本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)顯微鏡載玻片，且尤其但不排他地涉及用于在免疫測定(特別是免疫細胞化學(ICC))的領域中成像的細胞培養(yǎng)載玻片。

背景技術：

已知在顯微鏡載玻片上培育細胞培養(yǎng)物以用于免疫測定目的。大體上，使用者通過將玻璃蓋玻片放置到一次性碟片的底部中來在該玻璃上培育細胞。取決于細胞類型，玻璃蓋玻片可能被或可能沒有被涂覆表面處理物質(zhì)(例如，聚賴氨酸)以促進細胞粘附到玻璃表面上。所使用的蓋玻片尺寸通常范圍為12mm的圓形至25mm的正方形至25×75mm的方形。在預定時間，使用者用一對鑷子從一次性碟片移除蓋玻片，而希望不破壞該易損的玻璃。蓋玻片放置到固定劑中，通常為磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的甲醛，但也可為甲醇。這通過將蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起而將攜帶的蛋白質(zhì)化學地固定就位。蓋玻片從固定劑移除且在PBS中沖洗。然后，使用者開始以下過程：向蓋玻片加入第一抗體，沖洗，加入第二抗體，沖洗，加入DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚細胞核染料)，沖洗，然后加入少量市售的安裝介質(zhì)，以及用密封劑(通常是指甲油)或通過使用硬化安裝介質(zhì)將蓋玻片固定到另一玻璃載玻片上。允許該密封劑或安裝介質(zhì)硬化，并且該載玻片組件準備好為夾在兩片玻璃之間的染色標記的蛋白質(zhì)成像。在小心的情況下，可用不同蓋玻片重復以上步驟，從而將兩個或更多的蓋玻片安裝到單個玻璃載玻片上。

使用者選擇放大倍數(shù)以用于檢查組裝的載玻片。如果物鏡需要液體浸沒介質(zhì)，則浸沒介質(zhì)必須在用物鏡檢查之前加入。一些使用者可使用低放大倍數(shù)的空氣浸沒透鏡來粗略地確定焦平面且識別感興趣的區(qū)域，以在較高放大倍數(shù)下進行成像。然后移除組裝的載玻片，更換物鏡，將適當?shù)慕]液體加入到載玻片或物鏡上，將載玻片放回顯微鏡上，并將顯微鏡重新聚焦到樣本上。

這種方法問題重重。事實上，顯微鏡的最困難的部分是樣本準備，且很少有使用者完全理解樣本在光學結果中所起的作用。以下是新接觸免疫熒光的使用者面臨的一些問題。

1.操作玻璃蓋玻片：

由于玻璃蓋玻片易損且易碎，其很容易被誤操作。這在操作期間可能造成玻璃翻轉(zhuǎn)。由于細胞僅在玻璃的一側上，且肉眼看不到細胞，這導致準備玻璃的錯誤側而浪費昂貴或稀有的材料。此外，玻璃覆蓋有細胞，在需要鑷子來操作玻璃時容易損壞細胞。常見的問題在于，在諸多準備步驟中的一者期間破壞玻璃，導致奇怪形狀的樣本、浪費的樣本和材料以及樣本污染。另外，過度操作玻璃可造成樣本的錯誤識別，這可能需要重復實驗或?qū)е赂愕牟徽_的結果。

2.安裝玻璃蓋玻片：

由于玻璃蓋玻片在載玻片上的放置、尺寸和分布大致隨機，不存在在不掃描整個載玻片的情況下自動掃描載玻片以找到安裝的蓋玻片的選擇。此外，由于玻璃蓋玻片的兩側上都可存在密封劑，且密封劑取決于多種因素可為變化的厚度，因此由于存在高度差異，從一個安裝的玻璃蓋玻片自動移動到另一個的選擇被限制。在載玻片上通常安裝有多于一個玻璃蓋玻片。由于加入安裝介質(zhì)和安裝蓋玻片是手動完成的，這些蓋玻片通常在不同的焦平面中，其然后需要使用者在每個玻璃蓋玻片區(qū)域上重新聚焦。由于顯微鏡的最大問題是找到焦平面，這導致挫敗感以及破壞的載玻片。

3.材料選擇：

ICC中最常見的問題之一是材料的選擇。高數(shù)值孔徑的透鏡專為單一玻璃厚度而設計。存在無數(shù)的安裝介質(zhì)供選擇，且許多可用的選擇造成較差成像。樣本(例如，細胞)和檢測器(例如，照相機)之間的一切會影響可從樣本獲得的對比度和分辨率。錯誤的玻璃厚度導致球面像差和軸向色差。錯誤的安裝介質(zhì)導致若干像差、高背景和較差的對比度。

4.顯微鏡、場景選擇和樣本偏差：

使用顯微鏡最難的部分之一是找到焦平面。這對于稀疏樣本特別困難，但甚至對于密集樣本也可能有問題。甚至顯微鏡“專家”偶爾也會將載玻片安裝得上下顛倒，且花費很長時間試圖找到焦平面，而后才意識到這個問題。幾乎所有使用者都遇到的非常隱匿的問題是選擇偏見。顯微鏡工作者通?；趯毎囊曈X檢查來選擇要成像的細胞。這導致使用者基于“好細胞”的定義的偏見。這種偏見是潛意識的且難以避免。此外，因為“好細胞”是主觀的，這使其他人難以重復實驗。即使將收集的圖像發(fā)送到明確的圖像分析，也存在選擇偏見?？茖W家需要場景或細胞選擇是無偏見的，但這是極少的情況。這導致可疑的結果，進而產(chǎn)生其他人不可復制的可疑的論文。

US7919319公開了在兩個透明板之間培養(yǎng)細胞，透明板間隔開與待培養(yǎng)的細胞尺寸相當?shù)木嚯x，從而提供單層細胞，其可隨時間的推移通過顯微鏡觀察。這種技術為細胞培養(yǎng)提供了扭曲的環(huán)境，因為大多數(shù)細胞在團塊中而非在扁平陣列中生長得最好，且細胞廢物不太可能被沖走。描述的技術在ICC中很少使用，因為意在不干擾細胞，且因此上面提到的清洗和染色步驟是有問題的。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明人設計了一種解決上述問題的顯微鏡載玻片。本發(fā)明提供了一種根據(jù)權利要求1的顯微鏡載玻片，其具有從屬于權利要求1的權利要求限定了優(yōu)選特征。本發(fā)明還提供了一種由權利要求6和從屬于其的權利要求所限定的方法。

本發(fā)明延伸至本文所公開的特征的任何組合，無論這樣的組合是否在本文中明確提及。此外，在組合提及兩個或更多的特征的地方，其意在這些特征可單獨地要求保護而不擴展本發(fā)明的范圍。

附圖說明

本發(fā)明可以多種方式付諸實施，下文參照附圖描述其一個說明性實施例，在附圖中：

圖1示出了顯微鏡載玻片的平面視圖；

圖2示出了使用中的載玻片沿圖1中的線II-II的剖面圖。

具體實施方式

本發(fā)明及其目標和優(yōu)點參照結合附圖的以下描述可更好地理解，其中相似的參考標號在附圖中表示相似元件。

參照圖1和圖2，示出了顯微鏡載玻片10，其包括光學透明的基本平坦的基板20(在此例中為硼硅酸鹽玻璃)，基板具有相反的上表面27和下表面28，以及外部塑料模制的周邊框架40。框架的外部尺寸符合ANSI/SBS 1-2004和2-2004標準?；寰哂?.165mm至0.175mm，優(yōu)選為0.17mm的基本均勻的厚度。基板包含細胞培養(yǎng)區(qū)域22，細胞在其中生長，且根據(jù)已有技術執(zhí)行染色。在此實施例中，示出了兩個直徑為13mm的圓形區(qū)域，但是僅一個區(qū)域可利用，或者更多的區(qū)域可使用，例如多達30000個微區(qū)域可使用。這些區(qū)域彼此分開，疏水材料24應用到基板上除區(qū)域22之外的所有區(qū)域中。對于微區(qū)域，疏水材料可通過點陣打印機或類似的技術而應用。疏水材料24用于將井彼此隔離，因為水基液體將避開疏水區(qū)域24且細胞將不跨過疏水區(qū)域。培養(yǎng)區(qū)域22可選地涂覆有α-聚賴氨酸或允許細胞粘附到玻璃上的其它市售材料。同樣位于基板上的是與別個不同的標識器26。在此例中，標識器是條形碼，其可通過光學裝置讀取，包括通過載玻片10安裝到其上的顯微鏡。在此實施例中，基板還包括位于框架的一個角落處的對準標記48，且由三個凸起的波紋形成。標記允許載玻片10相對于顯微鏡的正確定向，且在需要的情況下可通過顯微鏡讀取。

外部框架40使基板20保持就位，且具有連續(xù)平坦的上表面42和下表面44。這里，“連續(xù)平坦的表面”意思是圍繞基板在一個平面上限定不間斷回路的表面。表面42和44彼此基本平行。下表面44包括凹窗46，玻璃基板20緊密地配合到其中，使得基板的下表面28定位成與框架的下表面44齊平?？蚣艿纳媳砻?2高于基板20的上表面27，從而提供了井32，在初始使用時細胞培養(yǎng)基包含在井32中。

在使用中，包含細胞的介質(zhì)放置到一個或兩個區(qū)域22中，蓋子(未示出)放置在載玻片10上方，且載玻片置到培養(yǎng)箱(未示出)中。數(shù)小時之后，細胞將在該區(qū)域中沉積到基板20上，擴散且附著到基板表面上。對于長期培養(yǎng)，包含細胞的介質(zhì)可在約8小時之后移除，且井32可用另外的介質(zhì)灌注。細胞將避開疏水材料24，且因此即使當井32被灌注時，井之間也不會發(fā)生細胞的混合。此技術大大簡化了細胞的生長、固定、清洗和整個ICC方案。

當使用者準備好進行ICC時，從區(qū)域22或從井32移除介質(zhì)，且向每個區(qū)域22加入大約100μl(對于13mm區(qū)域)的市售的固定劑。根據(jù)已知技術進行進一步常規(guī)的ICC清洗、培育、清洗、培育、清洗步驟，但不需要像常規(guī)技術那樣操作易損的蓋玻片。根據(jù)已知技術使用標記的抗體對感興趣的蛋白質(zhì)進行染色。在完成ICC步驟時，大約5μl的常規(guī)安裝介質(zhì)加入到每個區(qū)域22，且密封的載玻片50放置到框架的上表面42上。這保護區(qū)域免于脫水和接觸損壞。

載玻片10連同密封的載玻片50(組裝的載玻片)一起放置到顯微鏡系統(tǒng)上。在實施的地方，讀取對準標記以將顯微鏡臺和組裝的載玻片對準，且條形碼標識器26通過系統(tǒng)讀取以確定載玻片的標識，且從而確定其內(nèi)容。通過將條形碼交叉參照到已知載玻片的列表，可容易地確定區(qū)域22的位置。另外，條形碼將包括與別個不同地限定特定載玻片的標識器。以此方式，關于正被成像的特定樣本沒有歧義，且不需要在載玻片本身上手寫標識。浸沒油52應用到載玻片上且使用高數(shù)值孔徑4X物鏡54掃描載玻片，以在需要時用于隨后的更高分辨率成像。

載玻片10及其上述使用顯著增加了包含載玻片的樣本的準備和使用的便利性，尤其是對于ICC實驗期間的免疫熒光，在那里需要許多載玻片準備步驟。如果需要，外塑料框架40的使用允許自動操作載玻片10，且該框架構造成有助于顯微鏡掃描過程的自動化。例如，載玻片10具有完全平坦的下表面28/44，其允許物鏡(例如，透鏡54)掃描該表面而無需承擔碰到任何突起的風險。使用與別個不同的標識器減少操作錯誤的概率，且提供一致的自動成像位置。

雖然已經(jīng)描述和示出了僅一個實例，但對于本領域技術人員來說將顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明所要求保護的范圍的情況下，可對那些實施例進行添加、省略和修改。例如，優(yōu)選的基板20是玻璃，但也可使用其它透明的材料，例如塑料?？蚣?0優(yōu)選由塑料形成，但這包括熱塑性塑料和熱固性塑料。考慮到纖維加固。井32的優(yōu)選深度為約2mm至6mm，且更優(yōu)選為3mm至5mm，因為這個尺寸接受大致合適體積的細胞培養(yǎng)基，但可使用更淺或更深的井以適應不同的需要。

描述了條形碼26，但可使用其它識別裝置，例如RFID裝置可用于自動將識別數(shù)據(jù)和其它數(shù)據(jù)寫入載玻片，以便記錄其準備進度和隨后進行的任何成像的結果。

與圖2相比，載玻片10可倒置，使得在成像期間從上觀察。在這種情況下，術語上部、下部等應當相應地理解，且不意在關于圖2所示的載玻片10的定向而為限制性的。