生物內(nèi)的碳固定不被無機(jī)碳源限制。在另一實例中，過量無機(jī)碳可以描述 一定量無機(jī)碳，以便由與過量無機(jī)碳接觸的生物產(chǎn)生的燃料產(chǎn)品的S 13C分布小于礦物燃 料的S 13C分布。例如，具有從過量無機(jī)碳源摻入的無機(jī)碳的燃料產(chǎn)品的δ 13C分布可以小 于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%> _55%?；?_60%0。在一些實施方式中，生物包括一個或多個核酸，所述核酸編碼一種或多種終產(chǎn)物 為第一燃料產(chǎn)品的酶。在另外的實施方式中，核酸是異源的。第一燃料產(chǎn)品可以不由生物自 然產(chǎn)生。在一些情況下，第一燃料產(chǎn)品具有小于_32%。的δ 13C分布。在另外的實施方式中， 第一燃料產(chǎn)品包括萜。礦物燃料無機(jī)碳可以具有大于_32%。的δ 13C分布。在一些實施方式 中，從生物中提取第一燃料產(chǎn)品。第一燃料產(chǎn)品可以經(jīng)歷裂化。在一些情況下，本文的方法 進(jìn)一步包括將燃料成分添加至第一燃料產(chǎn)品。在一些情況下，這些方法進(jìn)一步包括燃燒第 一燃料產(chǎn)品并且產(chǎn)生富S 13C的無機(jī)碳。在一些情況下，富δ 13C的無機(jī)碳具有小于-32%。 的δ 13C分布。本文公開的方法可以進(jìn)一步包括下述步驟培養(yǎng)第二無維管光合生物，其中 所述生物產(chǎn)生第二燃料產(chǎn)品；使所述生物與無機(jī)碳源接觸，以便第二燃料產(chǎn)品中的碳源自 這種來源，其中無機(jī)碳是富S 13C的無機(jī)碳。例如，第二燃料產(chǎn)品中的碳是從無機(jī)碳源摻入 的碳。該方法可以包括將來自無機(jī)碳源的碳摻入第二燃料產(chǎn)品。在一些情況下，除了第一和第二燃料產(chǎn)品的碳同位素分布以外，第一燃料產(chǎn)品和第二燃料產(chǎn)品基本上是相同的。第 二燃料產(chǎn)品可以具有小于-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%?；騙60%。的δ 13C分布?？梢岳帽疚牡慕M合物和方法產(chǎn)生的烴和烴衍生物產(chǎn)物的實例包括萜以及它們 的衍生物類萜。如本文使用的，萜可以與類異戊二烯或類萜交替使用。萜是由異戊二烯(C5) 單元組成的分子。萜未必是純的烴。類萜(也稱為類異戊二烯)源自萜，但是被修飾，如通 過添加雜原子如氧、碳骨架重排和烷基化進(jìn)行。如所述的，類萜可以被如本文使用的術(shù)語萜 包括。類胡蘿卜素，如胡蘿卜素和葉黃素，是作為有用產(chǎn)物的類萜的實例。類固醇是類萜的 另一實例。萜類的實例包括但不限于，半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。如本文使 用的，術(shù)語半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜也可以指類似結(jié)構(gòu)的類異戊二烯(例 如，倍半類異戊二烯)。萜類的其它實例包括但不限于，苧烯、1，8_桉樹腦、α-菔烯、 莰烯、(+)_檜烯、月桂烯、角鯊烯、花側(cè)柏烯、葉綠醇、法尼烯、松香二烯(abietadiene), 紫杉二烯(taxadiene)、法尼焦磷酸、紫穗槐二烯(amorphadiene)、(Ε)-α-紅沒藥烯或 diapophytoene,以及它們的衍生物。所產(chǎn)生的產(chǎn)物可以通過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或生物(一種或多種)自然地或非自然地 產(chǎn)生(作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果)。產(chǎn)物也可以是不存在于自然界的新的分子。例如藻類中自然產(chǎn) 生的產(chǎn)物可以是萜類如類胡蘿卜素(例如，胡蘿卜素)。由藻類非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的實 例包括非天然萜如苧烯。一些從宿主細(xì)胞產(chǎn)生的燃料產(chǎn)品——有時在精煉之后——將與現(xiàn)有的石化產(chǎn) 品相同，例如，具有相同的結(jié)構(gòu)。一些燃料產(chǎn)品可以不與現(xiàn)有的石化產(chǎn)品相同。在一個 實施方式中，除了碳同位素分布外，燃料產(chǎn)品或組合物與現(xiàn)有的石化產(chǎn)品相同。例如，據(jù) 認(rèn)為，任何礦物燃料石化產(chǎn)品不具有小于-32%。的δ 13C分布，而如本文所述的燃料產(chǎn)品 可以具有小于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%。或 _60%。的 δ 13C 分布。在另一 實施方式中，燃料產(chǎn)品或組合物與現(xiàn)有的礦物燃料石化產(chǎn)品相似但不相同，并且具有小 于-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%?；?_60%。的 δ 13C 分布。然而，雖然分子不存在 于常規(guī)的石化產(chǎn)品或精煉品中，但是其在這些工業(yè)中可能仍然是有用的。例如，可以產(chǎn)生這 樣的烴，其在汽油的沸點范圍內(nèi)并且可以用作汽油或添加劑，即使該烴不是自然存在于汽 油中。II.生產(chǎn)本文描述的任何產(chǎn)物可以都可以通過轉(zhuǎn)化生物以使這種生物產(chǎn)生該產(chǎn)物來制備。 在轉(zhuǎn)化之前或之后，生物可以是光合生物?？墒褂帽疚乃鼋M合物和方法轉(zhuǎn)化的生物的實例包括維管和無維管生物。所述生 物可以是原核生物或真核生物。所述生物可以是單細(xì)胞生物或多細(xì)胞生物。無維管光合生物的實例包括苔蘚植物(bryophtyes)，如葉苔門 (marchantiophytes)或角苔門(anthocerotophytes)。在一些實施方式中，所述生物是藍(lán) 細(xì)菌。在一些實施方式中，所述生物是藻類(如大型藻(macroalgae)或微藻)。所述藻類 可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞藻類。在一些實施方式中，所述生物是紅藻門、綠藻門、不等鞭毛門、 tribophyta、灰色藻門、絲足蟲門、眼蟲藻、定鞭藻門、隱藻門、隱滴蟲、甲藻門、腰鞭毛蟲或浮游植物。例如，所述微藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可用編碼苧烯合酶的 載體或其被線性化的部分轉(zhuǎn)化，以生產(chǎn)苧烯。例如，所述微藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)可用編碼苧烯合酶的載 體轉(zhuǎn)化，以生產(chǎn)苧烯。在另一實施方式中，微藻類可以用編碼苧烯合酶和蛋白質(zhì)的一個或多 個載體轉(zhuǎn)化以提供苧烯的生產(chǎn)。在一些情況下，方法使用微藻，萊茵衣藻示例。使用微藻表達(dá)多肽或蛋白復(fù)合 體提供了這樣的優(yōu)勢——可以培養(yǎng)大量的微藻，包括商業(yè)地培養(yǎng)(Cyanotech Corp.； Kailua-Kona HI)，因此允許期望產(chǎn)品的大量生產(chǎn)，以及分離——如果希望的話。然而，在任 何植物的葉綠體中表達(dá)例如功能哺乳動物多肽包括蛋白復(fù)合體的能力允許這些植物的作 物生產(chǎn)，并因此能夠方便地生產(chǎn)大量多肽。因此，本文所述的方法可以使用任何具有葉綠體 的植物實施，包括，例如大型藻，如海洋藻類和海草，以及在土壤中生長的植物。術(shù)語“植物”在本文被寬泛地使用，以指代含有質(zhì)體(plastids)，特別是葉綠體的 真核生物，并且其包括在任何發(fā)育階段的任何這樣的生物；或指代植物的部分，包括植物剪 枝(plant cutting)、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物器官、植物種子和胚芽(plantlet)。 植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，其包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單 個細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或可以是更高組成單元，如植物組織、植物器官或植物。因 此，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體，生成配子的細(xì)胞，或一個細(xì)胞，或可以再生為整個植物的細(xì) 胞集合。同樣地，種子，其包含多個植物細(xì)胞并能夠再生為整個植物，出于本公開的目的， 被認(rèn)為是植物細(xì)胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、胼胝體，或被歸類進(jìn)結(jié)構(gòu) 或功能單元的任何其它類別的植物細(xì)胞。植物特別有用的部分包括可收獲部分和用于繁 殖后代植物的部分。植物的可收獲部分可以是植物任何有用的部分，例如花朵、花粉、幼苗 (seedling)、塊莖、葉、莖、果實、種子、根等。用于繁殖的植物部分包括，例如，種子、果實、剪 枝(cutting)、幼苗、塊莖、根莖(rootstock)等。本文提供的方法可以產(chǎn)生含有原生質(zhì)體的植物，所述原生質(zhì)體被基因修飾以包含 穩(wěn)定整合的多核苷酸(Hager 和 Bock，Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :302_310，2000)。因 此，如本文所述，方法可以進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)基因(葉綠體轉(zhuǎn)基因(transplastomic))植物，如 萊茵衣藻，其包括一個或多個含有多核苷酸的原生質(zhì)體，所述多核苷酸編碼一個或多個異 源多肽，包括與形成功能蛋白復(fù)合體特異相關(guān)的多肽。光合生物包含至少一個被修飾以生 成產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化這里的生物/宿主細(xì)胞可以用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，以改變產(chǎn)物的生產(chǎn)，例如，提高產(chǎn)物 的生產(chǎn)。產(chǎn)物可以是由生物天然地或非天然地產(chǎn)生的。表達(dá)載體可以編碼一個或多個同源或異源核苷酸序列(由宿主細(xì)胞或由不同的 生物產(chǎn)生)和/或一個或多個自體同源的核苷酸序列(由相同的生物產(chǎn)生)和/或編碼同 源或異源多肽的那些?？杀晦D(zhuǎn)化進(jìn)藻類宿主細(xì)胞的異源核苷酸序列的實例包括來自細(xì)菌、 真菌、植物、光合細(xì)菌或其它藻類的基因?？杀晦D(zhuǎn)化進(jìn)藻類宿主細(xì)胞的自體同源核苷酸序列 的實例包括類異戊二烯合成基因、內(nèi)源啟動子和來自psbA、atpA或rbcL基因的5’ UTRs0 在一些實施方式中，異源序列在兩個自體同源序列或同源序列的一側(cè)。同源序列是那些具 有與宿主細(xì)胞中的序列至少50 %、60 %、70 %、80 %或90 %同源性的序列。在一些實施方式中，同源序列在兩個自體同源序列的一側(cè)。第一和第二同源序列使異源序列能夠重組進(jìn)入 宿主生物的基因組。第一和第二同源序列每一個的長度都可以至少是100、200、300、400或 500個核苷酸。表達(dá)載體可含有為在被轉(zhuǎn)化生物中表達(dá)而改變了密碼子的核苷酸序列。普通技 術(shù)人員在使用核苷酸密碼子來具體指明給定氨基酸中已經(jīng)熟知由特定宿主細(xì)胞顯示的“密 碼子偏倚性”。并非被理論限制，但通過使用宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子，翻譯的比率可以更高。 因此，當(dāng)合成用于提高在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因時，可期望設(shè)計這樣的基因，以便其密碼子 使用的頻率接近宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用的頻率。密碼子一般地富A/T，如，在密碼子第 三核苷酸的位置上富A/T。典型地，富A/T的密碼子偏倚被用于藻類。在一些實施方式中， 密碼子的至少50%的第三核苷酸位置是A或T。在其它實施方式中，密碼子的至少60%、 70%、80%、90%或99%的第三核苷酸位置是々或11。構(gòu)建藻類的基因改造株(genetically manipulated strain)的一個方法涉及用 編碼目的基因的核酸轉(zhuǎn)化，所述核酸典型地是能夠?qū)⑶绑w轉(zhuǎn)化為燃料產(chǎn)品或燃料產(chǎn)品前體 的酶。在一些實施方式中，轉(zhuǎn)化可將核酸引入宿主藻類細(xì)胞的任何質(zhì)體(如葉綠體)。轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞通常在引入外源核酸后被鋪于選擇性培養(yǎng)基中。該方法也可以包括若干篩選的步 驟。開始，通常進(jìn)行主轉(zhuǎn)化體(primary transformant)的篩選，以確定哪些克隆帶有合適 的外源核酸插入體。顯示恰當(dāng)插入的克隆可被形成膜片(patched)并重新篩選，以確保遺 傳穩(wěn)定性。這樣的方法保證轉(zhuǎn)化體含有目的基因。在多種實施方式中，這樣的篩選通過聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行，但是，本領(lǐng)域已知的任何其它合適的技術(shù)也可被使用。多種不同的 PCR方法在本領(lǐng)域內(nèi)公知(如嵌套PCR、實時PCR)。雖然在本文所述的實例中使用了具體的 例子；但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能認(rèn)識到其它PCR技術(shù)可替代所述的具體方法。篩選帶有 合適的外源核酸插入體的克隆之后，通?？寺”缓Y選存在的編碼蛋白。蛋白表達(dá)篩選通常 通過蛋白質(zhì)印跡分析和/或酶活性測試進(jìn)行。用在本文方法中的重組核酸分子可以包含在載體中。而且，在使用第二(或更 多)重組核酸分子進(jìn)行該方法的情況下，第二重組核酸分子也可以包含在載體內(nèi)，其可以， 但不必與含有第一重組核酸分子的載體相同。所述載體可以是用于將多核苷酸引入葉綠 體的任何載體，并且優(yōu)選地，包含足以與葉綠體基因組DNA進(jìn)行同源重組的葉綠體基因組 DNA的核苷酸序列，例如，含有約400到1500或更多基本上連續(xù)的葉綠體基因組DNA核苷酸 的核苷酸序列。葉綠體載體和選擇葉綠體基因組區(qū)域用作載體的方法已經(jīng)公知(參見，例 如，Bock，J. Mol.Biol. 312 :425_438，2001 ；也參見 Staub 和 Maliga，Plant Cell 4 39-45, 1992 ；Kavanagh等，Genetics 152 :1111_1122，1999，它們中的每一個都在此通過引用并 入)。在一些實施方式中，這樣的載體包括啟動子。用于本文的啟動子可來自任何來源 (如病毒、細(xì)菌、真菌、原生生物、動物)。本文考慮的啟動子可以對光合生物、無維管光合 生物和維管光合生物(如藻類、開花植物)是特異性的。在這里所用，術(shù)語“無維管光合 生物”是指任何宏觀或微觀生物，包括但不限于，藻類、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌，其不具有如在 高等植物中發(fā)現(xiàn)的維管系統(tǒng)。在一些實施方式中，上述核酸被插入含有光合生物如藻類的 啟動子的載體中。所述啟動子可以是在葉綠體和/或其它質(zhì)體中表達(dá)的啟動子。在一些 實施方式中，所述核酸是基于葉綠體的?？紤]用于插入本文所述任何核酸到葉綠體中的啟動子的實例包括美國申請2004/0014174中公開的那些。所述啟動子可以是組成型啟動子 (constitutive promoter)或誘導(dǎo)型啟動子。啟動子通常包括接近轉(zhuǎn)錄起始點的必需核酸 序列(如TATA元件)。萊茵衣藻的整個葉綠體基因組在互聯(lián)網(wǎng)上通過URL" biology, duke, edu/ chlamy_genome/-chloro. html “對公眾可用(參見"view complete genome astext file，， 鏈接和“maps of the chloroplast genome”鏈接)，它們每一個都在此通過引用被并入 (J. Maul, J. W. Lilly 和 D. B. Stern，未公開的結(jié)果；2002 年 1 月 28 日修改；將以 GenBank 帳號AF396929公開)。通常，葉綠體基因組DNA的核苷酸序列被這樣選擇，以致其不是基 因的一部分，包括調(diào)控序列或編碼序列，特別是如果由于同源重組事件被打斷，將產(chǎn)生對葉 綠體有害作用的基因，例如，用于葉綠體基因組復(fù)制，或?qū)腥~綠體的植物細(xì)胞產(chǎn)生有害 作用的基因。在這一方面，包含萊茵衣藻葉綠體基因組序列的網(wǎng)站也提供了顯示葉綠體基 因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)的圖譜，由此幫助用于構(gòu)建載體的序列的選擇。例如，葉綠體載體， p322，是從約143. Ikb位置的Eco (EcoRI)位點延伸到約148. 5kb位置的Xho (Xho I)位點 的克隆(參見，互聯(lián)網(wǎng)，在 URL" biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html"，并點 擊"maps of thechloroplast genome"鏈接和〃 140_150kb"鏈接；也可直接通過互聯(lián)網(wǎng) 上 URL" biology.duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html"獲取)。在本文使用的載體也可以含有一個或多個給予該載體期望性質(zhì)的額外的核苷酸 序列，包括，例如，這樣的序列，諸如輔助載體操控的克隆位點，指導(dǎo)該載體復(fù)制或其包含的 核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，編碼選擇性標(biāo)記的序列等。因此，所述載體可以包含，例如，一 個或多個克隆位點，如多克隆位點，其可以但不必放置為使異源多核苷酸可以被插入該載 體并且可操控地鏈接到期望的元件。所述載體也可以包含原核生物的復(fù)制起點(ori)，例 如，大腸桿菌ori或粘粒ori，由此如期望，允許該載體在原核宿主細(xì)胞，以及在植物的葉綠 體中傳遞。調(diào)控元件，作為本文所用的術(shù)語，廣義地指調(diào)控多核苷酸轉(zhuǎn)錄或翻譯，或其被可操 控地鏈接到的多肽的定位的核苷酸序列。實例包括，但不限于RBS、啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終 止子、起始(啟動)密碼子、用于內(nèi)含子剪切和正確讀碼框保持的剪接信號、終止密碼子、琥 珀密碼子或赭石密碼子——一種IRES。此外，細(xì)胞區(qū)室化信號(即，將多肽靶向到細(xì)胞液、 核、葉綠體膜或細(xì)胞膜的序列)。這樣的信號在本領(lǐng)域內(nèi)公知并已經(jīng)被廣泛地報告(見例 如，美國專利號5，776,689)。本文所述的任何表達(dá)載體可進(jìn)一步包含調(diào)控序列。調(diào)控序列可包括例如，啟動子、 操縱子、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、調(diào)控翻譯的序列，或與宿主細(xì)胞相容的和控制核酸 分子表達(dá)的其它調(diào)控序列。在一些情況下，調(diào)控序列包括能夠控制、調(diào)節(jié)或影響轉(zhuǎn)錄起始、 延伸和/或終止的轉(zhuǎn)錄控制序列。例如，調(diào)控序列可以提高生物中基因或基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄 和翻譯速率和/或效率，其中所述基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)被上調(diào)，(直接或間接地)引起本 文所述的產(chǎn)物的生產(chǎn)的提高。調(diào)控序列也可通過提高基因或基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致生產(chǎn) 的提高。調(diào)控序列可以是自體同源或異源的，并且如果是異源的，可以是同源的。調(diào)控序列 可編碼促進(jìn)產(chǎn)物表達(dá)和生產(chǎn)的酶的一個或多個多肽。例如，異源的調(diào)控序列可由所述生物 相同屬的另一種(如，另一藻類種)產(chǎn)生，并在藻類中編碼合酶。在另一實施方式中，自體同源的調(diào)控序列可以由表達(dá)載體將在其中表達(dá)的生物中產(chǎn)生。取決于應(yīng)用，調(diào)控序列可以被用以影響誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)。藻類調(diào)控序列可以 被使用，并且可以是核、病毒、染色體外、線粒體或葉綠體源的。合適的調(diào)控序列包括與待表達(dá)核苷酸序列天然相關(guān)的那些(例如，藻類啟動子天 然地與藻類衍生的核苷酸序列可操作地連接)。合適的調(diào)控序列包括與待表達(dá)的核酸分子 非天然相關(guān)的調(diào)控序列(例如，一個種的藻類啟動子與另一生物或藻類種的核苷酸序列可 操作連接)。后一種調(diào)控序列可以是在相同種內(nèi)控制另一基因表達(dá)的序列(即，自體同源)， 或可以從不同生物或種中衍生(即，異源的)。為了確定推定的調(diào)控序列是否合適，該推定的調(diào)控序列被連接到核酸分子，其通 常編碼產(chǎn)生容易檢測的信號的蛋白。該構(gòu)建體可隨后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)插入藻類或其它生物， 并且其表達(dá)被監(jiān)控。例如，如果核酸分子編碼顯性的選擇性標(biāo)記，待使用的藻類或生物被測 試在所述標(biāo)記為其提供抗性的化合物存在的環(huán)境中生長的能力。在一些情況下，調(diào)控序列是啟動子，如適合核苷酸序列在無維管光合生物中表達(dá) 的啟動子。例如，所述啟動子可以是藻類啟動子，例如美國公開申請?zhí)?006/0234368和 2004/0014174，以及 Hallmann 的 Transgenic Plant J. 1 :81_98 (2007)中所述。該啟動子 可以是葉綠體特異性啟動子或核啟動子。啟動子可以是EFl-α基因啟動子或D啟動子。在 一些實施方式中，所述合酶被可操作地連接到EFl-α基因啟動子。在一些實施方式中，所 述合酶被可操作地連接到D啟動子。本文的調(diào)控序列可以在多種位置發(fā)現(xiàn)，包括例如，編碼區(qū)域和非編碼區(qū)域、 5'-未翻譯區(qū)域(如，編碼區(qū)域上游的區(qū)域)和3'-未翻譯區(qū)域(如，編碼區(qū)域下游的區(qū) 域)。因此，在一些實施方式中，自體同源或異源的核苷酸序列可以包含一個或多個3'或 5' _未翻譯區(qū)域、一個或多個內(nèi)含子或一個或多個外顯子。例如，在一些實施方式中，調(diào)控序列可以包含隱秘小環(huán)藻(Cyclotellacryptica) 乙酰輔酶A羧化酶5'-未翻譯調(diào)控序列或隱秘小環(huán)藻乙酰輔酶A羧化酶3'-未翻譯調(diào) 控序列(美國專利號5，661，017)。調(diào)控序列也可編碼嵌合或融合多肽，如蛋白AB或SAA，其促進(jìn)異源核苷酸序列和 蛋白的表達(dá)。其它調(diào)控序列包括自體同源的內(nèi)含子序列，其可促進(jìn)異源序列的翻譯。在本文的任何表達(dá)載體中使用的調(diào)控序列可被誘導(dǎo)?？烧T導(dǎo)的調(diào)控序列，如啟動 子，可以通過例如光被誘導(dǎo)。調(diào)控序列也可以是可自體調(diào)控的?？勺泽w調(diào)控的調(diào)控序列的 實例包括通過，例如，內(nèi)源ATP水平或通過由生物產(chǎn)生的產(chǎn)物自體調(diào)控的那些。在一些實施 方式中，所述調(diào)控序列可通過外源試劑被誘導(dǎo)。其它可誘導(dǎo)的元件在本領(lǐng)域內(nèi)被公知，并且 可適合于如本文所述使用。本文所述的各種調(diào)控序列的各種組合可具體化并與本文所述的其它特征組合。在 一些情況下，表達(dá)載體包含一個或多個調(diào)控序列，其被可操作地連接到編碼多肽的核苷酸 序列上，所述多肽影響，例如，上調(diào)本文所述產(chǎn)物的生產(chǎn)。在一些情況下，表達(dá)載體包括一個 或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列可操作地連接到編碼影響例如上調(diào)產(chǎn)物生產(chǎn)的多肽的核苷 酸序列。載體或其他重組核酸分子可包括編碼報告多肽或其它選擇性標(biāo)記的核苷酸序列。 術(shù)語“報告基因(reporter)”或“選擇性標(biāo)記”指的是給予可檢測表型的多核苷酸(或編碼
20的多肽)。報告基因通常編碼可檢測的多肽，例如，綠色熒光蛋白，或一種酶，如熒光素酶，當(dāng) 與合適的試劑(分別是特定波長的光或熒光素)接觸時，其產(chǎn)生可被肉眼或使用適當(dāng)?shù)膬x 器檢測到的信號(Giacomin, Plant Sci. 116 :59_72，1996 ；Scikantha, J. Bacteriol. 178 121，1996 ；Gerdes, FEBS Lett. 389 44-47,1996 ；也參見 Jefferson, EMB0J. 6 :3901_3907， 1997,fl-glucuronidase)。選擇性標(biāo)記通常是這樣的分子，當(dāng)在細(xì)胞中存在或表達(dá)時，其為 含有該標(biāo)記的細(xì)胞提供了選擇性優(yōu)勢(或劣勢)，例如，在否則會殺死細(xì)胞的試劑存在的情 況下生長的能力。選擇性標(biāo)記可以提供一種獲得表達(dá)該標(biāo)記的原核細(xì)胞或植物細(xì)胞或兩者的方 法，并因此可以被用作所述載體的一個部分(參見，例如，Bock，上文，2001)。選擇性標(biāo) 記的實例包括，但不限于，給予抗代謝物抗性的那些，如，二氫葉酸還原酶，其給予對甲 氨喋呤的抗性(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 143-149，1994)；新霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶，其給予對氨基糖苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella， EMBO J. 2 987-995,1983) ；hygro，其給予對潮霉素的抗性(Marsh，Gene 32:481-485， 1984) ；trpB，其允許細(xì)胞使用吲哚替代色氨酸；hisD，其允許細(xì)胞使用組氨醇(histinol) 替代組氨酸(Hartman，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 85 :8047，1988)；甘露糖 _6_ 磷酸異 構(gòu)酶，其允許細(xì)胞使用甘露糖(W0 94/20627)；鳥氨酸脫羧酶，其給予對鳥氨酸脫羧酶 抑制劑——2-( 二氟甲基)-DL-鳥氨酸的抗性(DFM0 ;McConlogue，1987，In Current Communications inMolecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；禾口自 土曲霉(Aspergillus terreus)的脫氨酶，其給予對殺稻瘟素S的抗性(Tamura，Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 =2336-2338,1995)。其它選擇性標(biāo)記包括給予除草劑抗性的那 些，例如，草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其給予對草胺膦的抗性(White等，Nucl. Acids Res. 18 1062，1990 ；Spencer 等，Theor. Appl. Genet. 79 :625_631，1990)；變異 EPSPV 合酶，其給予 草甘膦抗性(Hinchee等，Bi0TeChn0l0gy91 =915-922,1998)；變異的乙酰乳酸合酶，其給予 咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee等，EMBO J. 7 1241-1248，1988)；變異的psbA，其給予對阿特 拉津(atrazine)的抗性(Smeda 等，Plant Physiol. 103 :911_917，1993)；或變異的前卟啉 原(protoporphyrinogen)氧化酶(參見美國專利號5，767，373)；或給予對除草劑如草丁 膦(glufosinate)的抗性的其它標(biāo)記。選擇性標(biāo)記包括給予真核細(xì)胞二氫葉酸(DHFR)或 新霉素抗性，或給予原核生物，如大腸桿菌四環(huán)素、氨芐青霉素抗性；和植物中爭光霉素、慶 大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素、草胺膦(phosphinotricin)、壯觀 霉素、鏈霉素、磺酰胺和磺酰脲抗性的多核苷酸(參見，例如，Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995，第 39 頁)。報告基因已經(jīng)被成功地用在高等植物的葉綠體中，并且已經(jīng)報道了高水平重組蛋 白的表達(dá)。此外，報告基因已經(jīng)被用在萊茵衣藻的葉綠體中，但是，在大多數(shù)情況下，產(chǎn)生 非常少量的蛋白。報告基因極大地增強(qiáng)了監(jiān)控多種生物中基因表達(dá)的能力。在高等植物 的葉綠體中，β-葡萄糖醛酸酶(uidA, Staub 和 Maliga，EMBO J. 12 :601_606，1993)、新 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll, Carrer 等，Mol. Gen. Genet. 241 =49-56,1993)、腺苷基-3-腺嘌 呤轉(zhuǎn)移酶(adenosyl-3-adenyltransf-erase) (aadA, Svab 禾口 Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90:913-917,1993)和維多利亞發(fā)光水母(Aequorea victoria)GFP(Sidorov 等，Plant J. 19 :209_216，1999)已經(jīng)被用作報告基因(Heifetz, Biochemie 82 -.655-666,2000)。這些基因中的每一個都具有使它們成為有用的葉綠體基因表達(dá)的報告基因的性 質(zhì)，如易于分析、敏感性或原位檢查表達(dá)的能力。基于這些研究，其它異源蛋白已經(jīng)在高 等植物的葉綠體中表達(dá)，如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensisKry毒素，其將 抗性給予草食昆蟲(Kota 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 96 1840-1845，1999)或人生長 激素(Staub等，Nat. Biotechnol. 18 :333_338，2000)，一種可能的生物藥物。若干報告基 因已經(jīng)在真核綠藻萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá)，包括aadA (Go 1 dschmidt-Clermont，Nuc 1. Acids Res. 19 :4083-4089 1991 ；Zerges 和 Rochaix, Mol. Cell Biol. 14 :5268_5277， 1994)、uidA(Sakamoto 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90 :477_501，19933，Ishikura 等，J. Biosci. Bioeng. 87 :307-3141999)、海腎(Renilla)熒光素酶(Minko 等，Mol. Gen-Genet. 262 :421_425， 1999) 和來自鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)的氨基糖苷 憐酸轉(zhuǎn)移酶(amino glycoside phosphotransferase) aphA6 (Bateman 禾口 Purton, Mol. Gen. Genet 263 =404-410,2000)。在一些實施方式中，載體含有諸如大腸桿菌或釀酒酵母(S. cerevisiae)復(fù)制起 點的元件。這些特征，與適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記結(jié)合，允許所述載體在目標(biāo)宿主細(xì)胞和細(xì)菌和/ 或酵母細(xì)胞之間“穿梭(shuttled)”。在第二宿主(secondary host)中傳遞穿梭載體的能 力可允許對該載體特征更方便地操控。例如，含有載體和推定插入的目標(biāo)多肽的反應(yīng)混合 物可以被轉(zhuǎn)化進(jìn)原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌，被擴(kuò)增并用常規(guī)方法收集，并且被檢驗，以分辨 含有目標(biāo)插入體或構(gòu)建體的載體。如果期望，該載體可以進(jìn)一步被操作，例如，通過進(jìn)行定 點突變插入的多核苷酸，隨后再次擴(kuò)增并選擇具有變異的目標(biāo)多核苷酸的載體。穿梭載體 隨后可以被引入植物細(xì)胞葉綠體，其中目標(biāo)多肽可以被表達(dá)，并且如果期望，根據(jù)本文公開 的方法進(jìn)行分離。多核苷酸或重組核酸分子可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法被引入植物葉綠體。多 核苷酸可以通過多種本領(lǐng)域熟知的方法被引入細(xì)胞，并且部分地基于特定的宿主細(xì)胞進(jìn)行 選擇。例如，多核苷酸可以使用直接基因轉(zhuǎn)移的方法被引入植物細(xì)胞，所述方法例如電穿孔 或使用粒子槍的微粒介導(dǎo)(基因槍)轉(zhuǎn)化或“玻璃珠法(glass bead method) ”，或通過花 粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用損傷或酶降解的未成熟胚胎或損傷或酶降解的胚 胎胼胝體轉(zhuǎn)化(Potrykus, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 42 -.205-225,1991)。質(zhì)體轉(zhuǎn)化是用于將多核苷酸引入植物細(xì)胞葉綠體的一種常規(guī)和熟知的方法(參 見美國專利號 5，451，513,5, 545，817 和 5，545，818 ；WO 95/16783 ；McBride 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91 :7301_7305，1994)。在一些實施方式中，葉綠體轉(zhuǎn)化涉及引入一側(cè)帶有 期望核苷酸序列的葉綠體DNA的區(qū)域，允許外源DNA同源重組進(jìn)入目標(biāo)葉綠體基因組。在 一些實施方式中，葉綠體基因組DNA—側(cè)的1到1.5kb的核苷酸序列可以被使用。使用這 種方法，在葉綠體16S rRNA和給予對奇霉素和鏈霉素的抗性的rpsl2基因中的點突變可以 被用作轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(Svab 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA87 :8526_8530，1990)，并且 可以約每100次目標(biāo)葉片轟擊一個的頻率，產(chǎn)生穩(wěn)定的同型(homoplasmic)轉(zhuǎn)化體。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也可以被用于將多核苷酸引入植物細(xì)胞葉綠體(Klein等， Nature 327:70-73,1987).該方法是用了諸如金或鎢的微粒，其被期望的多核苷酸通過 與氯化鈣、亞精胺或聚乙二醇沉淀而包衣。微粒粒子使用諸如BI0LISTIC PD-1000粒子槍 (BioRad ；Hercules Calif.)的設(shè)備被高速加速進(jìn)入植物組織。使用基因槍方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法在本領(lǐng)域內(nèi)被公知(參見，例如，Christou，Trends in Plant Science 1 =423-431, 1996)。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)被使用，例如，用以產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物種類，包括棉花、煙草、 玉米、雜交白楊和木瓜。重要的谷類作物，諸如小麥、燕麥、大麥、高粱和水稻也已經(jīng)使用微 粒介導(dǎo)輸送被轉(zhuǎn)化(Duan 等，Nature Biotech. 14 :494_498，1996 ；Shimamoto, Curr. Opin. Biotech. 5 :158-162，1994)。大多數(shù)雙子葉植物的轉(zhuǎn)化用上述方法是可能的。單子葉植物 的轉(zhuǎn)化也可以使用，例如，上述基因槍方法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分滲透細(xì)胞的點穿孔、使用玻 璃纖維引入DNA、玻璃珠振蕩(agitation)法等進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化頻率可通過隱性rRNA或蛋白抗生素抗性基因被顯性選擇性標(biāo)記替代而提 高，所述顯性選擇性標(biāo)記包括但不限于細(xì)菌aadA基因(Svab和Maliga，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 90:913-917,1993)。轉(zhuǎn)化后通常需要約15到20個細(xì)胞分裂周期以達(dá)到同質(zhì) (homoplastidic)狀態(tài)。葉綠體可包含其基因組的多個拷貝對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而 易見的，并且因此，術(shù)語“同質(zhì)的(homoplasmic) ”或“同型異源性(homoplasmy) ”指的是這 樣的狀態(tài)——特定目標(biāo)基因座的所有拷貝都基本相同。質(zhì)體表達(dá)，其中基因通過同源重組 插入每個植物細(xì)胞中存在的環(huán)狀質(zhì)體基因組的所有幾千個拷貝中，利用了相對于核表達(dá)基 因的大量拷貝數(shù)優(yōu)勢，以允許表達(dá)水平輕易地超過總可溶植物蛋白的10%。在一些情況下，方法可以通過向葉綠體中引入重組核酸分子實施，其中所述重組 核酸分子包括第一多核苷酸，其編碼至少一個多肽(即，1個、2個、3個、4個或更多)。在一 些實施方式中，多肽被可操作地鏈接到第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十 和/或后續(xù)多肽。例如，在烴生產(chǎn)途徑中的若干酶可以被直接或間接地鏈接，以便由途徑中 的一種酶產(chǎn)生的產(chǎn)物一旦產(chǎn)生，即與該途徑中下一種酶非?？拷τ谌~綠體的轉(zhuǎn)化，主要優(yōu)勢可能是包含選擇性標(biāo)記和一個或多個目的基因的重 組核酸構(gòu)建體的使用。典型地，葉綠體的轉(zhuǎn)化通過用以下兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化葉綠體實施一 種包含選擇性標(biāo)記且第二種包含目的基因。這些轉(zhuǎn)化體的篩選由于多種原因是費力且費時 的。首先，培養(yǎng)一些轉(zhuǎn)化的生物需要的時間是漫長的。其次，轉(zhuǎn)化體必須被篩選出選擇性標(biāo) 記和目的基因兩者都存在。典型地，對目的基因的第二次篩選通過DNA印記法進(jìn)行(參見， 例如 PCT/US2007/072465)。在葉綠體中，基因表達(dá)的調(diào)控一般地在轉(zhuǎn)錄后并且通常在翻譯起始時發(fā) 生。這種調(diào)控取決于葉綠體翻譯裝置，以及核編碼的調(diào)控因子(參見Barkan和 Goldschmidt-Clermont, Biochemie 82 :559_572，2000 ；Zerges, Biochemie 82 :583_601， 2000)。葉綠體翻譯裝置通常與細(xì)菌中的類似；葉綠體包含70S核糖體；具有缺少5’加蓋的 mRNA并通常不含有3，多腺苷尾部(Harris等，Microbiol. Rev. 58 :700_754，1994)；而且翻 譯在葉綠體和在細(xì)菌中被諸如氯霉素的選擇性試劑抑制。本文所述的一些方法利用了核糖體結(jié)合序列(RBS)相對于編碼序列的恰當(dāng)置 放。以前就已經(jīng)注意到RBS這樣的置放引起植物葉綠體中穩(wěn)健的翻譯(參見美國申請 2004/0014174，在此被引入作為參考)，以及利用葉綠體中表達(dá)多肽的多肽是該多肽不穿過 通常被由核基因表達(dá)的多肽穿過的細(xì)胞區(qū)室，并因此，不經(jīng)過某些翻譯后修飾，如糖基化。 同樣地，通過本文的一些方法產(chǎn)生的多肽和蛋白復(fù)合體可以被預(yù)期在沒有這樣的翻譯后修 飾的情況下產(chǎn)生。編碼多核苷酸的一個或多個密碼子可以被偏倚，以反映葉綠體和/或核密碼子的使用。大多數(shù)氨基酸由兩個或多個不同的(簡并的)密碼子編碼，并且各種生物使用某 些密碼子優(yōu)先于其它密碼子是公知的。這樣優(yōu)選的密碼子使用，其也在葉綠體中使用，在 這里指的是“葉綠體密碼子使用”。萊茵衣藻的密碼子偏倚性已經(jīng)被報道。參見美國申請 2004/0014174。編碼類異戊二烯生物合酶——其被偏倚用于在萊茵衣藻中表達(dá)——的核酸 的實例在表5-8中提供。與原生序列同一性百分比(在該序列被分離的生物中)可以是約 50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更高。一些載體包含表5提供的一種或多種核酸 和/或具有與其約70%同一性的核酸。術(shù)語“偏倚的”當(dāng)用于指密碼子時，表示多核苷酸中密碼子的序列已經(jīng)被改變，以 至于該密碼子在該偏倚(bias)用于的目標(biāo)中，如藻細(xì)胞、葉綠體，是被優(yōu)選地使用的一個。 為葉綠體密碼子使用而偏倚的多核苷酸可以重新合成，或可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)， 例如，通過位點定向誘變法，進(jìn)行基因修飾，以改變一個或多個密碼子，以便它們針對葉綠 體密碼子使用是偏倚的。葉綠體密碼子偏倚可以在不同植物中多種地變化，包括，例如，在 藻類葉綠體中與在煙草中比較。通常，選擇的葉綠體密碼子偏倚性反映了用核酸轉(zhuǎn)化的植 物的葉綠體密碼子使用。例如，在萊茵衣藻為宿主的情況下，葉綠體密碼子使用被偏倚，以 反映藻類葉綠體密碼子使用(約74. 6%的AT偏倚在第三個密碼子位置)。本文描述的任何產(chǎn)物可以通過轉(zhuǎn)化生物以使該產(chǎn)物的這種生物進(jìn)行生產(chǎn)來制備。 即使轉(zhuǎn)化事件破壞或降低了轉(zhuǎn)化生物的光合能力(例如，外源核酸被插入到編碼光合作用 需要的蛋白質(zhì)的基因中)，該生物也被認(rèn)為是光合生物。修飾的涂徑本文的表達(dá)載體可以編碼這樣的多肽(一種或多種)，所述多肽促進(jìn)中間體、產(chǎn) 物、前體以及本文描述的產(chǎn)物的衍生物的產(chǎn)生。例如，表達(dá)載體可以編碼在類異戊二烯途徑 中促進(jìn)中間體、產(chǎn)物、前體和衍生物的產(chǎn)生的多肽。類異戊二烯或類萜是一組與萜類有關(guān)的有機(jī)化學(xué)品。萜類一般源自異戊二烯單 元。異戊二烯單元是五碳單位(C5)。根據(jù)異戊二烯單元的數(shù)目對萜類進(jìn)行分類，如半萜 (C5)、單萜(ClO)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)、四萜(C40)和多萜(Cn，其中“η” 等于或大于45)。萜類是這樣的烴，其可以被改性(例如，氧化、除去甲基基團(tuán)等)或其碳骨 架被重排以形成萜的衍生物，如類異戊二烯。類異戊二烯也包括其他的類固醇以及脂類。萜前體被認(rèn)為通過兩種途徑產(chǎn)生。甲羥戊酸途徑，或HMG-CoA還原酶途徑，產(chǎn)生二 甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和異戊基焦磷酸(IPP)，萜常見的C5前體。非甲羥戊酸途徑是 形成DMAPP和IPP的可選途徑。DMAPP和IPP可被縮合以形成櫳牛兒基二磷酸(GPP)或其 它前體，如法尼二磷酸(FPP)、忙牛兒基忙牛兒基二磷酸(GGPP)，由它們形成更高級的類異 戊二烯。本文的表達(dá)載體可以編碼在甲羥戊酸途徑中具有作用的多肽(一種多多種)， 諸如，例如，硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶 (phosphemevalonate kinase)和甲羥戊酸_5_焦磷酸脫羧酶。在其他實施方式中，多肽 是非甲羥戊酸途徑中的酶，如DOXP合酶、DOXP還原酶、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤 蘚糖醇合酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase)、4_ 二磷酸胞 苷-2-C-甲基-D赤蘚糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4，-環(huán)二磷酸合酶、HMB-PP合 酶、HMB-PP還原酶或DOXP還原異構(gòu)酶。
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在其他情況下，表達(dá)載體可以包括編碼類異戊二烯途徑中的多肽的核苷酸序列， 諸如，例如，合酶編碼序列。合酶可以是CIO、C15、C20、C30或C40合酶。在一些實施方 式中，合酶是葡萄烴(botryococcene)合酶、苧烯合酶、1，8桉葉油素(1，8 cineole)合 酶、α-菔烯合酶、莰烯合酶、(+)_檜烯合酶、月桂烯合酶、松香二烯(abietadiene)合酶、 紫杉二烯(taxadiene)合酶、法尼焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶、(E) - α -紅沒藥烯合酶、 diapophytoene合酶或diapophytoene去飽和酶。在表1中描述了合酶的實例以及它們的 序列。表1.合酶的實例 所述合酶也可以是β -石竹烯合酶、大根香葉烯A合酶、8-表雪松醇 (8-epicedrol)合酶、朱欒倍半萜(valencene)合酶、(+)-δ-杜松烯((+)- δ-cadinene) 合酶、大根香葉烯C合酶、(Ε)-β-法尼烯合酶、蓖麻烯(casbene)合酶、vetispiradiene 合酶、5-表-馬兜鈴烯(5-印i-aristolochene)合酶、馬兜鈴烯合酶、α-潷草烯、(Ε， E)-α-法尼烯合酶、(-)-β-菔烯合酶、Y-松油烯合酶、苧烯環(huán)化酶、沉香醇合酶、(+)_冰 片二磷酸合酶、左旋海松二烯合酶、異海松二烯合酶、(E)-Y-紅沒藥烯合酶、柯巴基焦磷酸 (copalylpyrophosphate)合酶、貝殼衫烯(kaurene)合酶、長葉烯合酶、Y-潷草烯合酶、 δ _蛇床烯合酶、β -水芹烯合酶、異松油烯合酶、(+)-3_蒈烯合酶、順-柯巴基焦磷酸合酶、 α -松油醇合酶、順-海松-7，15- 二烯合酶、反-山達(dá)海松二烯(sandaaracopimaradiene) 合酶、sterner-13-ene合酶、E- β -羅勒烯、S-沉香醇合酶、櫳牛兒醇合酶、γ -松油烯合酶、 沉香醇合酶、E-β -羅勒烯合酶、表_雪松醇合酶、α -姜烯合酶、愈創(chuàng)木二烯(guaiadiene) 合酶、卡藜二烯(cascarilladiene)合酶、順-穆羅拉二烯(muuroladiene)合酶、阿菲迪柯 林-16b-醇(aphidicolan-16b-ol)合酶、伊麗莎白三烯(elizabethatriene)合酶、檀香醇 合酶、廣藿香醇(patchoulol)合酶、zinzanol合酶、雪松醇合酶、香紫蘇醇(scareol)合酶、 柯巴醇(copalol)合酶或淚柏醇(manool)合酶。本文中使用的途徑可以包含細(xì)胞液中、質(zhì)體中(如，葉綠體)或兩者中存在的酶。 編碼本文所述實施方式中酶的外源核酸可被引入宿主細(xì)胞，以便編碼的酶在細(xì)胞液中或在 質(zhì)體中或在兩者中都有活性。在一些實施方式中，在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，在一個細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(如，在細(xì)胞液中)中存在的天然生成的酶可在不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域內(nèi)(如在葉綠體中)，或 在天然生成和非天然生成的區(qū)域內(nèi)表達(dá)。為了闡釋這一概念，并且只是通過實例的方式，無維管光合微藻可以被基因工程 化，以產(chǎn)生類異戊二烯，如苧烯(一種在特用化學(xué)和石化工業(yè)中有很高價值的分子)。苧烯 是純烴單萜，僅含有氫和碳原子。苧烯不是萊茵衣藻中天然產(chǎn)生的。苧烯在這些微藻中的 產(chǎn)生可以通過工程化該微藻以在葉綠體中表達(dá)異源酶苧烯合酶而完成。苧烯合酶可以將萜 烯前體櫳牛兒基焦磷酸(geranyl pyrophosphate)轉(zhuǎn)化成苧烯。不像苧烯，櫳牛兒基焦磷 酸天然存在于微藻的葉綠體中。苧烯合酶的表達(dá)可以通過插入編碼苧烯合酶的異源基因到 微藻的葉綠體基因組中完成。隨后使微藻的修飾株成為同質(zhì)的，以確保苧烯基因在所有后 代的葉綠體基因組中穩(wěn)定保持。當(dāng)被插入的基因存在于葉綠體基因組的所有拷貝中時，微 藻對于基因是同質(zhì)的。葉綠體可能包含其基因組的多個拷貝對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而 易見的，并且因此，術(shù)語“同質(zhì)的(homoplasmic) ”或“同型異源性(homoplasmy) ”指的是這 樣的狀態(tài)——特定目標(biāo)基因座的所有拷貝都基本相同。質(zhì)體表達(dá)，其中基因通過同源重組 插入每個植物細(xì)胞中存在的環(huán)狀質(zhì)體基因組的所有幾千個拷貝中，利用了相對于核表達(dá)基 因的大量拷貝數(shù)優(yōu)勢，以允許表達(dá)水平輕易地超過總可溶植物蛋白的10%。表汰葉綠體是光合生物中生產(chǎn)性的細(xì)胞器和大量蛋白合成的位置。本文所述的任何 表達(dá)載體可選擇性地適合葉綠體表達(dá)。許多來自高等植物的葉綠體啟動子已經(jīng)在Kimg和 Lin, Nucleic Acids Res. 13 :7543_7549 (1985)中描述。基因產(chǎn)物可在葉綠體中由表達(dá)載 體表達(dá)。由表達(dá)載體編碼的基因產(chǎn)物也可由葉綠體靶向基因被靶向到葉綠體。例如，靶向 表達(dá)載體或由表達(dá)載體編碼的基因產(chǎn)物到葉綠體可進(jìn)一步增強(qiáng)由調(diào)控序列和編碼允許或 提高燃料分子生產(chǎn)的蛋白或多肽的序列提供的效果。本文所述的靶向葉綠體的各種組合可具體體現(xiàn)并與本文所述的其它特征組合。例 如，編碼萜烯合酶的核苷酸序列可被可操作地連接到編碼葉綠體靶向基因的核苷酸序列。 宿主細(xì)胞可用編碼靶向葉綠體的苧烯合酶的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，并且因此，可產(chǎn)生比用編碼苧 烯合酶但沒有葉綠體靶向基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞更多的苧烯合酶。提高的苧烯合 酶的表達(dá)可產(chǎn)生比產(chǎn)生較少的宿主細(xì)胞更多的苧烯。而在另一實例中，包含編碼酶的核苷酸序列的表達(dá)載體被靶向葉綠體，所述酶通 過利用由生物自然產(chǎn)生的前體作為底物，產(chǎn)生該生物非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如，燃料產(chǎn)品、 香料產(chǎn)品、殺蟲劑產(chǎn)品)。與其中酶被表達(dá)但是沒有靶向葉綠體的宿主細(xì)胞相比，通過將酶 靶向葉綠體，產(chǎn)物的生產(chǎn)可以增加。不被理論所束縛，這可能是由于增加了在葉綠體中產(chǎn)生 的前體并且因此更多的產(chǎn)物可以通過由引入的核苷酸序列所編碼的酶產(chǎn)生。產(chǎn)物(例如燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品、殺蟲劑產(chǎn)品)可以通過包括下述步驟的方法生 產(chǎn)生長/培養(yǎng)由本文的一個或多個核酸轉(zhuǎn)化的無維管生物。本文的方法可以進(jìn)一步包括 轉(zhuǎn)化生物的步驟。轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的或本文描述的任何方法進(jìn)行。本文的方法 可以進(jìn)一步包括收集由生物生產(chǎn)的產(chǎn)物的步驟。本文的方法可以進(jìn)一步包括給生物提供無機(jī)碳源如煙道氣的步驟。在一些情況 下，無機(jī)碳源提供制造產(chǎn)物(例如燃料產(chǎn)品)必需的全部碳。生長/培養(yǎng)步驟優(yōu)選地發(fā)生
28在合適的培養(yǎng)基如具有礦物質(zhì)和/或維生素的培養(yǎng)基中。而在相關(guān)的不同方面，提供了生產(chǎn)產(chǎn)物(例如燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品、殺蟲劑產(chǎn)品) 的方法，其包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化光合生物，生長生物；以及從該生物收集產(chǎn)物。表達(dá)載體 一般是本文描述的表達(dá)載體，并且特別地被用于向生物增加額外的生物合成能力或改變該 生物中已經(jīng)存在的生物合成途徑，意圖在于提高或允許由該光合生物產(chǎn)生分子。本文的方法包括選擇用于生產(chǎn)產(chǎn)物的基因，產(chǎn)物例如燃料、香料和殺蟲劑，用該基 因轉(zhuǎn)化光合生物的細(xì)胞，和在允許生產(chǎn)產(chǎn)物的合適條件下培養(yǎng)該生物。生物可以在傳統(tǒng)的 發(fā)酵生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，其包括，但不限于，分批式(batch)、補(bǔ)料分批式(fed-batch)、細(xì) 胞再循環(huán)和連續(xù)式發(fā)酵器。而且，它們可在光生物反應(yīng)器中生長(參見，例如，美國專利公 開號20050260553 ；美國專利號5，958，761 ；美國專利號6，083，740)。培養(yǎng)也可以在搖瓶、 試管、微量滴定盤(microtiter dish)和培養(yǎng)皿中進(jìn)行。培養(yǎng)在適合重組細(xì)胞的溫度、pH和 氧含量的條件下進(jìn)行。這些培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員中被公知。宿主生物也可在陸地上生長，例如，垃圾填埋場。在一些實例中，宿主生物在乙醇 生產(chǎn)工廠或在產(chǎn)生CO2的其它設(shè)施或區(qū)域(如，城市、高速公路等)附近生長。因此，本文 所述的方法考慮了向乙醇工廠或產(chǎn)生CO2的其它設(shè)施或區(qū)域出售碳信用額，并同時通過在 乙醇生產(chǎn)工廠附近培養(yǎng)一種或多種本文所述的修飾的生物來生產(chǎn)燃料的商業(yè)方法。而且，所述生物可在戶外開放水域生長，如池塘、大洋、海、河流、水床(waterbed)、 沼澤水(marsh water)、淺池、湖泊、水庫等。當(dāng)在水中生長時，所述生物可以被包含在由樂 高積木狀(lego-like)顆粒組成的光環(huán)狀(halo like)物體中。所述光環(huán)狀物體圍繞藻類， 并允許其從下方水中保持營養(yǎng)同時保持其在無遮擋的陽光中。在一些實例中，生物可以在容器中生長，其中每個容器包含1個或2個或多個生 物。所述容器可以被構(gòu)建為漂浮在水上。例如，容器可以由空氣和水的組合填充，使得容器 和在其中的宿主生物漂浮。因此，適應(yīng)在淡水中生長的宿主生物可以在咸水(即，海水)中 生長，并且反之亦然。如果容器有任何損壞，這種機(jī)制允許生物自動死亡。在一些實例中，若干容器可以包含在上述光環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。例如，多達(dá)100、1，000、 10，000、100，000或1，000, 000個容器可以被安排在光環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一平米中。在一些實施方式中，通過收獲生物來收集產(chǎn)物(例如燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品、殺蟲劑 產(chǎn)品)。然后，可以從所述生物中提取產(chǎn)物。在一些實施方式中，所述產(chǎn)物(如，燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品、殺蟲劑產(chǎn)品)的表達(dá)是可 誘導(dǎo)的。所述產(chǎn)物可被誘導(dǎo)以表達(dá)。表達(dá)可以通過光誘導(dǎo)。而在其它實施方式中，所述產(chǎn) 物的生產(chǎn)是自體調(diào)控的。所述產(chǎn)物可形成反饋回路，其中當(dāng)產(chǎn)物(如，燃料產(chǎn)品、香料產(chǎn)品、 殺蟲劑產(chǎn)品)達(dá)到某個水平時，產(chǎn)物的表達(dá)被抑制。在其它實施方式中，所述生物的代謝產(chǎn) 物的水平抑制產(chǎn)物的表達(dá)。例如，作為能量產(chǎn)生提高以表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)果，所述生物產(chǎn)生的內(nèi) 源ATP可形成反饋回路，以抑制該產(chǎn)物的表達(dá)。而在另一實施方式中，產(chǎn)物的生產(chǎn)可被例如 通過光或外源試劑誘導(dǎo)。例如，用于引起宿主生物中產(chǎn)物生產(chǎn)的表達(dá)載體可包含可誘導(dǎo)的 調(diào)控序列，其被外源試劑激活或鈍化。本文描述的方法或過程也可以涉及篩選新基因/表達(dá)載體以產(chǎn)生本文描述的任 何燃料產(chǎn)品的方法。這樣的方法包括下述步驟(1)將核酸的候選表達(dá)載體插入光合生物， (2)收集從其產(chǎn)生的推定的燃料產(chǎn)品，(3)將推定的燃料產(chǎn)品施加到質(zhì)譜儀以確定所述推
29定燃料產(chǎn)品的性質(zhì)以及其是否可以用作燃料產(chǎn)品。在一些實施方式中，步驟(2)可以包括 收集已知的燃料產(chǎn)品以及相對于不含候選表達(dá)載體的光合生物，候選表達(dá)載體是否增加了 燃料產(chǎn)品的生產(chǎn)。III.商業(yè)方法本文還提供了出售碳信用額的商業(yè)方法，其包括獲得組合物的δ 13C分布 的測量；和將組合物的S13C分布與參照S13C分布進(jìn)行比較；如果該組合物的S13C 分布小于參照S 13C分布，則將碳信用額出售給實體，其中所述實體是組合物的所 有者或使用者。在一些情況下，參照δ 13C分布為大約-32%。。在另一實施方式中， 參照W分布是石油的最大S13C分布。而在另一情況下，參照S13C分布式是大 約-32%。、-35%。、-40%。、-45%。、-50%。、_55%?；?60%。。該方法可以進(jìn)一步包括利用所述測 量標(biāo)記組合物。該方法可以進(jìn)一步包括跟蹤組合物。本文也可以提供商業(yè)方法，其包括將碳信用額提供給生長適合產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的無 維管光合生物的一方。在一些情況下，光合生物被基因修飾。相對于目前的方法，該產(chǎn)生燃 料產(chǎn)品的方法提供了可能更環(huán)境友好的產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法。因此，本文描述的方法和組 合物可以在交換碳信用額的商業(yè)方法中使用。碳信用額可以是補(bǔ)貼(allowance)、許可、信用或類似物，其已經(jīng)被一些相關(guān)主權(quán) 實體(例如但不限于市(包括所有規(guī)模和類型的城市，包括立市(incorporated)和未立市 的(unincorporated)城市)、縣、州或省、或國家，以及相關(guān)政府實體，如區(qū)域的、多國的或 其它國際實體，如聯(lián)合國或歐盟)允許、授權(quán)或承認(rèn)。碳信用額基本上可從規(guī)章制定機(jī)構(gòu)或管理實體直接取得。在其它實例中，它們可 間接地獲得，例如，使用本文所述方法或組合物的實體可以從規(guī)章制定機(jī)構(gòu)直接獲得碳信 用額，并可隨后將該碳信用額轉(zhuǎn)移到另一實體。碳信用額的轉(zhuǎn)移可與給定的使用基因修飾 的無維管光合生物的過程、產(chǎn)品相聯(lián)系，所述生物適合產(chǎn)生燃料產(chǎn)品。例如，第一個實體可被認(rèn)定為是提供可消耗產(chǎn)品，該產(chǎn)品被分配到最終用戶的機(jī) 動貨車(mobile platform)用于消耗，其中所述消耗和/或可消耗產(chǎn)品的生產(chǎn)包括相應(yīng)的 所產(chǎn)生的尾氣。例如，柴油燃料的燃燒通常導(dǎo)致相應(yīng)氮氧化物的環(huán)境釋放，而汽油的燃燒通 常導(dǎo)致相應(yīng)的硫氧化物的釋放。第一方可采用使用上述無維管光合生物生產(chǎn)其產(chǎn)物的方法，或在它們的組合物中 使用由上文所述的無維管光合生物產(chǎn)生的產(chǎn)物，產(chǎn)生與生產(chǎn)例如柴油燃料、汽油、噴氣式發(fā) 動機(jī)燃料等的傳統(tǒng)方法相比對環(huán)境危害較小的影響。因此，方法抵消了終產(chǎn)物對環(huán)境的影 響。第一方可隨后收到碳信用額或尾氣信用額，作為減少總排放的結(jié)果。所述碳信用額可 從調(diào)控或管理機(jī)構(gòu)取得，或可從第二方被轉(zhuǎn)移到第一方，其中所述第二方可已經(jīng)向第一方 賣出了無維管光合生物或無維管光合生物的產(chǎn)物。碳信用額可被交換為很容易變現(xiàn)的金融票據(jù)。例如，碳信用額可被交換為現(xiàn)金等 價物，如現(xiàn)金、支票等。碳信用額也可被交換為關(guān)于知識產(chǎn)權(quán)的法律授權(quán)，例如，但不限于， 轉(zhuǎn)讓(assignment)或許可(license)。碳信用額也可被交換為政府稅務(wù)補(bǔ)貼，或許可給定 市場的購買者。碳信用額也可被交換為使用另一碳釋放過程，如不包含培養(yǎng)所述生物的過 程。例如，一方可擁有在一個時間段內(nèi)如一個月或一年可釋放的有限量的排放，而且如果超 過該限度可能產(chǎn)生罰款或處罰。然而，用碳信用額，超過限度的一方可交換碳信用額以抵消罰款或處罰，或在確定由該方產(chǎn)生的排放量時碳信用額可被考慮進(jìn)去。商業(yè)方法也可以包括在出售碳信用額的同時，生產(chǎn)產(chǎn)物如燃料產(chǎn)品、香料等。本文的商業(yè)方法也考慮出售不是燃料產(chǎn)品的產(chǎn)物，如香料和殺蟲劑。與燃料產(chǎn)品 有關(guān)的商業(yè)方法——包括涉及碳信用額使用的那些，也與其他類型的有用產(chǎn)品和材料的生 產(chǎn)相關(guān)。本文提供的另外的方法是標(biāo)記組合物的方法，其包括獲得組合物的δ 13C分布的 測量；和利用該測量標(biāo)記組合物。在一些實施方式中，標(biāo)記包括指示組合物的S13C分布。 在一些實施方式中，標(biāo)記包括指示組合物的S13C分布并且組合物的δ 13C分布的測量為小 于-32%。。在一種情況下，組合物是可以包含燃料成分的燃料產(chǎn)品。標(biāo)記可以包括添加物理 標(biāo)記到組合物或者添加物理標(biāo)記至包含組合物的包裝中。標(biāo)記步驟可以包括計算機(jī)可讀標(biāo) 記和/或指示可再生來源的標(biāo)記。在一些方面，本文描述的方法可以進(jìn)一步包括跟蹤組合 物的步驟。在一些方面，跟蹤包括1)將未知組合物的碳同位素分布與所述測量進(jìn)行比較； 2)確定組合物的位置；和/或3)用計算機(jī)系統(tǒng)監(jiān)測組合物。盡管本文示出并描述了本發(fā)明的示例性實施方式，但是這些實施方式僅僅通過實 例來提供對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的?，F(xiàn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到許多改變、變化 以及替代而不背離本發(fā)明。應(yīng)該理解，本文描述的本發(fā)明實施方式的各種替代方式可以在 本發(fā)明的實踐中使用。實施例1在萊因衣藻中牛產(chǎn)單萜合酶在本實施例中，編碼來自綠薄荷(Mspicata)的苧烯合酶的核酸被引入萊因衣 藻。轉(zhuǎn)化DNA被圖解示于圖IA中。在這種情況下，標(biāo)記“轉(zhuǎn)基因”的片段是編碼苧烯合酶的 基因，其由來自萊茵衣藻的PsbA基因的5’ UTR和啟動子序列以及來自萊茵衣藻的psbA基 因的3’ UTR調(diào)節(jié)，而標(biāo)記“選擇標(biāo)記”的片段是來自細(xì)菌的卡那霉素抗性編碼基因，其由來 自萊茵衣藻的atpA基因的5’UTR和啟動子序列以及來自萊茵衣藻的rbcL基因的3’UTR調(diào) 節(jié)。轉(zhuǎn)基因盒通過標(biāo)記“同源物A”和“同源物B”的片段——其分別與5’側(cè)和3’側(cè)上psbA 基因座側(cè)翼的DNA序列相同——靴向萊茵衣藻的psbA基因座。在這種轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建中進(jìn) 行的所有 DNA操作基本上如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989)禾口 Cohen 等 Meth. Enzymol. 297，192—208，1998 中 所描述。對于這些實驗，所有的轉(zhuǎn)化在萊茵衣藻株137c(mt+)上進(jìn)行。在23°C，在設(shè)置為 IOOrpm的搖床上，在450Lux的恒定照明下，細(xì)胞在0. 5mM 5-氟脫氧尿嘧啶的存在下在TAP 培養(yǎng)基(Gorman 和 Levine，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 54 1665-1669，1965，其通過引用并 入本文)中生長至對數(shù)后期(大約7天)。在23°C，通過以4，000 Xg離心5min收獲50ml 的細(xì)胞。倒出上清液并將細(xì)胞重懸于4ml TAP培養(yǎng)基中，用于隨后通過粒子轟擊進(jìn)行葉綠 體轉(zhuǎn)化(Cohen等人，同上，1998)。所有轉(zhuǎn)化都在卡那霉素(100 μ g/ml)選擇下進(jìn)行，其中 抗性由圖IA中標(biāo)記“選擇標(biāo)記”的片段所編碼的基因賦予(Chlamydomonas Stock Center, Duke University)。PCR被用于鑒定轉(zhuǎn)化株。為了進(jìn)行PCR分析，IO6個藻類細(xì)胞(來自瓊脂板或液體 培養(yǎng)基)懸浮在IOmM EDTA中并且加熱至95°C 10分鐘，然后冷卻至接近23°C。制備由反
31應(yīng)緩沖液、MgC12、dNTPs、PCR引物對(一對或多對)、DNA聚合酶和水組成的PCR混合物。 EDTA中的藻類裂解物被加入以提供反應(yīng)模板。改變鎂濃度以補(bǔ)償所加入的EDTA中藻類裂 解物的量和濃度。使用退火溫度梯度以確定具體引物對的最佳退火溫度。為了鑒別包含苧烯合酶基因的株，使用其中一個引物退火定位在psbA5’ UTR內(nèi)而 另外的引物退火定位在苧烯合酶編碼片段內(nèi)部的引物對。期望的克隆是產(chǎn)生預(yù)期大小的 PCR產(chǎn)物的那些克隆。為了確定內(nèi)源基因座位被置換(異質(zhì)對同質(zhì))的程度，使用由兩組引 物對組成的PCR反應(yīng)(在相同的反應(yīng)中)。第一對引物擴(kuò)增由表達(dá)載體靶向的內(nèi)源基因座 并且由在psbA5’ UTR內(nèi)退火的引物和在psbA編碼區(qū)內(nèi)退火的引物組成。第二對引物擴(kuò)增 不被表達(dá)載體靶向的恒定(常規(guī))區(qū)或?qū)φ諈^(qū)，因此在所有的情況下應(yīng)該產(chǎn)生預(yù)期大小的 產(chǎn)物。這種反應(yīng)證實了來自內(nèi)源基因座的PCR產(chǎn)物的缺乏不是由抑制PCR反應(yīng)的細(xì)胞和/ 或其它污染物引起的。改變引物對的濃度以便兩個反應(yīng)都在相同的管中進(jìn)行；然而，內(nèi)源基 因座的引物對是常規(guī)對的濃度的5倍。使用的循環(huán)數(shù)是>30，以增加靈敏度。最期望的克 隆是產(chǎn)生恒定區(qū)產(chǎn)物但是不產(chǎn)生內(nèi)源基因基因座產(chǎn)物的那些。期望的克隆也是相對于對照 反應(yīng)產(chǎn)生弱強(qiáng)度內(nèi)源基因座產(chǎn)物的那些。除非另外指明，表達(dá)苧烯合酶的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)是在23°C，在設(shè)置為 lOOrpm的搖床上，在黑暗中在液體TAP培養(yǎng)基上進(jìn)行的。在收獲之前，以每ml 1X107個細(xì) 胞的密度保持培養(yǎng)至少48小時。為了確定苧烯合酶基因是否導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化的藻類細(xì)胞中表達(dá)苧烯合酶，通過免疫印 跡免疫沉淀并顯示兩種可溶性蛋白質(zhì)。簡而言之，通過在4°C以4000X g離心15分鐘，收 獲500ml藻類細(xì)胞培養(yǎng)物。輕輕地倒出上清液并將細(xì)胞重懸于10ml的裂解緩沖液(100mM Tris-HCl,pH = 8. 0,300mM NaCl, 2% Tween-20)中。通過超聲處理裂解細(xì)胞(以 35%功率， 10 X 30sec)。通過在4°C以14，000 X g離心1小時，使裂解物變清。除去上清液并且在4°C與 抗FLAG抗體-結(jié)合的瓊脂糖樹脂溫育10小時。通過重力過濾(gravityfiltration)從裂 解物分離樹脂并且用洗滌緩沖液(100mM Tris-HCl，pH = 8. 0,300mM NaCl, 2% Tween-20) 洗滌3次。來自多個樣品的免疫印跡分析結(jié)果(圖2)顯示確實產(chǎn)生了苧烯合酶。為了確定藻類葉綠體中產(chǎn)生的苧烯合酶是否是功能性酶，檢測了苧烯從GPP的產(chǎn) 生。簡單地，50uL苧烯合酶-結(jié)合的瓊脂糖(上面制備的相同樣品)懸浮在300uL具有 0. 33mg/mL GPP 的反應(yīng)緩沖液(25mM HEPES，pH = 7. 2，100mM KC1, lOmM MnC12,10%甘油和 5mM DTT)中，并且轉(zhuǎn)移到玻璃管中。用庚烷覆蓋反應(yīng)并在23°C溫育12小時。通過渦旋混 合物淬滅反應(yīng)并且萃取。除去0. lmL的庚烷并且通過GC-MS分析樣品。結(jié)果示于圖3中。也檢測了來自粗制的細(xì)胞裂解物的苧烯合酶活性。簡而言之，通過在4°C以 4000Xg離心15分鐘，收獲50ml藻類細(xì)胞培養(yǎng)物。輕輕地倒出上清液并將細(xì)胞重懸于 0. 5ml 的反應(yīng)緩沖液(25mM HEPES，pH= 7. 2，100mM KC1, lOmM MnC12,10%甘油和 5mM DTT) 中。通過超聲處理裂解細(xì)胞(以35%功率，10X30sec)。向裂解物加入0. 33mg/mL的GPP， 并將混合物轉(zhuǎn)至玻璃管中。用庚烷覆蓋反應(yīng)并在23°C溫育12小時。通過渦旋混合物淬滅 反應(yīng)并且萃取。除去0. lmL的庚烷并且通過GC-MS分析樣品。結(jié)果示于圖3中。實施例2在萊因衣藻中生產(chǎn)FPP合酶和倍半萜合酶在本實施例中，將編碼來自原雞(G. gallus)的FPP合酶和來自羅勒
32(0. basilicum)的姜烯合酶(zingiberene synthase)的核酸被引入萊茵衣藻。轉(zhuǎn)化DNA被 圖解示于圖1C中。在這種情況下，標(biāo)記“轉(zhuǎn)基因1”的片段是編碼FPP合酶的基因，其由來 自萊茵衣藻的psbD基因的5’UTR和啟動子序列以及來自萊茵衣藻的psbA基因的3’UTR調(diào) 節(jié)，標(biāo)記“轉(zhuǎn)基因2”的片段是編碼姜烯合酶的基因，其由來自萊茵衣藻的psbD基因的5’UTR 和啟動子序列以及來自萊茵衣藻的psbA基因的3’ UTR調(diào)節(jié)，而標(biāo)記“選擇標(biāo)記”的片段是 來自細(xì)菌的卡那霉素抗性編碼基因，其由來自萊茵衣藻的atpA基因的5’ UTR和啟動子序 列以及來自萊茵衣藻的rbcL基因的3’ UTR調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因盒通過標(biāo)記“同源物C”和“同源 物D”的片段——其分別與5’側(cè)和3’側(cè)上3HB基因座側(cè)翼的DNA序列相同——靴向萊茵 衣藻的3HB基因座。在這種轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建中進(jìn)行的所有DNA操作基本上如Sambrook等， Molecular Cloning :ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) 和 Cohen 等 Meth. Enzymol. 297，192-208，1998 中所描述。對于這些實驗，所有的轉(zhuǎn)化在萊茵衣藻株137c(mt+)上進(jìn)行。在23°C，在設(shè)置為 lOOrprn的搖床上，在450Lux的恒定照明下，細(xì)胞在0. 5mM 5-氟脫氧尿嘧啶的存在下在TAP 培養(yǎng)基(Gorman 和 Levine，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 54 :1665_1669，1965，其通過引用并 入本文)中生長至對數(shù)后期(大約7天)。在23°C，通過以4，000Xg離心5min收獲50ml 細(xì)胞。輕輕倒出上清液并將細(xì)胞重懸于4ml TAP培養(yǎng)基中，用于隨后通過粒子轟擊進(jìn)行的 葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等人，見上文，1998)。所有轉(zhuǎn)化都在卡那霉素(lOOyg/ml)選擇下進(jìn) 行，其中抗性由圖1C中標(biāo)記“選擇標(biāo)記”的片段所編碼的基因賦予(Chlamydomonas Stock Center, Duke University)。PCR被用于鑒定轉(zhuǎn)化株。為了進(jìn)行PCR分析，106個藻類細(xì)胞(來自瓊脂板或液體 培養(yǎng))懸浮在10mM EDTA中并且加熱至95°C 10分鐘，然后冷卻至接近23°C。制備由反應(yīng) 緩沖液、MgC12、dNTPs、PCR引物對(一對或多對)、DNA聚合酶和水組成的PCR混合物。加 入EDTA中的藻類裂解物以提供反應(yīng)模板。改變鎂濃度以補(bǔ)償所加入的EDTA中藻類裂解物 的量和濃度。使用退火溫度梯度以確定具體引物對的最佳退火溫度。為了鑒別包含F(xiàn)PP合 酶基因的株，使用其中一個引物退火定位在psbD 5’UTR內(nèi)而另外的引物退火定位在FPP合 酶編碼片段內(nèi)部的引物對。為了鑒別包含姜烯合酶基因的株，使用其中一個引物退火定位 在psbD 5’ UTR內(nèi)而另外的引物退火定位在姜烯合酶編碼片段內(nèi)部的引物對。期望的克隆 是在兩個反應(yīng)中產(chǎn)生預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。為了確定內(nèi)源基因座被置換(異質(zhì) 對同質(zhì))的程度，使用由兩組引物對組成的PCR反應(yīng)(在相同的反應(yīng)中)。第一對引物擴(kuò)增 由表達(dá)載體靶向的內(nèi)源基因座。第二對引物擴(kuò)增不被表達(dá)載體靶向的恒定(常規(guī))區(qū)或?qū)?照區(qū)，因此在所有的情況下應(yīng)該產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物。這種反應(yīng)證實了來自內(nèi)源基因座的 PCR產(chǎn)物的缺乏不是由抑制PCR反應(yīng)的細(xì)胞和/或其它污染物引起。改變引物對的濃度以 便兩個反應(yīng)在相同的管中進(jìn)行；然而，內(nèi)源基因座的引物對是常規(guī)對的濃度的5倍。使用的 循環(huán)數(shù)是> 30，以增加靈敏度。最期望的克隆是產(chǎn)生恒定區(qū)產(chǎn)物但是不產(chǎn)生內(nèi)源基因基因 座產(chǎn)物的那些。期望的克隆也是相對于對照反應(yīng)產(chǎn)生弱強(qiáng)度內(nèi)源基因座產(chǎn)物的那些。為了保證FPP合酶基因和姜烯合酶基因的存在導(dǎo)致FPP合酶和姜烯合酶酶的表 達(dá)，進(jìn)行了免疫印跡。從TAP瓊脂培養(yǎng)基收集大約1x10s個藻類細(xì)胞并且懸浮在0. 05ml裂 解緩沖液(Bugbuster ；Novagen)中。溶液被加熱至95°C 5分鐘，然后冷卻至23°C。裂解物 與加樣緩沖液(XT樣品緩沖液；Bio-Rad)以3 1混合，樣品加熱至95°C 1分鐘，冷卻至
3323°C，并且通過離心除去不溶性蛋白質(zhì)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)通過SDS-PAGE分離之后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。在23°C，用TBST+5%干脫脂奶粉封閉膜30分鐘，在4°C，與抗FLAG抗體(在TBST+5% 干脫脂牛奶中1 2，500稀釋)溫育10小時，用TBST洗滌三次，在23°C，與辣根連接的抗 小鼠抗體(在TBST+5%干脫脂奶粉中1 5，000稀釋)溫育1小時，并用TBST洗滌三次。 用化學(xué)發(fā)光檢測顯示蛋白質(zhì)。來自多個克隆的結(jié)果(圖4)顯示GPP合酶基因在導(dǎo)致蛋白 質(zhì)產(chǎn)生的萊茵衣藻細(xì)胞中表達(dá)。除非另外指明，表達(dá)FPP合酶和姜烯合酶的萊茵衣藻轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)是在23°C，在 設(shè)置為lOOrpm的搖床上，在5，OOOLux的恒定照明下在液體TAP培養(yǎng)基上進(jìn)行的。在收獲 之前，以每ml IX 107個細(xì)胞的密度保持培養(yǎng)至少48小時。為了確定藻類葉綠體中產(chǎn)生的FPP合酶和姜烯合酶是否是功能性的，檢測了來自 DMAPP和IPP的倍半萜的產(chǎn)生。簡而言之，通過在4°C以4000 Xg離心15分鐘，收獲50ml 藻類細(xì)胞培養(yǎng)物。輕輕地倒出上清液并將細(xì)胞重懸于0.5ml的反應(yīng)緩沖液(25mM HEPES， pH = 7. 2,100mM KC1, lOmM MnC12，10%甘油和5mM DTT)中。通過超聲處理裂解細(xì)胞(以 35%功率，10X30sec)。向裂解物加入0. 33mg/mL的FPP，并將混合物轉(zhuǎn)至玻璃管中。用庚 烷覆蓋反應(yīng)并在23°C溫育12小時。通過渦旋混合物淬滅反應(yīng)并且萃取。除去0. lmL的庚 烷并且通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析樣品。實施例3句,括與煙道氣梓觸牛長的藻類的樣品的5 ^C分布測量用于液體樣品分析的技術(shù)是EA_IRMS(元素分析儀同位素比質(zhì)譜法)。在該方法 中，稱量樣品和參照放入錫膠囊中、密封并加載到Europa Scientific元素分析儀上的自 動取樣器中。然后，樣品順序放到保持在1000°C的爐中并且在氧的存在下燃燒。該錫膠 囊迅速燃燒，在樣品區(qū)域升溫至 1700°C。在氦流中將燃燒氣體掃過燃燒催化劑(Cr203)、 氧化銅絲(用于氧化烴)和銀絨線(silver wool)，以除去硫和鹵化物。得到的氣體N2、 N0X、H20、02和C02通過保持在600°C的純銅絲的還原臺。這除去了任何氧并且將N0X種類 轉(zhuǎn)化為N2。高氯酸鎂化學(xué)阱(chemical trap)被用于除去水。禾U用保持在100°C的恒定溫 度下的填充柱氣相層析，分離氮和二氧化碳。得到的二氧化碳峰進(jìn)入Europa Scientific 20-20IRMS的離子源，在其中被離子化并被加速。在磁場中分離不同質(zhì)量的氣體種類，然后 同時利用法拉第筒集電器陣列(Faraday cup collector array)測量，以測量C02在m/z 44、45和46的同位素。分批進(jìn)行分析，通過該分析，在分析參照之后，分析許多樣品，然后 分析另一參照。用于分析的參照材料包括IA-R001 (Iso-Analytical工作標(biāo)準(zhǔn)粉，S 13CVPDB =-26. 43% )。在樣品分析期間，測量了 IAEA-CH-6 (IAEA 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)，8 13CVPDB = -10. 43% ) 和IA-R005 (Iso-Analytical工作標(biāo)準(zhǔn)甜菜糖標(biāo)準(zhǔn)，S 13CVPDB = -26. 03% )，用于質(zhì)量控 制。IAEA-CH-6是國際能源機(jī)構(gòu)(IAEA)發(fā)布的實驗室間比較標(biāo)準(zhǔn)。IA-R001和IA-R006 相對校準(zhǔn)并且起源于IAEA-CH-6。用于碳-13分析的參照材料包括相對PDB具有S 13C值 為-28. 06%。的 Iso-Analytical 礦物油標(biāo)準(zhǔn)(IA-R002)。IA-R002 起源于 NBS-22 (礦物油)， 由 IAEA 發(fā)布，具有相對 PDB 為-29. 81 %。的接受 S 13C 值。IA-R002、IA-R024 (Iso-Analytical 橄欖油標(biāo)準(zhǔn)，-29. 27%。的 8 13C,起源于 NBS-22)和 IA-R044 (Iso-Analytical 玉米油標(biāo) 準(zhǔn)，-16. 27%。的5 13C，起源于NBS-22)被用作每一批樣品分析中的質(zhì)量控制檢查樣品。用于分析二氧化碳樣品的技術(shù)是GC-IRMS(氣相色譜同位素比質(zhì)譜)。在這種技術(shù)中，利用注射器和針，從氣體包(裝配有隔片)取等份的樣品氣體。氣體樣品被注入填充 柱氣相色譜儀(柱類型:Porapak Q,80/100目，6，x 74”SS)，以分辨二氧化碳，并且其被保 持在40°C的等溫GC溫度下。使用20psi的柱壓，通過柱的流速大約為60ml/min。得到的 C02色譜峰進(jìn)入Europa Scientific 20-20IRMS的離子源，在其中被離子化并被加速。在磁 場中分離不同質(zhì)量的氣體種類，然后同時利用法拉第筒集電器陣列測量，以測量C02在m/ z 44、45和46的同位素，用于13C分析。使用與樣品相同的流動路徑，參照氣體(C02)樣品 被注入GC-IRMS。用于確定樣品氣體的S13C值的參照氣體是IA-R060(對于V-PDB，6 13C =-35. 63% )。IA-R060 起源于 NBS-19 (對于 V-PDB，8 13C 值為 +1. 95% )，其被位于維也 納的國際能源機(jī)構(gòu)公布為同位素參照標(biāo)準(zhǔn)。分析IA-R060的樣品，作為檢查樣品以及用于 質(zhì)量控制的樣品。測量許多樣品化合物包括作物植物(如甜菜糖、蔗糖、橄欖油、玉米油、小麥面粉 和甘蔗糖)、氣體樣品(如環(huán)境空氣和煙道氣)以及原油的S13C分布的實驗結(jié)果。作為比 較，測量藻類樣品(生長在環(huán)境空氣中的藻類、生長在有限二氧化碳煙道氣中的藻類以及 生長在過量二氧化碳煙道氣中的藻類)的S13C分布，以顯示來自無機(jī)碳源的碳到有機(jī)分子 的碳固定摻入，所述有機(jī)分子如本文所述的燃料產(chǎn)品或組合物。結(jié)果總結(jié)在圖5中。作物植物，一般生長在環(huán)境空氣中，顯示出-20. 02%。的平均S13C分布。作物植物 的S 13c分布值的范圍是-10. 43%。(對于蔗糖)至-29. 28%。(對于橄欖油)。作物植物的 其它5 13C值包括對甘蔗糖為-11. 66%。，對玉米油為-16. 22%。，對于甜菜糖為-26. 03%。以 及對于小麥面粉為-26. 47%。。所有這些S13C值都大于-32%。。石油原油樣品取自9個不同的來源。原油樣品的平均813(為_27.76%。，并且 在-26. 77%。至-30. 18%。的范圍。這些值與礦物燃料的5 13C的文獻(xiàn)值一致。所有這些S 13C 值都大于-32%。，并且因此，沒有顯示出從最近生長(在50年之內(nèi))光合生物提取的產(chǎn)物 或組合物的5 13C分布，所述光合生物與煙道氣或來自礦物燃料的無機(jī)碳源接觸，如本文所 述。如圖5所示，煙道氣顯示出-35. 92%。的S13C分布。煙道氣可以來自石油或礦物 燃料產(chǎn)品的燃燒。作為比較，環(huán)境空氣S13C分布被認(rèn)為是大約-8%。至-8. 5%。。藻類利用將氣體鼓泡通過光生物反應(yīng)器而生長。生長了三種不同類型的藻類一 種與環(huán)境空氣接觸生長，一種與有限的煙道氣接觸生長而一種則與過量煙道氣接觸生長。 例如，生長在有限煙道氣中的藻類用來自煙道氣的二氧化碳?xì)怏w鼓泡，其中氣體中二氧化 碳的量與環(huán)境空氣中二氧化碳的量類似(或小于大約1%)。例如，生長在過量煙道氣中的 藻類由包括來自煙道氣的二氧化碳的氣體鼓泡，其中所提供氣體中二氧化碳的量為氣體總 量的大約3-7% (或大約5%)。同樣地，分析了兩種另外的藻類樣品，生長在露天池塘中單 獨設(shè)施處有限煙道氣中的藻類，和生長在單獨設(shè)施處主要過量煙道氣中的藻類。然后干燥 并燃燒藻類樣品以測量這些樣品的S13C分布，如在這里本實施例中所描述的。在圖5中圖解了生長在環(huán)境空氣、有限煙道氣和過量煙道氣中的藻類樣品的S 13C 分布的測量結(jié)果。生長在環(huán)境空氣中的一個藻類樣品具有-12. 90%。的S13C分布，這個結(jié) 果是預(yù)期的，原因是，如所討論的，例如由于如本文所述的RuBisCO酶，光合生物在光合作 用過程中可以對12C而不是13C具有偏愛性。因此，其中的光合生物和有機(jī)分子應(yīng)該具有小 于無機(jī)碳源的S13C分布的S13C分布。
6個生長在有限煙道氣中的藻類樣品被分析并且具有-22. 57%。的平均5 13C分布 以及-14. 87%。至-32. 03%。的范圍。變化可能是由于所提供的煙道氣的量、煙道氣的速率、 藻類種類的差異——其可能具有更有效的碳固定或RuBisCO，或者在生長期間提供給生物 的光量所引起。作為實例，兩個藻類樣品提供了在-14. 87%。和-16. 28%。的最高W，這些 樣品的兩個與另外四個樣品相比，與更高量的碳酸氫鹽接觸生長。碳酸氫鹽具有比煙道氣 更大的S13C值，并且也是藻類的無機(jī)碳源，因此，這些值最有可能由于碳酸氫鹽和煙道氣 在這些生物中的碳固定而更低。5個生長在過量煙道氣中的藻類樣品被分析并且具有-52. 06%。的平均5 13C分 布以及-40. 65%。至-55. 34%。的范圍。過量煙道氣是由礦物燃料的燃燒提供的煙道氣。生 長在過量煙道氣中的藻類的S13C值都小于-32%。。藻類中的有機(jī)分子已經(jīng)用煙道氣的無 機(jī)碳進(jìn)行了碳固定，以便這些分子具有低的S 13C分布——比在石油或其它礦物燃料中發(fā) 現(xiàn)的更低的S13C分布。組合物和/或燃料產(chǎn)品可以從包含小于_32%。(例如-40. 65%。 至-55. 34%。)的S13C分布的藻類中提取并純化。除了 S13C分布小于已知的石油S13C分 布和本實施例中測量的石油S13C分布之外，組合物可以與用于燃料產(chǎn)品的石油組合物相 同或相似。
3權(quán)利要求
組合物，其包括包含氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少80％，并且其中所述組合物的δ13C分布為小于-32‰。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其包括異戊二烯單元。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少90%。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少95%。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少99%。
6.權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的100%。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為液體。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為燃料添加劑。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為燃料產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為萜或類萜。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物不是脂肪酸。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物不是脂肪酸酯。
13.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的δ13C分布為小于-35%。。
14.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的δ13C分布為小于-40%。。
15.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物具有85-120的辛烷值。
16.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物具有大于90的辛烷值。
17.燃料產(chǎn)品，其包括a.組合物，其包括包含氫和碳原子的分子，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重 量的至少80%，并且其中所述組合物的δ 13C分布為小于-32%。；和b.燃料成分。
18.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述燃料成分為選自下述的調(diào)合燃料礦物燃 料、用于燃料調(diào)合的混合物、汽油、柴油、乙醇、噴氣式發(fā)動機(jī)燃料和其任何組合。
19.權(quán)利要求18所述的燃料產(chǎn)品，其中所述調(diào)合燃料具有大于-32%。的δ13C分布。
20.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述燃料成分是選自下述的燃料添加劑ΜΤΒΕ、 抗氧化劑、抗靜電劑、緩蝕劑和它們的任何組合。
21.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述組合物包括異戊二烯單元。
22.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少 90%。
23.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少 95%。
24.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的至少 99%。
25.權(quán)利要求22所述的燃料產(chǎn)品，其中所述氫和碳原子為所述組合物的重量的100%。
26.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述組合物為萜或類萜。
27.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述組合物為液體。
28.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述組合物不是脂肪酸。
29.權(quán)利要求17所述的燃料產(chǎn)品，其中所述組合物不是脂肪酸酯。
30.產(chǎn)生二氧化碳的方法，其包括燃燒組合物從而產(chǎn)生二氧化碳，其中所述二氧化碳具有小于-32%。的δ 13C分布。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述二氧化碳具有小于-35%。的δ13C分布。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述二氧化碳具有小于-40%。的δ13C分布。
33.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述燃燒在汽油發(fā)動機(jī)中進(jìn)行。
34.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述燃燒在柴油發(fā)動機(jī)中進(jìn)行。
35.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述燃燒在噴氣式發(fā)動機(jī)中進(jìn)行。
36.權(quán)利要求30所述的方法，進(jìn)一步包括從無維管光合生物提取所述組合物。
37.權(quán)利要求36所述的方法，進(jìn)一步包括上調(diào)所述生物中的酶，其中所述酶的產(chǎn)物是 所述組合物。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述酶不自然存在于所述生物中。
39.標(biāo)記組合物的方法，其包括a.獲得所述組合物的δ13C分布的測量；和b.利用所述測量標(biāo)記所述組合物。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述標(biāo)記包括指示所述組合物的δ13C分布的測量。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述組合物的δ13C分布的測量為小于-32%。。
42.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述組合物是燃料產(chǎn)品。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述組合物包括燃料成分。
44.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述標(biāo)記包括指示可再生來源。
45.權(quán)利要求39所述的方法，進(jìn)一步包括跟蹤所述組合物。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述跟蹤包括將未知組合物的碳同位素分布與所述 測量進(jìn)行比較。
47.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述跟蹤包括確定所述組合物的位置。
48.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述跟蹤包括用計算機(jī)系統(tǒng)監(jiān)測所述組合物。
49.從無維管光合生物產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法，其包括a.培養(yǎng)無維管光合生物，其中所述生物產(chǎn)生第一燃料產(chǎn)品；b.使所述生物與無機(jī)碳源接觸；和c.將來自所述無機(jī)碳源的碳摻入所述第一燃料產(chǎn)品， 其中所述第一燃料產(chǎn)品具有小于_32%。的δ 13C分布。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述無機(jī)碳源包括含有13C的二氧化碳和含有12C的二氧化碳。
51.權(quán)利要求49所述的方法，其中使所述生物與無機(jī)碳源接觸包括使所述生物與過量 無機(jī)碳源接觸。
52.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述生物包括一個或多個核酸，所述一個或多個核 酸編碼其終產(chǎn)物是所述第一燃料產(chǎn)品的一種或多種酶。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述核酸是異源的。
54.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一燃料產(chǎn)品不是由所述生物自然產(chǎn)生的。
55.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一燃料產(chǎn)品包括萜或類萜。
56.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述無機(jī)碳是礦物燃料無機(jī)碳。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述礦物燃料無機(jī)碳具有大于-32%。的δ13C分布。
58.權(quán)利要求49所述的方法，進(jìn)一步包括提取所述第一燃料產(chǎn)品。
59.權(quán)利要求58所述的方法，進(jìn)一步包括精煉所述第一燃料產(chǎn)品。
60.權(quán)利要求59所述的方法，其中所述精煉包括選自下述方法的至少一種加氫裂解、 催化裂化、蒸汽裂解、裂化、分餾、蒸餾、加氫處理和其任何組合。
61.權(quán)利要求58所述的方法，進(jìn)一步包括產(chǎn)生包含所述第一燃料產(chǎn)品和燃料成分的燃 料廣品。
62.權(quán)利要求49所述的方法，進(jìn)一步包括燃燒所述第一燃料產(chǎn)品以及因此產(chǎn)生富S13C 的無機(jī)碳。
63.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述富δ13C的無機(jī)碳具有小于-32%。的δ 13C分布。
64.出售碳信用額的商業(yè)方法，其包括a.獲得組合物的δ13C分布的測量；和b.將所述組合物的δ13C分布與參照δ 13C分布進(jìn)行比較；c.如果所述組合物的S13C分布小于參照δ13C分布，則出售碳信用額給實體，其中所 述實體是所述組合物的所有者或使用者。
65.權(quán)利要求64所述的方法，其中所述參照313(分布為大約-32%0。
66.權(quán)利要求64所述的方法，進(jìn)一步包括利用所述測量標(biāo)記所述組合物
67.權(quán)利要求64所述的方法，進(jìn)一步包括跟蹤所述組合物。
68.產(chǎn)生燃料產(chǎn)品的方法，其包括；a.培養(yǎng)無維管光合生物；b.使所述生物與煙道氣接觸；和c.從所述無維管光合生物中提取燃料產(chǎn)品。
69.權(quán)利要求68所述的方法，進(jìn)一步包括基因修飾所述生物。
70.權(quán)利要求69所述的方法，其中所述燃料產(chǎn)品不是自然存在于所述生物中。
71.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述燃料產(chǎn)品包括氫和碳原子，其中所述氫和碳原 子為所述組合物的重量的至少90%，并且其中所述組合物的δ 13C分布為小于_32%0。
72.權(quán)利要求68所述的方法，進(jìn)一步包括精煉所述燃料產(chǎn)品。
全文摘要
本文提供的是通過光合生物生產(chǎn)產(chǎn)物的組合物和方法。光合生物可以被基因修飾以影響產(chǎn)物的產(chǎn)生、表達(dá)或兩者。所述方法和組合物在石化工業(yè)中特別有用。
文檔編號C10L1/00GK101889068SQ200880115332
公開日2010年11月17日 申請日期2008年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者A·阿拉瓦尼斯, J·派爾 申請人:藍(lán)寶石能源公司