專利名稱：在變性條件下蛋白純化的方法
在變性條件下蛋白純化的方法本發(fā)明涉及蛋白純化的方法以及為此合適的試劑盒和緩沖液體系。為了在變性條件下通過固定化金屬親和色譜(以下IMAC)純化蛋白，通?；蛘呤?用含鹽酸胍的緩沖液(參見Hochuli等人，1988)，或者使用高度濃縮的含尿素的緩沖液。相 對于含鹽酸胍的緩沖液，含尿素的緩沖液提供以下優(yōu)點用含尿素的緩沖液純化的蛋白可 以直接在SDS凝膠上分析。蛋白與基質的最佳結合、洗滌步驟的嚴格性以及感興趣蛋白的 有效洗脫決定性地取決于單個緩沖液的PH值。然而，本領域已知的含尿素的緩沖液隨時間失去其緩沖作用，特別是因為其pH值 升高。由此降低洗滌步驟的嚴格性以及由此的蛋白純化的選擇性。由于較高的PH值，蛋白 非特異性地結合到基質上，并且不再能有效地洗出。洗脫效率也下降。為了在變性條件下 通過IMAC純化His標記的重組蛋白，由此在每次應用前必須新鮮配制所使用的含尿素的緩 沖液或必須校正其PH值，S卩，重新調節(jié)。這是費時的且相應地是不利的。由此出發(fā)本發(fā)明的目的在于，提供蛋白純化的改進方法。通過在權利要求1-16中所述的方法、試劑盒和緩沖液體系獲得上述問題的解決方案。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，提供用于在變性條件下通過IMAC純化蛋白的 應用緩沖液的方法，該方法的特征在于，將具有預定PH值的預定量的緩沖液濃縮物與預定 量的變性濃縮物，優(yōu)選尿素濃縮物混合，由此提供具有預定PH值的應用緩沖液。在本發(fā)明的上下文中，使用術語“緩沖液濃縮物”和“應用緩沖液”。術語“緩沖液 濃縮物”是指不直接用于純化而是先與尿素混合的緩沖液，以獲得實際的應用緩沖液。緩沖 液濃縮物優(yōu)選不具有尿素。首先，尿素不以干擾的量存在。術語“應用緩沖液”用于已與尿 素混合并可以直接用于蛋白純化的緩沖液，例如作為結合緩沖液、洗滌緩沖液或洗脫緩沖 液。本發(fā)明的核心是分開提供用于蛋白純化所必需的、彼此相互反應并由此導致pH 值升高的組分。根據(jù)本發(fā)明，提供至少一種與尿素濃縮物分開的、具有預定的且相應預調 PH值的緩沖液濃縮物。預定量的尿素濃縮物只在應用前才與預定量的緩沖液濃縮物混合， 由此獲得具有預定組成和預定且相應的所期望PH值的應用緩沖液。分開提供濃縮物的優(yōu) 點在于，單個組分(緩沖液濃縮物和尿素濃縮物)是貯存穩(wěn)定的并且分開貯存的濃縮物的 PH值在長時間保持恒定(圖3中也可見)。通過僅混合2種組分，即緩沖液濃縮物和尿素 濃縮物，在濃縮物長時間貯存后能夠自行產生具有預定組成和預定PH值的應用緩沖液(見 圖4)。在本發(fā)明方法中，與現(xiàn)有技術不同之處在于，在蛋白純化之前或期間，重新調節(jié)pH值 由此是不必要的。也不必完全新配制應用緩沖液。在混合濃縮物之后可直接使用應用緩沖 液。對于用戶而言，相應于“即刻可用”反應劑的使用特別是以試劑盒的形式是易于操作和 時間節(jié)省的。因為根據(jù)本發(fā)明總是產生相同組成且具有預定(相同)PH值的應用緩沖液， 因此純化結果是可重復的且保持相同的質量。避免了應用緩沖液的受PH值限制的波動以 及與此相關的錯誤根源。根據(jù)本發(fā)明的方法不僅在手動方式上是用戶友好的，此外而且是 可自動化的，因為僅需彼此相互混合組分，而無需精確調整或需要新配制應用緩沖液。用現(xiàn)有技術中已知的緩沖液體系和方法進行自動化是不太可能的。此外，由于缺乏PH穩(wěn)定性， 能貯存的、封閉的試劑盒理念(在該理念下用戶不用改變緩沖液)也是不可能的，因為用戶 必須改變所提供的緩沖液(例如調節(jié)PH值)。根據(jù)本發(fā)明的方法，借助Ni2+-NTA(鎳-次氮基三乙酸)_色譜特別有用于組氨酸 標記的蛋白純化。根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式
，提供三種緩沖液濃縮物，其各自具有不同的、已 預調的PH值。緩沖液濃縮物的組成可以相同或不同。通過將該濃縮物與預定量的尿素混 合獲得至少三種各自具有不同PH值的應用緩沖液。該方法的三個基本步驟，結合到基質、 洗滌基質和隨后由基質洗脫感興趣的蛋白分別需要具有特別合適的，即經調節(jié)的PH值的 緩沖液(見上文)。通過提供具有不同PH值的至少三種緩沖液濃縮物，通過與預定量的尿 素濃縮物混合制備至少三種應用緩沖液，該應用緩沖液不僅具有預定的組成，而且具有預 定的和針對各步驟合適的或必需的PH值。該應用緩沖液可直接使用，即無需由用戶進一步 改變，或者可在自動方法中使用。根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式
，用于制備用于結合的應用緩沖液的緩沖液濃縮 物具有堿性PH值，優(yōu)選在約7. 0-9. 0的PH值范圍內，特別優(yōu)選約7. 5的PH值。通過將該 緩沖液濃縮物與預定量的尿素濃縮物混合產生具有相同或更高PH值的應用緩沖液。根據(jù) 本發(fā)明的具體實施方式
，用于結合的應用緩沖液具有堿性PH值，優(yōu)選7. 0-9. 0的pH值，特 別優(yōu)選約8的pH值。結合緩沖液也可以作為溶解緩沖液使用且反之亦然。根據(jù)該具體實施方式
，用于制備洗滌基質的應用緩沖液的緩沖液濃縮物具有的弱 酸性PH值，優(yōu)選5. 0-7. 0的pH值，特別優(yōu)選約5. 6的pH值。通過將這些緩沖液濃縮物與 預定量的尿素濃縮物混合，產生具有較高PH值的應用緩沖液。根據(jù)具體實施方式
，用于洗 滌基質和溶解非特異性結合的蛋白的應用緩沖液具有弱酸性至中性的PH值，優(yōu)選5. 5-7. 0 的PH值，特別優(yōu)選6-6. 5的pH值。根據(jù)具體實施方式
，用于制備洗脫蛋白的應用緩沖液的緩沖液濃縮物具有酸性pH 值，優(yōu)選小于4的pH值，特別優(yōu)選小于3. 5的pH值。通過將這些緩沖液濃縮物與預定量的 尿素濃縮物混合，產生具有較高PH值的應用緩沖液。根據(jù)具體實施方式
，用于從基質中洗 脫待純化的蛋白的應用緩沖液具有酸性PH值，優(yōu)選小于5. 5的pH值，特別優(yōu)選小于5或在 約4.5的pH值。該緩沖液濃縮物的pH值在長時間保持穩(wěn)定，如由圖3中可見的那樣。相對于現(xiàn)有 技術中已知的緩沖液，該PH穩(wěn)定性的重要原因是在緩沖液濃縮物中不存在干擾量的尿素。 通過將確定量的緩沖液濃縮物與尿素濃縮物有針對性地混合，應用緩沖液實現(xiàn)預先可確定 的或預定的組成和預先可確定的或預定的PH值。通過該pH穩(wěn)定性和組成恒定，蛋白純化 方法的結果是可重復的且在質量上是類似的。因為用戶不必自己配制緩沖液，避免了在組 成上的波動。由濃縮物產生的應用緩沖液的PH值在濃縮物長時間貯存下保持恒定，如由圖 4中可見的那樣。該緩沖液濃縮物優(yōu)選含有生物緩沖液。生物緩沖液以多種形式被使用于生物學和 分子生物學領域。與經典的、無機緩沖的物質不同之處在于，它們不會不利地影響待檢測的 體系。生物緩沖液通常含有兼性離子。對生物緩沖液的綜述例如在SigmaAldrich的主頁 (www. siRmaaldrich. com)上可以找到。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，用于制備所述結合應用緩沖液的緩沖液濃縮物含有 在堿性中(優(yōu)選在約7. 0-9.0的范圍內)具有緩沖能力的緩沖液。HEPES(2-(2-羥乙 基)-1-哌嗪基)_乙磺酸)、MES (2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、磷酸鈉緩沖液、檸檬酸緩沖液、 琥珀酸緩沖液或醋酸緩沖液在此作為可能的、根據(jù)本發(fā)明可使用的緩沖液被提及。優(yōu)選使 用含胺的緩沖液。生物的、含胺緩沖液的優(yōu)選實例是Tris緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，用于制備所述洗滌應用緩沖液和洗脫應用緩沖液的 緩沖液濃縮物含有在中性至酸性中(優(yōu)選在約4. 0-7. 5的范圍內)具有緩沖能力的緩沖 液。檸檬酸緩沖液、琥珀酸緩沖液或醋酸緩沖液在此是根據(jù)本發(fā)明合適的緩沖液。對于生 物緩沖液特別合適的實例是Bis-Tris。用于制備所述洗滌緩沖液和洗脫緩沖液的緩沖液濃縮物可以具有相同的組分，然 而其中它們具有不同的PH值。所述洗滌濃縮物的pH值高于所述洗脫濃縮物的pH值。根據(jù)具體實施方式
，緩沖液濃縮物此外含有鹽，例如NaCl、KCl或KH2PO4,優(yōu)選 NaH2PO4 和 / 或非離子型表面活性劑，例如 TritonXlOO、Triton Xl 14、NP-40、CHAPS、DDM、 b-OG、NG、Brij35或洋地黃皂苷，或優(yōu)選吐溫。根據(jù)具體實施方式
，緩沖液濃縮物額外地具 有防腐劑，優(yōu)選Ni^3。根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式
，用于制備應用緩沖液所使用的緩沖液濃縮物含 有25-500mM，優(yōu)選50-300mM，特別優(yōu)選100-250mM的三(羥甲基)_氨基甲烷(特別是用于 制備結合緩沖液)或雙三(雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷(特別是用于制備洗滌 或洗脫緩沖液)，以及額外的125-750mM，優(yōu)選250_500mM，特別優(yōu)選300_450mM的NaH2P04 和 / 或 0. 025-0. 5% (ν/ν)，優(yōu)選 0. 05-0. 3% (ν/ν)，特別優(yōu)選 0. 1-0. 25% (ν/ν)非離子型 表面活性劑和/或0. 0025-0. 05%，優(yōu)選0. 005-0. 03%，特別優(yōu)選0. 01-0. 025%的NaN3。優(yōu) 選以三(羥甲基)_氨基甲烷氯化物或雙三(雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷氯 化物的形式使用三(羥甲基)_氨基甲烷或雙三(雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲 焼。根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式
，用于制備應用緩沖液的分開提供的尿素濃縮物 是具有8-10M尿素的水溶液；根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式
，尿素濃縮物是具有9. 3-9. 8M尿素 的水溶液，優(yōu)選9. 6M的尿素。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，將1份緩沖液濃縮物與3. 7份尿素濃縮物混合，以獲 得根據(jù)本發(fā)明的應用緩沖液。根據(jù)具體實施方式
，將這種混合比例用于制備所有應用緩沖 液。本發(fā)明還涉及尿素濃縮物用于制備具有預定pH值的應用緩沖液用途，其中將預 定量的尿素濃縮物與預定量的緩沖液濃縮物混合。通過分開提供尿素濃縮物和其與緩沖液 濃縮物的混合物，在應用前即刻獲得不僅具有預定的組分，而且具有確定的、之前預定的PH 值的應用緩沖液。這有助于在蛋白純化中改善和尤其可標準化的條件。所述優(yōu)點、尿素和 緩沖液濃縮物的組成的細節(jié)已在上文中詳細闡明。參照上文公開內容，其也適用于與用途 相關的方面。此外，根據(jù)特別的具體實施方式
，提供在變性條件下通過IMAC純化蛋白的試劑 盒，其具有尿素濃縮物和至少一種具有預定PH值的緩沖液濃縮物用于制備至少一種具有 預定PH值的應用緩沖液。
根據(jù)具體實施方式
，該試劑盒具有至少三種分別具有不同的、預定的PH值的緩沖 液濃縮物，其通過分別與預定量的尿素濃縮物混合產生至少三種不同的具有預定組成和預 定PH值的應用緩沖液。由于分開提供濃縮物，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒是穩(wěn)定的且由此以有利地方式可以貯 存。通過少量且能直接使用的組分明顯構成試劑盒，并且對于用戶是安全的且能快速使用 的。不需要通過用戶調節(jié)緩沖液條件，由此產生可重復的且在質量恒定的結果。該試劑盒也 可由很少受過訓練的人員使用，因為其降低了出錯性。由此其尤其適于高探針處理量。此 外該試劑盒可以與自動化方法結合使用。該試劑盒也可形成在變性條件下通過IMAC純化蛋白的緩沖液體系，其具有尿素 濃縮物和至少一種具有預定PH值的緩沖液濃縮物，該尿素濃縮物通過與緩沖液濃縮物混 合產生具有預定PH值的應用緩沖液。緩沖液濃縮物、尿素濃縮物以及由此產生的應用緩沖液的詳細情況在上文中已詳 細地描述。參照上文的實施方式，其也適于與試劑盒相關的方面且是相應公開內容的組成 部分。根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式
，用于制備應用緩沖液所使用的緩沖液濃縮物含 有25-500mM，優(yōu)選50-300mM，特別優(yōu)選100-250mM的三(羥甲基)_氨基甲烷(特別是用于 制備結合緩沖液)或雙三(雙O-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷(尤其是用于制備洗 滌或洗脫緩沖液)，以及額外的125-750mM，優(yōu)選250_500mM，特別優(yōu)選300_450mM的NaH2PO4 和 / 或 0. 025-0. 5% (ν/ν)，優(yōu)選 0. 05-0. 3% (ν/ν)，特別優(yōu)選 0. 1-0. 25% (ν/ν)非離子型 表面活性劑和/或0. 0025-0. 05%，優(yōu)選0. 005-0. 03%，特別優(yōu)選0. 01-0. 025%的NaN3。優(yōu) 選以三(羥甲基)_氨基甲烷氯化物或雙三(雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷氯 化物的形式使用三(羥甲基)_氨基甲烷或雙三(雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲 焼。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，尿素濃縮物是具有8-10M尿素的水溶液；根據(jù)本發(fā) 明優(yōu)選的具體實施方式
，尿素濃縮物是具有9. 3-9. 8M，優(yōu)選9. 6M尿素的水溶液。根據(jù)具體實施方式
，對于至少100天，優(yōu)選150天，試劑盒組分(緩沖液濃縮物、尿 素濃縮物)改變其PH值不超過+/-0.5，優(yōu)選+/-0.3或+/-0.1。由此它們是能貯存的，且 作為封閉的試劑盒理念能使用的。該能貯存的試劑盒組分優(yōu)選在至少100天，優(yōu)選150天的貯存時間后，在將緩沖液 濃縮物與尿素濃縮物混合時產生具有預定PH值+/-0. 5的應用緩沖液。此外，試劑盒可以具有MAC基質，優(yōu)選Ni2+-NTA基質。其還可以以珠子，優(yōu)選磁性 顆粒的形式提供。附1 顯示了現(xiàn)有技術中已知緩沖液體系的缺乏pH穩(wěn)定性的問題，該體系按標準 用于6x組氨酸標記蛋白的變性純化。以下緩沖液組分用于結合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫 緩沖液(應用緩沖液)。IOOmM NaH2PO4UOmM Tris、8M尿素和0. 05%吐溫20。將結合緩沖液(緩沖液B-T) 的PH值調到pH 8. 0，洗滌緩沖液(緩沖液C-T)的pH值調到pH 6. 3并將洗脫緩沖液(緩 沖液E-T)的pH值調到pH4.5。如圖la)_c)所示，各緩沖液的pH值在數(shù)天后已線性上升。
8
圖la)顯示用于將蛋白結合到基質上的含尿素的結合緩沖液“緩沖液B-T”的pH 值發(fā)展過程。如在圖中清晰可見的那樣，首先調節(jié)到PH 8.0的緩沖液的pH值在數(shù)天后線 性上升，并在約2月后達到pH值8. 4。圖lb)顯示用于從基質中洗滌和溶解非特異性結合蛋白的含尿素的應用緩沖液 “緩沖液c-τ”的PH值發(fā)展過程。如在圖中清晰可見的那樣，首先調節(jié)到pH 6. 3的緩沖液 的PH值已經在數(shù)天后線性上升，并在約2月后已達到中性pH值7。在這種條件下不能再提 供基質的有效洗滌，PH值必須重新調節(jié)。圖Ic)顯示用于從基質中洗脫感興趣蛋白的含尿素的應用緩沖液“緩沖液E-T”的 PH值發(fā)展過程。如在圖中清晰可見的那樣，首先調節(jié)到pH 4. 5的緩沖液的pH值已經在數(shù) 天后線性上升，并在約2月后已達到pH值超過6.5。此處蛋白的有效洗脫已不再可能，pH 值必須重新調節(jié)。由于pH升高，蛋白結合到基質上不再是最佳的；此外，損害洗滌步驟的嚴格性且 洗脫效率下降。在使用這種緩沖液時必要的是經較長時間的按照規(guī)律的PH校正。圖2 含尿素的緩沖液的pH值升高可以基于此處所述的反應順序。尿素可以與 Tris反應成過渡化合物，然后由其裂解成氨、強堿。然后通過產生氨，緩沖液的PH值迅速變 成堿性。此外，由于尿素與Tris反應損失了 Tris分子，因此其不能再用于緩沖作用。圖3 顯示根據(jù)本發(fā)明的緩沖液濃縮物隨時間的pH值穩(wěn)定性。在不同的時間點 進行8次pH測定。選擇以下組分用于緩沖液濃縮物370mM的NaH2P04、185mM的TrisCl、 0. 185% (ν/ν)吐溫20,0. 02%的NaR3用于結合緩沖液濃縮物；370mM的NaH2P04U85mM的 Bis-Tris鹽酸、0. 185% (ν/ν)吐溫20、0. 02%的NaN3用于洗滌緩沖液濃縮物和結合緩沖 液濃縮物。甚至在超過100天后，預調節(jié)到pH 7. 5的結合緩沖液濃縮物(此處ΝΤΤ-7. 5)無 波動地保持其PH值。同樣，甚至在超過100天后，預調節(jié)到pH 5. 6的洗滌緩沖液濃縮物 (此處ΝΤΤ-5. 6)無波動地保持其pH值或保持不值一提的pH值改變。甚至在超過100天 后，預調節(jié)到PH 3.0的結合緩沖液濃縮物(此處ΝΤΤ-3.0)沒有值得一提的波動地保持其 PH值。該實驗顯示根據(jù)本發(fā)明所使用的濃縮物的pH穩(wěn)定性，由此因其貯存穩(wěn)定性還可將其 用于封閉的試劑盒體系。圖4 顯示根據(jù)本發(fā)明由濃縮物(緩沖液濃縮物和尿素濃縮物)制備的應用緩沖 液的PH值穩(wěn)定性的實施例(BP=結合緩沖液；WP=洗滌緩沖液；EP=洗脫緩沖液)。為了 制備應用緩沖液，選擇具有在圖3中所述組分和pH值的緩沖液濃縮物。該尿素濃縮物由 9. 6Μ尿素水溶液組成，由此制成的應用緩沖液具有7. OM尿素。用于結合的應用緩沖液(pH 8. 0)通過將預定量的pH 7. 5的結合緩沖液濃縮物 (見上文)與尿素濃縮物混合而產生。用于洗滌的應用緩沖液(pH 6. 3)通過將洗滌緩沖液 濃縮物(見上文)與尿素濃縮物混合而產生。將應用緩沖液分別在檢測前由貯存的濃縮物 (緩沖液濃縮物和尿素濃縮物)混合。由濃縮物產生的用于結合的和用于洗滌的應用緩沖 液直至150天時沒有顯示值得一提的pH值變化。相應地的結果也符合洗脫緩沖液。用于洗脫的緩沖液(pH 4. 5)通過將預定量的pH 3. 0的緩沖液濃縮物(見上文) 與尿素濃縮物混合。在超過250天的測定時間段時，該洗脫緩沖液濃縮物僅顯示微小的、可 以接受的由4. 5到約4. 9的pH值的升高。這顯示，即使在較長貯存后，由各濃縮物通過簡單混合能獲得具有預定組成的和預定的、所期望的PH值的應用緩沖液。其優(yōu)點已在上文詳 細闡明。
權利要求
1.制備用于在變性條件下通過固定化金屬親和色譜(IMAC)純化蛋白的應用緩沖液 的方法，其特征在于，將具有預定PH值的預定量的緩沖液濃縮物與預定量的尿素濃縮物混 合，由此提供具有預定PH值的應用緩沖液。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，將分別具有不同PH值的至少三種緩沖液濃縮 物與預定量的尿素濃縮物混合，由此提供分別具有不同預定PH值的三種應用緩沖液。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于以下一種或多種特征a.該緩沖液濃縮物具有堿性PH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于結 合的應用緩沖液；和/或b.該緩沖液濃縮物具有7.0-9. 0的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用 于結合的應用緩沖液；和/或c.該緩沖液濃縮物具有約7.5的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于 結合的應用緩沖液；和/或d.該緩沖液濃縮物具有弱酸性pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于 洗滌的應用緩沖液；和/或e.該緩沖液濃縮物具有5.5-7. 0的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用 于洗滌的應用緩沖液；和/或f.該緩沖液濃縮物具有約5.6的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于 洗滌的應用緩沖液；和/或g.該緩沖液濃縮物具有酸性PH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于洗 脫的應用緩沖液；和/或h.該緩沖液濃縮物具有小于4的pH值，優(yōu)選小于3.5，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮 物混合后是用于洗脫的應用緩沖液。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的方法，其特征在于以下一種或多種特征a.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于結合的應用緩沖液具有堿性pH 值；和/或b.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于結合的應用緩沖液具有 7. 0-9. 0的pH值；和/或c.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于結合的應用緩沖液具有約8的 PH值；和/或d.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于洗滌的應用緩沖液具有弱酸性 至中性的PH值；和/或e.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于洗滌的應用緩沖液具有 5. 5-9.0的pH值；和/或f.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于洗滌的應用緩沖液具有6-6.5 的PH值；和/或g.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于洗脫的應用緩沖液具有酸性PH 值；和/或h.通過將緩沖液濃縮物與尿素濃縮物混合產生的用于洗脫的應用緩沖液具有小于 5. 5，優(yōu)選小于5的pH值。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項或多項的方法，其特征在于，所述具有預定pH值的緩沖液 濃縮物含有生物緩沖液。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項或多項的方法，其特征在于，a.用于制備結合應用緩沖液的緩沖液濃縮物含有在堿性中具有緩沖能力的緩沖液，優(yōu) 選iTris ；和b.用于制備洗滌緩沖液和應用緩沖液的緩沖液濃縮物含有在中性至酸性中具有緩沖 能力的緩沖液，優(yōu)選Bis-Tris ；和/或c.緩沖液濃縮物含有鹽，優(yōu)選NaH2PO4和/或去污劑，優(yōu)選吐溫和/或防腐劑，優(yōu)選NaN3O
7.根據(jù)權利要求1-6任一項或多項的方法，其特征在于，使用具有8-10M，優(yōu)選 9. 3-9. 8M尿素的水溶液作為尿素濃縮物。
8.根據(jù)權利要求1-7任一項的方法，其特征在于，以1 3. 7的比例混合尿素濃縮物和 至少一種緩沖液濃縮物。
9.尿素濃縮物用于制備具有預定pH值的應用緩沖液的用途，其中將預定量的尿素濃 縮物與具有預調PH值的預定量緩沖液濃縮物混合。
10.用于在變性條件下通過固定化金屬親和色譜(IMAC)純化蛋白的試劑盒，包含用于 制備具有預定PH值的應用緩沖液的至少一種具有預定pH值的緩沖液濃縮物以及至少一種 尿素濃縮物。
11.根據(jù)權利要求10的試劑盒，含有用于制備至少3種各自具有不同預定pH值的應用 緩沖液的至少3種具有不同預定pH值的緩沖液濃縮物以及尿素濃縮物。
12.根據(jù)權利要求10或11的試劑盒，其特征在于以下一種或多種特征a.該緩沖液濃縮物具有堿性pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于結 合的應用緩沖液；和/或b.該緩沖液濃縮物具有7.0-9. O的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用 于結合的應用緩沖液；和/或c.該緩沖液濃縮物具有約7.5的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于 結合的應用緩沖液；和/或d.該緩沖液濃縮物具有弱酸性至中性pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后 是用于洗滌的應用緩沖液；和/或e.該緩沖液濃縮物具有5.5-7. O的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用 于洗滌的應用緩沖液；和/或f.該緩沖液濃縮物具有約5.6的pH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于 洗滌的應用緩沖液；和/或g.該緩沖液濃縮物具有酸性PH值，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮物混合后是用于洗 脫的應用緩沖液；和/或h.該緩沖液濃縮物具有小于4的pH值，優(yōu)選小于3.5，該緩沖液濃縮物在與尿素濃縮 物混合后是用于洗脫的應用緩沖液。
13.根據(jù)權利要求10-12任一項或多項的試劑盒，其特征在于，所述具有預定pH值的緩 沖液濃縮物含有生物緩沖液。
14.根據(jù)權利要求1-13任一項或多項的試劑盒，其特征在于，a.用于制備結合應用緩沖液的緩沖液濃縮物含有在堿性中具有緩沖能力的緩沖液，優(yōu) 選iTris ；和b.用于制備洗滌緩沖液和應用緩沖液的緩沖液濃縮物含有在中性至酸性中具有緩沖 能力的緩沖液，優(yōu)選Bis-Tris ；和/或c.緩沖液濃縮物含有鹽，優(yōu)選NaH2PO4和/或去污劑，優(yōu)選吐溫和/或防腐劑，優(yōu)選NaN3O
15.根據(jù)權利要求10-14任一項或多項的試劑盒，其特征在于，是緩沖液體系。
16.根據(jù)權利要求10-14任一項或多項的試劑盒，其特征在于以下一種或多種特征a.對于至少100天，優(yōu)選至少150天，試劑盒組分改變其pH值不超過+/-0.1 ；和/或b.在貯存至少100天，優(yōu)選150天后，通過混合緩沖液濃縮物與尿素濃縮物，試劑盒組 分產生具有預定PH值+/-0. 5的應用緩沖液；和/或c.所述試劑盒具有基質，優(yōu)選IMAC，優(yōu)選Ni2+-NTA；和/或d.所述試劑盒能用于自動化應用。
17.根據(jù)權利要求1-16任一項或多項的試劑盒，其特征在于，試劑盒具有IMAC基質，優(yōu) 選以磁性顆粒的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備用于在變性條件下通過固定化金屬親和色譜(IMAC)純化蛋白的應用緩沖液的方法，其特征在于，將具有預定pH值的預定量的緩沖液濃縮物與預定量的尿素濃縮物混合，由此提供具有預定pH值的應用緩沖液。根據(jù)本發(fā)明還提供相應的試劑盒。其組分是貯存穩(wěn)定的且通過混合產生具有預定pH值的預定組成的應用緩沖液。本發(fā)明由此是能自動化和作為封閉試劑盒理念能使用的。
文檔編號B01D15/38GK102076394SQ200980124098
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權日2008年6月27日
發(fā)明者F·斯查弗, H·布洛克, T·德特斯克曼 申請人:快而精有限公司