用于檢測輔酶q10的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了易于適應(yīng)于高通量篩選方法的用于快速和定量提取和檢測樣品中輔酶Q10的方法。本發(fā)明還提供了用于實施本發(fā)明的方法的試劑和試劑盒。
【專利說明】用于檢測輔酶Q10的方法和試劑盒
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2012年3月2日提交的61/606019號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，其全部 內(nèi)容在此通過引用并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 輔酶Q10,本文也稱為CoQlO、泛醌或泛癸利酮，是一種常用的營養(yǎng)補充物，并可以 作為維生素類補充劑在營養(yǎng)品商店、健康食品商店、藥店等處找到其膠囊的形式，以通過泛 醇（CoQlO的還原形式）的抗氧化性能幫助保護免疫系統(tǒng)。CoQlO在人體的大部分組織和其 他哺乳動物的組織中普遍發(fā)現(xiàn)。CoQlO是高度親脂性的，并且在大部分不溶于水。不溶性與 烴性質(zhì)的50個碳原子的類異戊二烯側(cè)鏈有關(guān)，如CoQlO的如下結(jié)構(gòu)中所示。
[0005]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于測定樣品中輔酶QlO(CoQlO)的量的方法，所述方法包括： 向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液，其導(dǎo)致所述樣品的相分離；和 光譜學(xué)地分析所述第二提取層來測定CoQlO的量。
2. -種用于測定樣品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述樣品中加入第一提取緩沖液和第二提取緩沖液； 混合所述樣品；和 分析所述第二提取層以測定CoQlO的量，其中所述第一提取緩沖液和第二提取緩沖液 的單次提取導(dǎo)致比使用單獨甲醇的提取檢測到至少2倍的CoQlO量。
3. -種用于測定樣品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述樣品中加入第一提取緩沖液； 加熱并混合所述樣品； 向所述樣品中加入第二提取緩沖液，其導(dǎo)致所述樣品的相分離； 加熱并混合所述樣品； 冷卻所述樣品至環(huán)境溫度；及 分析所述第二提取緩沖液層以測定樣品中CoQlO的量。
4. 一種用于測定樣品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述樣品中加入第一提取緩沖液； 加熱并混合所述樣品； 向所述樣品中加入第二提取緩沖液，其導(dǎo)致所述樣品的相分離； 加熱并混合所述樣品； 冷卻所述樣品至環(huán)境溫度；及 通過光譜分析對第二提取緩沖液層進行光譜學(xué)分析，以測定樣品中CoQlO的量，其中 用提取緩沖液的單次提取導(dǎo)致比使用單獨甲醇提取隨后是液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC/MS/ MS)提取到至少2倍的CoQlO量。
5. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中在樣品中檢測到的CoQlO的量是通過 光譜分析法光譜學(xué)地測定的。
6. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中CoQlO的量用LC/MS/MS檢測。
7. 如權(quán)利要求2或4中任一項所述的方法，其中所述使用第一提取緩沖液和第二提取 緩沖液提取的CoQlO的量光譜學(xué)地測定，和用單獨甲醇提取檢測的CoQlO的量使用LC/MS/ MS測定。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法是高通量篩選分析方法的部 分。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法通過自動化完成。 1 〇.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法在短的時間段中完成。
11. 如權(quán)利要求1、3-4和7-10中任一項所述的方法，其中與使用單獨甲醇提取隨后 LC/MS/MS的CoQlO檢測而檢測到的CoQlO的總量相比，所述樣品使用第一提取緩沖液和第 二提取緩沖液提取并且CoQlO的量光譜學(xué)地測定，在樣品中檢測到的CoQlO的總量至少為 2倍。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQlO檢測 而檢測到的量相比，所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQlO的量 光譜學(xué)地測定，在樣品中檢測到的CoQlO的總量為至少5倍。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQlO檢測 而檢測到的量相比，所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQlO的量 光譜學(xué)地測定，在樣品中檢測到的CoQlO的總量為至少10倍。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQlO檢測 而檢測到的量相比，所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQlO的量 光譜學(xué)地測定，在樣品中檢測到的CoQlO的總量為至少15倍。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中與使用單獨甲醇提取隨后LC/MS/MS的CoQlO檢測 而檢測到的量相比，所述樣品使用第一提取緩沖液和第二提取緩沖液提取并且CoQlO的量 光譜學(xué)地測定，在樣品中檢測到的CoQlO的總量為至少25倍。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含非極性溶 劑。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含有機溶劑。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含選自于苯、 甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、環(huán)己烷、1，4-二氧六烷、氯仿、二乙醚、二異丙醚和二異丁基 醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺（DMF)、氯甲烷和二氯甲烷的溶劑。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含烷烴。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含己烷。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-15和17中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含乙 腈。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-15和17中任一項所述的方法，其中所述第二提取緩沖液包含異丙 醇。
23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含極性質(zhì)子 溶劑。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含有機溶劑。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含選自于甲 酸、正丁醇、異丙醇、正丙醇，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸（TCA)和水的溶劑。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述溶劑包含醇。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述醇是甲醇。
28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含表面活性 劑。
29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含去垢劑。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述去垢劑是溫和的去垢劑。
31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液是水性溶液。
32. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液包含類固醇酸。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述類固醇酸是膽汁酸。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述膽汁酸包含選自于牛黃膽酸、甘氨膽酸、膽 酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸的酸。
35. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述膽汁酸包含脫氧膽酸。
36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中脫氧膽酸是鹽。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述脫氧膽酸鹽包含的無機離子是I族金屬。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為選自于Li+、 Na+和K+的鹽的無機離子。
39. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述脫氧膽酸鹽的無機離子包含作為鈉離子的無 機離子。
40. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品包含生物樣品。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述生物樣品是基于細胞的樣品。
42. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品包含哺乳動物樣品或兩棲 動物樣品。
43. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品包含選自于人類樣品、非人 靈長類動物樣品和嚙齒動物樣品的樣品。
44. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品是來自于選自小鼠、大鼠、 豚鼠、兔和人的受試者的樣品。
45. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述光譜分析通過使用選自于吸收 光譜法、熒光X射線光譜法、火焰光譜法、可見光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、近紅外光 譜法、拉曼光譜法、相干反斯托克斯拉曼光譜法（CARS)、核磁共振光譜法、光子發(fā)射光譜法 和穆斯堡爾光譜法的光譜技術(shù)進行。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述光譜技術(shù)是紫外光譜法。
47. 如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光譜法在270nm至280nm的一個或 多個波長處進行。
48. 如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光譜法在273nm至277nm的一個或 多個波長處進行。
49. 如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光譜在275nm的波長處進行。
50. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一提取緩沖液的體積與所述 第二提取緩沖液的體積之比是5:1至1:1。
51. 如權(quán)利要求28至50中任一項所述的方法，其中所述表面活性劑或去垢劑與所述第 一提取緩沖液的體積之比為50:1至1:1。
52. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至50-100°C。
53. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至55-75°C。
54. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至60-70°C。
55. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液、第二提取緩沖液或第一和第二提取緩沖液兩者后加熱至65°C。
56. 如權(quán)利要求52至55中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液和所述第二提取緩沖液后加熱至相同的溫度。
57. 如權(quán)利要求52至55中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液和所述第二提取緩沖液后加熱至不同的溫度。
58. 如權(quán)利要求52至57中任一項所述的方法，其中所述的加熱持續(xù)至少5秒、至少10 秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少 90秒、至少105秒或至少120秒的時間。
59. 如權(quán)利要求52至58中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液和所述第二提取緩沖液后加熱相同的時間量。
60. 如權(quán)利要求52至58中任一項所述的方法，其中所述樣品在添加所述第一提取緩沖 液和所述第二提取緩沖液后加熱不同的時間量。
61. 如權(quán)利要求52至60中任一項所述的方法，其中與沒有被加熱的對照樣品相比，力口 熱樣品提高CoQlO的提取至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30% 或至少50%。
62. 如權(quán)利要求2-61中任一項所述的方法，其中所述樣品通過機械攪拌混合。
63. 如權(quán)利要求2-61中任一項所述的方法，其中所述樣品通過超聲處理混合。
64. 如權(quán)利要求2-61中任一項所述的方法，其中所述樣品通過磁力攪拌混合。
65. 如權(quán)利要求62至64中任一項所述的方法，其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖 液后混合。
66. 如權(quán)利要求62至64中任一項所述的方法，其中所述樣品在加入所述第二提取緩沖 液后混合。
67. 如權(quán)利要求62至64中任一項所述的方法，其中所述樣品在加入所述第一提取緩沖 液和所述第二提取緩沖液后混合。
68. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在加入所述第二提取緩沖液后向所 述樣品中加入無機鹽。
69. 如權(quán)利要求68的方法，其中所述無機鹽包括NaCl。
70. 根據(jù)權(quán)利要求1-69中任一項所述的方法，其中在加入所述第二提取緩沖液后，向 所述樣品中添加飽和鹽水溶液。
71. 如權(quán)利要求68至70中任一項所述的方法，其中所述鹽被添加至約ImM至約50mM 的終濃度。
72. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在所述第二提取緩沖液的光譜分析 前過濾所述樣品。
73. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法在10分鐘內(nèi)完成。
74. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法在5分鐘內(nèi)完成。
75. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法在1分鐘內(nèi)完成。
76. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中整個方法在30秒內(nèi)完成。
77. -種用于實施前述權(quán)利要求中任一項所述的方法的試劑盒。
78. 如權(quán)利要求77所述的試劑盒，包含如下的至少兩種：第一提取緩沖液、第二次提取 緩沖液和CoQlO。
79. -種用于測定樣品中輔酶QlO(CoQlO)的量的方法，所述方法包括： a)向所述樣品中加入已知量的氣化輔酶Q10(CoQ10-d6); b) 通過質(zhì)譜檢測CoQlO和CoQ10-d6 ;和 c) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10-d6相比較來測定檢測到的CoQlO的量。
80. -種用于測定樣品中還原形式的C〇Q10(C〇Q10H2)的量的方法，所述方法包括： a) 向所述樣品中加入已知量的還原的氣化輔酶Q10(CoQ10H2-d6); b) 通過質(zhì)譜檢測C〇Q10H2和CoQ10H2-d6 ;和 c) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10H2-d6相比較來測定檢測到的C〇Q10H2的量。
81. -種用于同時測定樣品中CoQlO和C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6 ; b) 通過質(zhì)譜檢測 CoQlO、C〇Q10H2、CoQ10-d6 和 CoQ10H2-d6 ;和 c) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10H2-d6相比較來測定檢測到的CoQlO的量；和 d) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10H2-d6相比較來測定檢測到的C〇Q10H2的量。
82. -種用于測定樣品中C〇Q10H2氧化程度的方法，所述方法包括： a) 向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6 ; b) 通過質(zhì)譜測量所述樣品中C〇Q10H2-d6和C〇Q10-d6的相對量；和 c) 將CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理論相對量與在步驟b中測量的CoQ10H2-d6和 CoQ10-d6的相對量相比較。
83. 如權(quán)利要求80-82所述的方法，其中通過將CoQ10-d6與一種或多種還原劑進行反 應(yīng)而獲得CoQ10H2-d6。
84. 如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述還原劑是硼氫化鈉。
85. 如權(quán)利要求81-84所述的方法，其中在樣品收集后立即將CoQ10-d6和/或 CoQ10H2-d6加入到所述樣品中。
86. 如權(quán)利要求81-85所述的方法，其中所述樣品是生物樣品。
87. 如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述生物樣品是血漿或血清。
88. 如權(quán)利要求86或87所述的方法，其中所述生物樣品是人類樣品。
89. -種用于測定樣品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述樣品； b) 向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6; c) 提取所述樣品； d) 任選地將所述樣品進行液相色譜； e) 通過質(zhì)譜檢測CoQlO和CoQ10-d6 ;和 f) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10-d6相比較來測定檢測到的CoQlO的量。
90. -種用于測定樣品中C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述樣品； b) 向所述樣品中加入已知量的CoQ10H2-d6; c) 提取所述樣品； d) 任選地將所述樣品進行液相色譜； e) 通過質(zhì)譜檢測C〇Q10H2和CoQ10H2-d6 ;和 f) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10H2-d6相比較來測定檢測到的C〇Q10H2的量。
91. 一種用于測定樣品中CoQlO和C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述樣品； b) 向所述樣品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6 ; c) 提取所述樣品； d) 任選地將所述樣品進行液相色譜； e) 通過質(zhì)譜檢測 CoQlO、CoQ10-d6、C〇Q10H2 和 CoQ10H2-d6 ; f) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10-d6相比較來測定檢測到的CoQlO的量；和 g) 通過與已知量的檢測到的C〇Q10H2-d6相比較來測定檢測到的C〇Q10H2的量。
92. 如權(quán)利要求89-91所述的方法，其中步驟c包括加入提取緩沖液。
93. 如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述提取緩沖液包含1-丙醇。
94. 如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述提取緩沖液包含異丙醇。
95. 如權(quán)利要求89-94所述的方法，其中步驟b-d使用預(yù)冷的低溫模塊實施。
【文檔編號】C02F3/00GK104245599SQ201380021300
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】N·N·坦納, R·薩蘭加拉簡, N·R·納萊恩, S·欒 申請人:博格有限責(zé)任公司