本發(fā)明涉及了微流控技術(shù)、生物分子親和性、spri等多個(gè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于多濃度梯度檢測蛋白和核酸適體之間親和力的微液滴陣列的生成裝置及其使用方法。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、spri(surface?plasmon?resonance?imaging)即表面等離子共振成像技術(shù)，是一種可以檢測生物傳感芯片上配體與分析物之間相互作用的技術(shù)。該技術(shù)基于表面等離子共振現(xiàn)象，通過監(jiān)測生物分子結(jié)合在金屬表面上時(shí)引起的光信號變化來實(shí)時(shí)檢測生物分子的相互作用，繼而可以表征適配體與其他分子之間的親和力，以篩選高親和力的適配體，因此適用于藥物篩選、生物標(biāo)志物檢測、相互作用研究、傳感器等領(lǐng)域。與其他親和力測定方法相比，spri技術(shù)具有高靈敏度、實(shí)時(shí)監(jiān)測、無標(biāo)記等優(yōu)勢。然而，雖然spri可用于適配體的高通量篩選，但在點(diǎn)樣過程中卻需要技術(shù)要求較高和成本高昂的點(diǎn)膠機(jī)，后者是一種將流體點(diǎn)滴、涂覆于產(chǎn)品表面或產(chǎn)品內(nèi)部的自動化機(jī)器，在電子、電器、汽車、醫(yī)療器械等生產(chǎn)制造行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。點(diǎn)膠機(jī)的購買成本較高，在基層不易推廣與應(yīng)用；且維護(hù)成本高，需要定期特定的清洗劑和工具進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，繼而又增加了生產(chǎn)成本；此外，點(diǎn)膠機(jī)的操作和維護(hù)也對操作人員技術(shù)有一定的要求。總之，使用點(diǎn)膠機(jī)的成本和技術(shù)要求一定程度上阻礙了spri技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。而為了降低成本，往往用移液槍來代替點(diǎn)膠機(jī)，這就導(dǎo)致點(diǎn)出的液滴體積高達(dá)0.25μl，大大降低樣品規(guī)模和芯片利用率，進(jìn)而降低檢測效率并導(dǎo)致成本過高。

2、微液滴陣列技術(shù)是近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的一項(xiàng)重要技術(shù)。在檢測蛋白和核酸適配體親和力的過程中，該技術(shù)能夠快速、精確地篩選出具有高親和性的配體，并且可以實(shí)現(xiàn)高效、大規(guī)模的樣品處理，因此在生物醫(yī)學(xué)研究中，高通量篩選檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、蛋白相互作用分析等方面。與傳統(tǒng)的點(diǎn)樣檢測技術(shù)相比，微流控技術(shù)具有主要優(yōu)勢，包括減少樣品/試劑消耗，降低檢測成本；更重要的是，因其能精確操作小液體量(4-10nl)而增強(qiáng)了在各種微流控技術(shù)中單細(xì)胞分析的適用性，因?yàn)樗褂眉{升體積的油包水乳化液液滴作為微反應(yīng)器，防止了不同樣品之間的交叉污染，減少了芯片表面與試劑之間的不良相互作用。

3、分子互作研究，比如核酸適體和靶標(biāo)蛋白之間的親和力檢測等，都需要通過具有濃度梯度的微液滴陣列進(jìn)行檢測，但是現(xiàn)有的點(diǎn)膠機(jī)等設(shè)備難以直接點(diǎn)出具有濃度梯度的微液滴，通常需要分別配制不同濃度的樣品溶液才能實(shí)現(xiàn)，需要對點(diǎn)樣通道反復(fù)清洗并更換內(nèi)部溶液，操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，即使結(jié)合自動化設(shè)備也需要較長的樣品準(zhǔn)備時(shí)間。比如中國專利《一種微量納升點(diǎn)樣裝置》(公開(公告)號cn114522747b)提供了一種利用毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)納升級點(diǎn)樣的裝置，但是該裝置只能快速點(diǎn)樣，不能直接點(diǎn)出具有濃度梯度的樣品。

4、因此，急需找到一種液滴陣列點(diǎn)樣技術(shù)，作為液槍以及點(diǎn)膠機(jī)的有效替代方案，且可用于生成具有濃度梯度的微液滴濃度梯度矩陣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對以上問題，本發(fā)明旨在提供一種具有梯度濃度生成、精準(zhǔn)液滴操控、微液滴陣列生成等功能的微液滴陣列生成裝置，以及針對核酸適體非破壞性的微液滴陣列生成，并且該微液滴陣列具有濃度梯度，可用于分子互作研究。該裝置包括吸液機(jī)構(gòu)和點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)，通過吸液機(jī)構(gòu)分別吸取樣品溶液和溶劑，使樣品溶液和溶劑在吸液機(jī)構(gòu)的活塞管中不斷地發(fā)生融合，并且一邊融合一邊經(jīng)點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)的玻璃毛細(xì)管，滴出不同濃度的微液滴，在芯片表面形成微液滴陣列，且各個(gè)微液滴的濃度準(zhǔn)確可控，從而實(shí)現(xiàn)以最簡單的結(jié)構(gòu)、最便利的方法，直接生成濃度梯度微液滴陣列，可用于準(zhǔn)確檢測核酸適體與靶標(biāo)蛋白之間的親和力，也可用于其他分子互作研究。該裝置結(jié)構(gòu)簡單，極大程度上削減成本，降低了spri技術(shù)的使用難度，拓寬了spri技術(shù)的應(yīng)用前景，適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種微液滴濃度梯度陣列生成裝置，所述裝置包含吸液機(jī)構(gòu)和點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)，所述吸液機(jī)構(gòu)用于分別吸取樣品溶液和溶劑；所述點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)包括毛細(xì)管，用于從吸液機(jī)構(gòu)導(dǎo)出液體，并直接在平面點(diǎn)出帶有濃度梯度的微液滴陣列；所述樣品溶液中含有大分子樣品。

3、在一些方式中，所述大分子樣品是指分子粒徑大于1nm的物質(zhì)。

4、與無濃度梯度的相比，將帶有濃度梯度的微液滴陣列應(yīng)用在分子互作領(lǐng)域會增加實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量和可信度，通過深入挖掘數(shù)據(jù)，可以在短時(shí)間內(nèi)篩選到目的互作分子，甚至可以通過一次實(shí)驗(yàn)便可達(dá)到篩選目的，而無需反復(fù)地進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，該特性能加快藥物研發(fā)的進(jìn)程，因?yàn)樵谒幬镅邪l(fā)的過程中，常常需要篩選與細(xì)胞表面受體結(jié)合的物質(zhì)，所述物質(zhì)包含但不限于化合物，以達(dá)到隔斷或激活細(xì)胞之間的信號傳遞。再比如，為靶標(biāo)蛋白篩選最具親和力的核酸適體時(shí)，也需要通過靶標(biāo)蛋白與具有濃度梯度的核酸適體分別結(jié)合和解離來實(shí)現(xiàn)。因此怎樣以更簡單的方式，精確制備濃度梯度微液滴陣列意義重大。

5、本發(fā)明經(jīng)大量研究證明，大分子物質(zhì)在與水混合形成溶液過程中，有一個(gè)較為穩(wěn)定的逐漸融合過程，該過程會使大分子物質(zhì)的濃度隨著融合時(shí)間的延長逐漸降低，直至最后達(dá)到完全平衡。而小分子物質(zhì)由于與水融合速度極快，遇水即迅速分散，無法實(shí)現(xiàn)這個(gè)過程。因此如果能利用大分子物質(zhì)的這個(gè)特性，即在其與水融合的過程中，直接點(diǎn)樣獲得含有不同濃度的大分子微液滴。為此，本發(fā)明研制了一種微液滴濃度梯度陣列生成裝置，該裝置能充分抓住、利用和控制大分子物質(zhì)與水融合的過程，通過最簡單的結(jié)構(gòu)、最簡單的方式，直接形成濃度梯度可控的微液滴陣列。

6、通過吸液機(jī)構(gòu)吸取溶液的方式是生成濃度梯度微液滴陣列的關(guān)鍵。因?yàn)槲簷C(jī)構(gòu)吸取的不是預(yù)先混好的、濃度穩(wěn)定的樣品溶液，而是分開吸取樣品溶液和溶劑，后者導(dǎo)致吸取完所需液體后的吸液機(jī)構(gòu)內(nèi)部的溶液濃度是隨著兩種溶液的混合濃度發(fā)生變化的。當(dāng)先吸取樣品溶液后吸取溶劑時(shí)，隨著時(shí)間的變化，毛細(xì)管滴出的液滴濃度由低到高，因此形成的微液滴陣列也是由低濃度到高濃度；反之，如果先吸取溶劑再吸取樣品溶液的話，則形成由高濃度到低濃度的微液滴陣列。

7、進(jìn)一步地，所述大分子樣品包括核酸或蛋白質(zhì)；所述溶劑包括水和/或緩沖液。

8、大分子物質(zhì)與水融合過程可控，需要滿足以下三個(gè)條件，一是該大分子物質(zhì)能在水中均勻分散或溶解；二是分散或溶解的全過程都能勻速進(jìn)行；三是大分子物質(zhì)在水中分散或溶解所需的時(shí)間不能過長也不能過短，過長導(dǎo)致點(diǎn)樣所需時(shí)間過長導(dǎo)致等待時(shí)間過長，過短導(dǎo)致來不及形成陣列就已分散完全，難以控制。

9、大分子物質(zhì)包括核酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖等，其中優(yōu)選核酸或蛋白質(zhì)，能更有效控制與水融合時(shí)間實(shí)現(xiàn)點(diǎn)樣。其中最優(yōu)選的是核酸，其分子量大小更合適，便于控制，且分散或溶解速度更均勻。

10、可以理解的是，使用該裝置生成的微液滴陣列可以用于分子互作的研究，即將所述樣品溶液(如核酸適體、抗體等)按濃度梯度滴入并固定在陣列中隨后與spri技術(shù)相結(jié)合，篩選與樣品溶液互作的分子，不同樣品固定的方法不一致。樣品溶液包含核酸或蛋白等，與其分子互作的篩選對象也包括核酸或蛋白，因此所述微液滴陣列可以用于探究核酸-核酸、核酸-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的互作，比如用于篩選高親和力的核酸適體，挑選合適的抗體或抗原等等。

11、進(jìn)一步地，所述大分子樣品包括核酸適體，所述核酸適體的堿基長度為40～180bp。

12、核酸適體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列或短的多肽，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合。在合適的堿基長度下，核酸適體在水中分散或溶解速度比較均勻，且所需的整體分散時(shí)間能夠控制在90～120s，從而可以實(shí)現(xiàn)每隔10s左右能滴出不同濃度的微液滴，并且在4s以內(nèi)的液滴濃度基本保持穩(wěn)定。

13、進(jìn)一步地，所述樣品溶液中的核酸適體濃度為1～20μmol/l；所述樣品溶液和溶劑的體積比為1:3～1:10。

14、進(jìn)一步地，所述毛細(xì)管為玻璃毛細(xì)管，內(nèi)徑20～40μm，長40～50mm。

15、合適孔徑且粗細(xì)均勻的玻璃毛細(xì)管才能用于精準(zhǔn)點(diǎn)出特定濃度梯度的微液滴，如果存在粗細(xì)不均勻或孔徑忽大忽小的現(xiàn)象，必將直接影響濃度梯度的控制。因此，為了保證玻璃毛細(xì)管的孔徑合適且粗細(xì)均勻，玻璃毛細(xì)管的制備過程非常重要。

16、可以理解的是，玻璃毛細(xì)管的長度不宜過長，過長會延長液滴在此逗留的時(shí)間，而且不利于控制滴入液滴的濃度，因?yàn)閺恼{(diào)整濃度開始，到所調(diào)整濃度的液滴滴來有一定的時(shí)間延遲；反之，如果玻璃毛細(xì)管的長度過短，玻璃毛細(xì)管儲存液滴的體積會過小，如果一次存儲的溶液體積少于同一濃度所需要液滴的總體積的話(同一濃度需要3～5個(gè)液滴)，會導(dǎo)致陣列中同一批次的液滴濃度差異較大，從而達(dá)不到生成濃度梯度的液滴陣列的目的，繼而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度。

17、進(jìn)一步地，所述玻璃毛細(xì)管由玻璃管經(jīng)拉針、斷針和疏水處理后制得，所述疏水處理包括使用辛基三氯硅烷和1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷進(jìn)行處理。

18、所述毛細(xì)管采用現(xiàn)有的玻璃毛細(xì)管經(jīng)過拉針、斷針和疏水處理后制得，用于點(diǎn)樣。

19、所述疏水處理是指對毛細(xì)管尖端的內(nèi)壁和外壁都進(jìn)行疏水處理。疏水處理可以使液滴經(jīng)過毛細(xì)管時(shí)不黏附在毛細(xì)管內(nèi)壁，繼而毛細(xì)管點(diǎn)出的液滴是立體的、圓潤的、表面張力強(qiáng)的，而且能保證每次從毛細(xì)管中出來的液滴體積是一致的，減少了不同液滴之間的差異，繼而減少了不同實(shí)驗(yàn)組之間的誤差。

20、在一些方式中，所述二甲苯與十八烷基三氯硅烷質(zhì)量比為99:1；所述1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷的密度為1.3g/ml。

21、進(jìn)一步地，所述吸液機(jī)構(gòu)包括滾珠絲杠推液器和活塞管，所述活塞管在滾珠絲杠推液器作用下吸取或推出液體溶液。

22、由于需要多次的吸液，為了能更精確控制活塞管吸入和推出液體的量，本發(fā)明采用滾珠絲杠推液器進(jìn)行樣品溶液的吸取和推出，盡可能減少器械摩擦帶來的損耗，提高微量液體的控制精度。

23、進(jìn)一步地，所述點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)還包括三軸點(diǎn)樣模塊和毛細(xì)管固定夾具；所述平面包括芯片的表面；所述毛細(xì)管通過毛細(xì)管固定夾具固定，所述三軸移動模塊能帶動毛細(xì)管在x軸和z軸的移動以及帶動芯片在y軸的移動。

24、樣品溶液和溶劑在活塞管內(nèi)融合過程時(shí)間較短，且液滴經(jīng)過毛細(xì)管的滴出的時(shí)間也非常短暫，需要點(diǎn)樣模塊在這個(gè)融合過程中進(jìn)行點(diǎn)樣，一邊融合一邊點(diǎn)樣，過程必須精準(zhǔn)且高效。本發(fā)明通過三軸移動模塊快速且精確地帶動點(diǎn)樣模塊和金屬芯片移動，保證每個(gè)液滴經(jīng)毛細(xì)管準(zhǔn)確滴在芯片表面正確的位置上，并且需準(zhǔn)確控制時(shí)間，保證特定位置滴上的是所需的特定濃度的微液滴。

25、進(jìn)一步地，所述芯片的表面涂覆涂層并經(jīng)疏水處理而帶有疏水性，所述疏水處理包括采用乙醇溶液處理。

26、在一些方式中，所述乙醇溶液為99％乙醇溶液。

27、芯片需先利用一步電沉積法制備出具有多微孔金屬表面，再用99％乙醇溶液進(jìn)行疏水處理，用乙醇處理也能更好地利用一步電沉積法制備出具有多微孔金屬表面的芯片，從而使十二烷基鏈被“拉”了出來，金屬芯片的表面轉(zhuǎn)變?yōu)槌杷砻妫稍黾游⒁旱蔚慕佑|角，使得液滴更加集中飽滿，使液滴在點(diǎn)樣后更易成型，并使單位接觸面積上方承載更多液體，即含有更多溶質(zhì)，有助于核酸適配體的固定。

28、在一些方式中，所述涂層為金涂層。

29、需要理解的是，當(dāng)所述濃度梯度微液滴陣列應(yīng)用于核酸與蛋白質(zhì)的互作研究時(shí)，使用金制作而成的芯片能大大降低固定核酸適配體的難度和縮短固定時(shí)間，因?yàn)榭梢酝ㄟ^自組裝法固定核酸，即在合成dna/rna鏈時(shí)，在核酸鏈的一端直接用巰基基團(tuán)(-sh)修飾，利用巰基基團(tuán)和金(au)表面的共價(jià)結(jié)合作用形成的au-s鍵直接將dna/rna固定在金表面，所以能簡化固定流程，縮短固定時(shí)間，提高檢測效率。

30、另一方面，本發(fā)明提供了一種濃度梯度微液滴陣列的制備方法，所述方法采用如上所述的裝置進(jìn)行制備，包括以下步驟：

31、(1)通過吸液機(jī)構(gòu)吸取溶液，先吸取樣品溶液再吸取溶劑，或先吸取溶劑再吸取樣品溶液；

32、(2)通過點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)在芯片表面點(diǎn)出濃度梯度微液滴陣列。

33、在一些方式中，步驟(1)通過吸液機(jī)構(gòu)吸取溶液時(shí)，先吸取樣品溶液再吸取溶劑。

34、需要理解的是，如果先吸取樣品溶液后吸取溶劑的話，按活塞管工作時(shí)的放置方式，樣品溶液位于上層，溶劑位于下層，密度大的溶液會在重力作用下向下擴(kuò)散，加速兩種溶液的混合過程，使樣品和溶劑的混勻過程速度更均勻，更有利于生成準(zhǔn)確的濃度梯度微液滴陣列；反之，如果樣品溶液位于下層，而溶劑位于上層，樣品溶液在重力作用下，向上擴(kuò)散至溶劑的速度變緩，且活塞管內(nèi)部空間有限，導(dǎo)致兩種溶液融合過程受阻，會延長生成濃度梯度微陣列的時(shí)長，甚至可能導(dǎo)致局部濃度梯度不一致的情況，使?jié)舛忍荻任⒁旱蔚臐舛葴?zhǔn)確性受影響，因此更優(yōu)選采用先吸取樣品溶液再吸取溶劑的方式。

35、進(jìn)一步地，步驟(2)包括點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)在芯片表面進(jìn)行非連續(xù)性點(diǎn)樣，即完成第一輪點(diǎn)樣后，棄掉從毛細(xì)管中流出的第二輪液滴，采用第三輪液滴進(jìn)行點(diǎn)樣，以確保液滴陣列具有濃度梯度。

36、樣品溶液與溶劑混合需要一定的時(shí)間，為了保證芯片表面形成的液滴之間的濃度梯度準(zhǔn)確可控，芯片每次收集完一輪的3～5個(gè)液滴(約3～4秒)之后，需棄掉接下來一輪的3～6個(gè)液滴(約3～5秒)，然后收集第三輪液滴，從而保證第一輪和第三輪形成的液滴之間存在可控的濃度差，依次循環(huán)來形成穩(wěn)定的濃度梯度微陣列。

37、所述非連續(xù)性點(diǎn)樣的方式需要三軸移動模塊的配合，即在需要棄掉液滴時(shí)，y軸方向上的移動裝置就會帶動金屬芯片離開點(diǎn)樣模塊能夠點(diǎn)樣的范圍，且點(diǎn)樣模塊不移動，同時(shí)滾珠絲杠結(jié)構(gòu)的推液器按原來速率繼續(xù)出液工作，便會棄掉3～6個(gè)液滴。

38、再一方面，本發(fā)明提供了一種核酸適體溶液用于制備通過毛細(xì)管直接點(diǎn)出濃度梯度微液滴陣列的試劑的用途，所述核酸適體的堿基長度為40～180bp。

39、再一方面，本發(fā)明提供了一種毛細(xì)管用于制備直接在平面點(diǎn)出濃度梯度微液滴陣列的裝置的用途，所述毛細(xì)管為具有疏水性的玻璃毛細(xì)管，內(nèi)徑20～40μm，長40～50mm；所述玻璃毛細(xì)管由玻璃管經(jīng)拉針、斷針和疏水處理后制得，所述疏水處理包括使用辛基三氯硅烷和1h,1h,2h,2h-全氟辛基三氯硅烷進(jìn)行處理。

40、本發(fā)明將spri技術(shù)和微納流控技術(shù)相結(jié)合，利用微液滴陣列進(jìn)行點(diǎn)樣，即在清洗過的金芯片表面點(diǎn)樣出具濃度梯度的微液滴陣列，通過監(jiān)測生物分子結(jié)合在金屬表面上時(shí)引起的光信號變化來實(shí)時(shí)檢測生物分子的相互作用，其有益效果包括：

41、1.具有滾珠絲杠結(jié)構(gòu)的推液器搭配毛細(xì)管使用，就能夠點(diǎn)出4-10nl的微小液滴，該液滴體積遠(yuǎn)小于液槍點(diǎn)出的0.25μl；

42、2.利用三軸移動點(diǎn)樣裝置可以點(diǎn)出大面積的小體積液滴陣列，極大地增加了一次可檢測樣本的數(shù)量，為后續(xù)的spri檢測提供大量且有效的檢測數(shù)據(jù)；同時(shí)，自動化操作兼具精確性和便捷性，且不依賴昂貴的點(diǎn)膠設(shè)備；

43、3.玻璃毛細(xì)管的使用，大大簡化了傳統(tǒng)點(diǎn)膠機(jī)繁瑣的點(diǎn)樣操作，不需要像點(diǎn)膠機(jī)一樣進(jìn)行多次吸取與清洗出液口，只需吸取一次即可實(shí)現(xiàn)微滴中液體濃度梯度的設(shè)置，從而降低了點(diǎn)樣的難度，極大節(jié)省了點(diǎn)樣的時(shí)間，提高了親和力研究中所需濃度梯度點(diǎn)陣的布設(shè)和整體提高檢測的效率；

44、4.本發(fā)明提供的裝置的使用成本只是使用傳統(tǒng)點(diǎn)膠機(jī)的壓電陶瓷促動器的10％，但也能實(shí)現(xiàn)點(diǎn)出nl級別的液體，并且全流程低成本，自動化控制，數(shù)據(jù)也高度可靠；

45、5.經(jīng)過疏水處理過的毛細(xì)管先吸取樣本溶液，后吸取純凈水或緩沖液對樣本溶液進(jìn)行稀釋；再結(jié)合非連續(xù)的點(diǎn)樣方式，使樣品溶液和溶劑一邊融合一邊經(jīng)毛細(xì)管滴出微液滴，而且各個(gè)微液滴的濃度準(zhǔn)確可控，從而實(shí)現(xiàn)以最簡單的結(jié)構(gòu)，最便利的方法，直接生成濃度梯度微液滴陣列，可用于準(zhǔn)確檢測核酸適體與靶標(biāo)蛋白之間的親和力，也可用于其他分子互作研究。