本發(fā)明涉及一種維生素B12的適配體親和柱及其制備方法和用途。屬食品檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

維生素B12是唯一一類(lèi)含有主要礦物質(zhì)鈷的維生素，故又名鈷胺素，包括氰鈷胺、羥鈷胺、甲鈷胺、腺苷鈷胺。通常狹義上所指維生素B12是氰鈷胺，它是食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收時(shí)需要與鈣結(jié)合，大部分為小腸所吸收，人體只能利用甲鈷胺和腺苷鈷胺，因此氰鈷胺要在體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成這兩種形式才能被人體吸收利用。

嬰幼兒缺乏維生素B12表現(xiàn)為精神情緒異常、表情呆滯、反應(yīng)遲鈍等，最后導(dǎo)致貧血。嬰幼兒過(guò)量攝入維生素B12則易導(dǎo)致葉酸缺乏，有些會(huì)出現(xiàn)哮喘、濕疹、蕁麻疹、面部水腫等過(guò)敏性癥狀。因此我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰幼兒品配方乳粉中B12的添加量有嚴(yán)格的規(guī)定，其中GB 14880—2012 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中兒童調(diào)制乳粉中B12的添加量為10 ～ 30μg /kg，相關(guān)產(chǎn)品國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)添加限量也在此范圍。目前市售嬰幼兒乳粉是營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽中B12的含量大部分在1. 5 ～ 2. 5μg /100g 之間。

目前食品中維生素的測(cè)定方法較多,包括微生物法、比色法、示波法、原子吸收法、高效液相色譜法等。其中微生物分析法靈敏度高,但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)，大部分的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)不能較好地開(kāi)展。,原子吸收法受基質(zhì)鉆元素的影響可使結(jié)果不準(zhǔn)確。

高效液相色譜法( HPLC)具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)、可微量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),目前也被常用于食品中維生素的檢測(cè)。但因其對(duì)樣品中維生素純度的要求較高,導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng),無(wú)法滿(mǎn)足大批量樣品快速篩選的需要,所以使用受到限制。今年來(lái)發(fā)展起來(lái)的免疫親和柱-高效液相色譜（IAC-HPLC)）將免疫親和純化技術(shù)與高效液相色譜相結(jié)合。使HPLC的使用更加廣泛。免疫親和柱作為一種新的凈化技術(shù),在維生素的分析檢測(cè)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。它是將特異性抗體結(jié)合到活化的固相載體上填充而成。當(dāng)樣品提取液通過(guò)柱子時(shí),其中的抗原與抗體結(jié)合,其他雜質(zhì)則通過(guò)水溶液洗掉,再用有機(jī)溶劑將抗原即維生素洗脫下來(lái),從而使樣品中的維生素得以?xún)艋?。O.Heudi等使用免疫吸附柱純化，通過(guò)高效液相紫外成功地檢測(cè)出維生素B12。

免疫親和柱具有操作簡(jiǎn)單，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周?chē)h(huán)境的影響。保存不當(dāng)或者操作不當(dāng)很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。

適配體是一段核酸序列，通常為DNA或者RNA序列。 單鏈的核酸序列可以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而能與靶點(diǎn)特異性結(jié)合。通過(guò)多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點(diǎn)有高親和力的特異性適配體。Herman等描述了核酸適配體的結(jié)合特異性，[Science 287,820-825].核酸適配體相對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學(xué)合成，保證序列的準(zhǔn)確性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸適配體被應(yīng)用于小分子的檢測(cè)，在專(zhuān)利CN105505940A中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體DNA傳感器。通過(guò)黃曲霉毒素B1的適配體，及多條互補(bǔ)探針序列制備DNA傳感器，通過(guò)酶底物反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。在專(zhuān)利CN105400790A中，描述了一種黃曲霉毒素的檢測(cè)方法。利用黃曲霉毒素B1的適配體與蔗糖酶結(jié)合，通過(guò)酶與糖底物的相互作用，依靠血糖儀實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。上述都是利用黃曲霉毒素適配體實(shí)現(xiàn)毒素的檢測(cè)。

在毒素分離中，專(zhuān)利CN 104651369A中描述了一種黃曲霉毒素磁性分離方法，將黃曲霉毒素B1核酸適配體序列與磁珠結(jié)合，實(shí)現(xiàn)分離。在專(zhuān)利CN104399283中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體親和柱。該專(zhuān)利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素B1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種維生素B12適配體親和柱及其制備方法和用途

在本發(fā)明中，我們利用SELEX系統(tǒng)，從適配體文庫(kù)中篩選出來(lái)一條高特異性、高親和力的的新的維生素B12的RNA適配體。適配體修飾后與N-羥基琥珀酰亞胺活化的載體通過(guò)共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián)。經(jīng)過(guò)洗滌和封閉得到維生素B12的特異性載體。載體裝柱后就形成了高親和力的維生素B12適配體親和柱

該親和柱操作簡(jiǎn)便，純化維生素B12效率高。能耐受有機(jī)溶劑，并且可以重復(fù)使用。樣本經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的維生素B12。用于高效液相色譜檢測(cè)和熒光儀檢測(cè)。

具體操作如下：

本發(fā)明最大的優(yōu)勢(shì)就是利用了核酸適配體的特性，通過(guò)多輪的富集、洗滌、擴(kuò)增等步驟，篩選出針對(duì)維生素B12的特異性適配體。通過(guò)序列測(cè)定得到適配體的序列

核酸適配體相對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)，具有適應(yīng)環(huán)境廣泛，能夠耐受高溫、能耐受有機(jī)溶劑并且操作方便等優(yōu)點(diǎn)。最主要的，適配體在制備過(guò)程中不需要經(jīng)過(guò)動(dòng)物體內(nèi)的過(guò)程，而是通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得。因此，生產(chǎn)周期短，并且可以通過(guò)合成條件保證序列的準(zhǔn)確性

以核酸適配體為基礎(chǔ)制備的親和柱具有特異性好，維生素B12結(jié)合量大，純化效率高的特點(diǎn)。

維生素B12適配體親和柱及其制備方法說(shuō)明如下

1.選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進(jìn)行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的維生素B12適配體，室溫偶聯(lián)8小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應(yīng)2小時(shí)

5.將封閉好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將維生素B12—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的維生素B12親和柱。層析柱的結(jié)構(gòu)如附圖1所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明充分的利用了核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)多輪的篩選和富集。得到了高特異性高親和力的維生素B12核酸適配體。該適配體能夠特異性的結(jié)合樣本中的維生素B12，降低了抗體親和柱經(jīng)常遇到的交叉反應(yīng)性。親和柱效率大幅度提高

核酸適配體不受操作環(huán)境和有機(jī)溶劑的影響，尤其適合脂溶性維生素類(lèi)的脂溶性物質(zhì)的純化。相比較，由于免疫親和柱中的抗體不耐有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑常常會(huì)造成抗體的失活而使親和柱效率降低

此外，由于有機(jī)溶劑導(dǎo)致抗體失活，因此免疫親和柱通常為一次性使用。而核酸適配體親和柱可以耐受有機(jī)溶劑，可以重復(fù)使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本發(fā)明使用的核酸適配體可以通過(guò)化學(xué)合成法獲得，可以保證序列的正確性。大幅度降低了不同批次間的變異。而相對(duì)來(lái)說(shuō)，不同批次的抗體來(lái)自于不同的小鼠或者兔子，導(dǎo)致抗體間質(zhì)量變異較大，使親和柱質(zhì)量存在差別

3.使用本發(fā)明純化維生素B12操作簡(jiǎn)便，一步純化就可以得到純度較高的維生素B12。更方便操作者使用

4.使用本發(fā)明的產(chǎn)品得到的維生素B12純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測(cè)或者熒光檢測(cè)。節(jié)省了操作者的時(shí)間和費(fèi)用。

附圖說(shuō)明

圖1：維生素B12適配體親和柱結(jié)構(gòu)組份示意圖

A：進(jìn)樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料； G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖2：維生素B12適配體親和柱外觀結(jié)構(gòu)圖

A：進(jìn)樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料； G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖3：原奶樣品中加入維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測(cè)圖

圖4：奶粉樣品中加入維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測(cè)圖

圖5：功能性飲料中加入維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：利用氨基修飾的維生素B12適配體制備親和柱

本發(fā)明制備維生素B12適配體親和柱的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.載體活化

選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進(jìn)行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的維生素B12適配體，室溫偶聯(lián)8小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應(yīng)2小時(shí)

5.將封閉好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將交聯(lián)后的維生素B12-瓊脂糖凝膠用10毫升20mM PBS PH7.4重懸，然后裝入空的親和純化柱柱體中

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的維生素B12適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方

4)加入活塞適配器，適配器有一個(gè)壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的維生素B12適配體親和柱放入4℃保存。

實(shí)施例2：利用生物素修飾的維生素B12適配體制備親和柱

本發(fā)明制備維生素B12適配體親和柱的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.取1ml鏈霉親和素（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用10ml超純水洗滌3次

2.將（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.02M的PBS，0.8M NaCl，PH7.4）洗滌3次。加入20mol/L的生物素修飾的維生素B12適配體，室溫偶聯(lián)4小時(shí)

3.將偶聯(lián)好的維生素B12適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.裝柱

將維生素B12—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的維生素B12親和純化柱

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的維生素B12適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方

4)加入活塞適配器，適配器一個(gè)壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的維生素B12適配體親和柱放入4℃保存。

實(shí)施例3：利用維生素B12適配體親和柱純化原奶中的維生素B12

本實(shí)施例利用正常的原奶樣本定量加入維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用維生素B12適配體親和柱進(jìn)行純化，純化后用高效液相色譜檢測(cè)。測(cè)定回收率

1.原奶樣品處理

按照每10ml樣品30ng的標(biāo)準(zhǔn)，在原奶樣本中添加維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品；

----將免疫親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下

----準(zhǔn)確移取10ml原奶樣本注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出

----待液體排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗滌10mL，再用蒸餾水或去離子水洗滌10mL，流速2～3滴/秒

----待液體排干后，更換新針筒，上樣2ml乙腈，用刻度試管接洗脫液，流速1滴/秒

----洗脫后液體用氮?dú)庠?30℃條件下吹至近干

----用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml

---洗脫液用0.22μm微孔濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

2.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測(cè)

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，在10ml原奶樣品中加入30ng的維生素B12，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到29.34ng?；厥章蕿?7.8%。色譜圖見(jiàn)附圖3。

實(shí)施例4：利用維生素B12適配體親和柱純化和檢測(cè)奶粉樣品中的維生素B12

1.前處理

按照每1g奶粉樣品30ng的標(biāo)準(zhǔn)，奶粉樣品中添加維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品；

1g奶粉加入10ml 10mmol/L磷酸緩沖液PBS PH7.4，劇烈振蕩20min，用快速定性濾紙過(guò)濾，收集濾液；

取所有濾液過(guò)免疫親和柱凈化

2.凈化

1)將親和柱連接于10.0ml一次性注射器下。按照前處理要求，準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的樣品提取液注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與注射器連接調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出；

2)待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10mL；

3)待液體排干后，上樣1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脫液并定容至1mL；

4)洗脫液用0.22μm微孔濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于高效液相色譜HPLC分析；

5)高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，在1g奶粉樣品中加入30ng的維生素B12，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到28.95ng?；厥章蕿?6.5%。色譜圖見(jiàn)附圖4。

實(shí)施例5：利用維生素B12適配體親和柱純化和檢測(cè)功能飲料中的維生素B12

本實(shí)施例利用功能性樣本定量加入維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用維生素B12適配體親和柱進(jìn)行純化，純化后用高效液相色譜檢測(cè)。測(cè)定回收率

1.原奶樣品處理

按照每10ml樣品30ng的標(biāo)準(zhǔn)，在功能性飲料樣本中添加維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品；

----將免疫親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下；

----準(zhǔn)確移取10ml原奶樣本注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出；

----待液體排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗滌10mL，再用蒸餾水或去離子水洗滌10mL，流速2～3滴/秒；

----待液體排干后，更換新針筒，上樣2ml乙腈，用刻度試管接洗脫液，流速1滴/秒；

----洗脫后液體用氮?dú)庠?30℃條件下吹至近干；

----用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml；

---洗脫液用0.22μm微孔濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

2. 洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測(cè)

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，在10ml功能性飲料樣品中加入30ng的維生素B12，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到28.62ng?；厥章蕿?5.4%。色譜圖見(jiàn)附圖5。

實(shí)施例6維生素B12適配體親和柱重復(fù)使用柱容量的變化

本實(shí)施例利用定量的維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用維生素B12適配體親和柱進(jìn)行純化。親和柱上的維生素B12用有機(jī)溶劑洗脫后，用高效液相色譜檢測(cè)其濃度。親和柱重新平衡后重復(fù)上樣和洗脫，測(cè)定洗脫的維生素B12濃度。主要目的是測(cè)試維生素B12適配體親和柱的重復(fù)使用性

1.配制5ug/ml的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品

2.取出維生素B12適配體親和柱，打開(kāi)進(jìn)樣口塞，進(jìn)樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上

3.打開(kāi)出樣口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升，調(diào)節(jié)氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，總量500ng ，加入親和柱柱中，調(diào)節(jié)流量至1-2滴/秒。直至樣品全部流出親和柱

5.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物

7.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測(cè)

8.親和柱用超純水洗滌3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升

9.再次上樣100ul維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，總量500ng

10. 按照上述操作洗滌及洗脫，洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜檢測(cè)其濃度

11. 再重復(fù)步驟8.9.10三次。檢測(cè)洗脫產(chǎn)物的濃度

12. 計(jì)算總共5次的維生素B12適配體親和柱純化的回收率

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4：

從上述結(jié)果可以看出，維生素B12適配體親和柱重復(fù)使用5次后，其結(jié)合能力沒(méi)有明顯的降低。

維生素B12適配體序列

5’-GGAACCGGUGCGCAUAACCACCUCAGUGCGAGCAA-3’