專利名稱：一種降解百菌清的細(xì)菌菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種降解百菌清的細(xì)菌菌株及制備方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)農(nóng)藥是保證農(nóng)作物高產(chǎn)豐收的重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，一直是化學(xué)工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)，農(nóng)業(yè)上使用的主要有機(jī)農(nóng)藥品種過去一直以有機(jī)磷、有機(jī)氯等為主導(dǎo)，重要的有機(jī)氯農(nóng)藥如六六六、滴滴涕、百菌清等一直是農(nóng)藥主導(dǎo)產(chǎn)品。上個(gè)世紀(jì)80年代以前，我國(guó)農(nóng)藥一直是以有機(jī)氯農(nóng)藥占首位，約占農(nóng)藥總產(chǎn)量的60%左右(環(huán)境保護(hù)部，2008)。但部分有機(jī)氯殺蟲(菌)劑性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水而易溶于脂，殘效期長(zhǎng)，被大量用于防治農(nóng)林害蟲，造成土壤、水域和空氣污染。2001年5月，我國(guó)簽署了《關(guān)于持久性污染的斯德哥爾摩公約》，部分有機(jī)氯農(nóng)藥品種，包括艾氏劑、氯丹、滴滴涕、狄氏劑、異狄氏劑、七氯、毒殺芬、六氯苯、滅蟻靈等有機(jī)氯農(nóng)藥已被列入急需采取行動(dòng)解決的POPs (持久性有機(jī)污染物)品種(R-T&A, 2002)。2002年6月5日，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布國(guó)家明令禁止使有機(jī)氯類農(nóng)藥包括六六六、DDT、 毒殺芬、艾氏劑和狄氏劑。我國(guó)除了艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑未生產(chǎn)之外，曾大量生產(chǎn)和使用過滴滴涕、氯丹、滅蟻靈、七氯、毒殺芬和六氯苯，作為公約的締約國(guó)之一，我國(guó)已陸續(xù)停止了七氯和毒殺芬的生產(chǎn)和使用。中國(guó)對(duì)氯丹、六氯苯、滅蟻靈和滴滴涕四種PCPs物質(zhì)申清了 5年的特定豁免，到2009年將逐步生產(chǎn)出替代產(chǎn)品。目前，在我國(guó)登記有效期內(nèi)的有機(jī)氯類農(nóng)藥原藥品種有百菌清、三氯殺螨醇、硫丹、四螨嗪、四氯苯酞、林丹和三氯殺蟲酯。 其中，百菌清、三氯殺螨醇產(chǎn)量較大，約占有機(jī)氯類農(nóng)藥原藥總產(chǎn)量的90%以上(環(huán)境保護(hù)部，2008)。百菌清化學(xué)名稱2，4，5，6-四氯-I，3-苯二腈(2，4，5，6_tetrachloro-l， 3-benzenedicarbonitrile)，英文通用名Chlorothalonil (BSI，Ε-ISO, (M)F-ISO, SNSI)； Tetrachloroisophthalonethile(IUPAC) ；TPN(JMAP)。其他英文名稱有 Bravo，Daconi 1, Dacotech，Colonil，Exotherm, Termil。其它中文別名有達(dá)科寧，大克靈，克勞優(yōu)，霉必清， 打克尼爾，桑瓦特；四氯異苯腈。百菌清是一種廣譜，非內(nèi)吸型的有機(jī)氯殺菌劑，是目前在我國(guó)用量最大的有機(jī)氯農(nóng)藥，年產(chǎn)量超過8000噸(新農(nóng)藥，200 ，廣泛用于防治各種蔬菜、瓜果、花生、水稻、小麥等作物真菌病害；在美國(guó)，百菌清是第二大類廣泛使用的農(nóng)業(yè)殺菌劑，每年使用量達(dá)5000 噸(CoxC，1997)。然而它在鳥類、魚類及其水生脊椎動(dòng)物中都有很高的蓄積毒性，百菌清對(duì)大鼠腎臟有致癌作用，在環(huán)境中較穩(wěn)定，殘效期長(zhǎng)，具明顯的蓄積毒性。而且百菌清還是環(huán)境激素類似物，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用。其在土壤中的長(zhǎng)期積累以及短期內(nèi)無法替代造成了農(nóng)田土壤的污染。值得一提的是，百菌清在自然界中的主要代謝物質(zhì)之一的4-羥基_2，4，5-三氯間苯二甲腈，毒性是母體的三十倍，并且移動(dòng)性和持久性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于母體，其毒性正引起人們的重視(Rosanoff K A&Siegel M R，1981)。百菌清的代謝轉(zhuǎn)化主要有百菌清的水解、在土壤中的生物降解、光化學(xué)降解、臭氧降解。其中土壤生物降解是百菌清代謝轉(zhuǎn)化的主要途徑。參與降解的土壤微生物主要包括真菌、細(xì)菌、放線菌等，其中細(xì)菌由于生化上的多種適應(yīng)能力和容易誘發(fā)突變菌株等特性， 在降解農(nóng)藥的微生物種群中占有重要位置。土壤中廣泛存在著可降解百菌清的細(xì)菌。氮單胞菌(Azomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)、莫拉氏菌(Moraxella)、假單胞菌(Paeudomonas)、微球菌 (Micrococcus)等都作為百菌清的降解菌被分離到(Sato&Tanka 1987，katayama等 1991a)。但這些細(xì)菌大多數(shù)都不能將百菌清作為唯一的碳源，而需要添加其他的碳源 (Katayama et al，1991a)。Motonaga等(1995)從百菌清作用過的土壤中分離到一株革蘭氏陰性棒狀菌株TBI，在培養(yǎng)120h后，將75%的百菌清轉(zhuǎn)化為TPN-OH和Cl—。該菌株同樣也不能在含有百菌清的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的目的是提供一種能利用百菌清作為唯一的碳源，用于降解百菌清的細(xì)菌菌株及其制備方法。本發(fā)明涉及一種可降解百菌清的細(xì)菌菌株及其制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
百菌清的微生物降解，就是利用微生物來減少百菌清在土壤中的殘留。本發(fā)明的目的是針對(duì)目前還沒有更好的用于降解土壤殘留百菌清的微生物極其制劑，而提供一種從土壤中分離篩選培養(yǎng)出的特定的百菌清降解細(xì)菌，用于修復(fù)百菌清殘留污染的土壤，本發(fā)明還提供了該降解細(xì)菌的制備方法。為有效地分離到降解百菌清的細(xì)菌菌株，本發(fā)明通過采集河南安陽部分農(nóng)藥廠周邊百菌清長(zhǎng)期污染的土壤，用平板稀釋的方法，在含有百菌清的平板上分離得到1株百菌清降解細(xì)菌1 -38\經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析將所有菌株鑒定到屬，并經(jīng)過進(jìn)一步的 G+C m0l%含量的測(cè)定、DNA-DNA雜交、化學(xué)鑒定及生理生化特征的鑒定，將該菌株堅(jiān)定為 Lysobacter ruipuensis sp. nov，該菌種已在中國(guó)專利局指定的微生物保藏單位，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏登記號(hào)為=CGMCC 1. 10344τ,同時(shí)也在德國(guó)菌保中心DSMZ保藏，其保藏登記號(hào)為DSM 23235τ。RB_38T Lysobacter ruipuensis sp. nov 具有下述性質(zhì)培養(yǎng)特征在LB平板培養(yǎng)基上(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g, H2O lOOOmL，瓊脂20g，用 lmol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0)，菌落圓形，淡黃至磚紅色，菌落邊緣平整，有光澤。鏡檢形態(tài)菌體長(zhǎng)桿狀，經(jīng)革蘭氏染色，為革蘭氏陰性。上述百菌清降解細(xì)菌按以下方法分離、純化和保存(1).基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基NH4NO3 1. Og, MgSO4 · 7H20 0. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, KH2PO4O. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4L 5g, H2O lOOOmL，用 lmol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 7· O。O). LB 培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl IOg5H2O lOOOmL，瓊脂 20g，用 lmol/L HCl 或 NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。
(3).分離篩選培養(yǎng)基在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中加入不同濃度的百菌清母液，使其終濃度為5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、60、80、100mg/L，混勻后倒平板。(4).菌株的選擇性分離用天平稱取IOg 土樣，置于90mL無菌水中，30°C，180rpm，20min,打散土壤顆粒，制均勻土壤懸液，室溫靜置30min，取上清作為土壤原液(10°)，再用ImL無菌吸管吸取ImL上清液加入9mL無菌水中，充分搖勻后制得KT1稀釋液，依次稀釋得到10_2，10_3稀釋液。分別吸取10_3、10_4、10_5稀釋液200ul涂布到含有百菌清的固體選擇平板上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。(5).菌株的純化和保存挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落在LB培養(yǎng)基上多次劃線純化，純化后的菌種再接于含有百菌清的篩選培養(yǎng)基上復(fù)驗(yàn)，具有降解能力的菌株劃LB斜面4°C保存或接入LB液體培養(yǎng)基，待菌體長(zhǎng)入對(duì)數(shù)期后取等量菌液與30%甘油混勻置于小離心管，-70°C保存。夜。
上述百菌清降解細(xì)菌按以下方法進(jìn)行鑒定 (1).菌體總DNA小量提取
(1)從固體平板上挑取單菌落接種于20mL LB液體培養(yǎng)基，30°C，ISOrpm培養(yǎng)過
(2)收集4mL菌液于5mL離心管中，4°C12000rpm離心5min收集菌體。
(3)用ImLTE洗菌體兩次后加入ImLTE懸浮。
(4)菌液中加入溶菌酶0.OOlg，混勻。
(5)37°C水浴，直至液體澄清，底部有碎片。
(6)加入RNase (10mg/mL) 5 μ 1，37°C水浴 30min。
(7)加入10%SDS 200uL,60°C -65°C處理至液體澄清。
(8)加入蛋白酶K粉末少許，37°C處理1-2小時(shí)。
(9)加入1/5 體積 5M NaClO4。
(10)等體積苯酚氯仿異戊醇抽提1-2次，12000rpm離心15min收集上清。
(11)等體積氯仿異戊醇抽提1-2次，12000rpm離心IOmin收集上清。
(12)加入1/10體積3MNaAc，2倍體積無水乙醇_20°C沉淀30min。
(13)玻璃棒挑出沉淀出的DNA，加入70%乙醇中過夜處理去鹽。
(14)DNA晾干后加入400 μ 1水溶解，_20°C保存。 (2) · 16S rDNA 的擴(kuò)增 (1)引物
擴(kuò)增采用通用的引物，根據(jù)大腸桿菌16S rDNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì) 正向引物 Pl :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，其序列對(duì)應(yīng)于 E. coli 16S rDNA 的第8-37堿基位置；反向引物P2 :5，-TTCAGCATTGTTCCAT-3，其序列對(duì)應(yīng)于 E. coli 16S rDNA 的第 1479-1506堿基位置。(2)擴(kuò)增體系ddH20 14. 2 μ 1
IOXPCR buffer 2μ 1
dNTP 0. 5μ 1
16S Pl 0. 5μ 1
16S P2 0. 5μ 1
模板DNA 2μ 1
Taq DNA聚合酶0. 3μ 1
dH20補(bǔ)足20 μ 1
(3)擴(kuò)增條件
95 0C IOmin (預(yù)變性)
95°C30s (變性)、
56°C30s (退火)^30cycles
72°CImin (延仲)J72°C IOmin(穩(wěn)定延伸)Icycle4°C 5min (保存)Icycle(3). 16S rDNA PCR 產(chǎn)物純化快速純化回收試劑盒法中科瑞泰DNA純化回收試劑盒使用說明(1)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下將單一的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，凝膠盡量小，將凝膠切成小塊，放入干凈的離心管中，稱取重量；(2)向膠塊中加入3倍體積的溶膠劑PN，50_55°C水浴加熱lOmin，期間取出顛倒混勻2-3次，直至凝膠完全融化；(3)將上一步所得溶膠液加入到吸附柱CAl中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置 2min, 12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液；(4)向吸附柱中加入700μ 1漂洗液PW(70%乙醇)，12，000rpm離心30s，倒掉收集
管中的廢液；(6)向吸附柱中加入500 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管中的廢液；(7)將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm離心2min，去除70%乙醇；(8)將純化柱放在干凈的1. 5ml離心管中，開蓋放置5-lOmin，以保證乙醇揮發(fā)干凈；(9)加入20 μ 1滅菌的ddH20或TE緩沖液于純化樹脂上，注意不能將水滴在管壁上；(10)放置2min，12，OOOrpm離心30s。液體即是純化的得DNA產(chǎn)物，取1 μ 1電泳
檢測(cè)并定量。(4). PCR 產(chǎn)物的 Τ/Α 克隆Τ/Α克降是對(duì)PCR產(chǎn)物直接克隆的一種方法，利用DNA聚合酶具有的延伸酶活性， 將一個(gè)A殘基添加到已完全延伸的PCR產(chǎn)物的3’末端，然后利用含有單個(gè)胸腺嘧啶(Τ)3’ 突出段的線性化載體與帶有單個(gè)腺苷酸(A) 3’突出端的插入片段連接來進(jìn)行的。
10 μ 1連接反應(yīng)體系
pMD18-T vector 0. 5μ 1
PCR product8. 2μ 1
10Xligase buffer 1 μ 1
Ligase 0. 3μ 1
16°C連接反應(yīng)過夜。
(5).生理生化實(shí)驗(yàn)
(1)革蘭氏染色
將菌株接種于LB平板上，50°C培養(yǎng)18h，革蘭氏染色，油鏡觀察。
①涂片無菌操作條件下，用接種環(huán)沾取已培養(yǎng)18h的菌體，在載玻片上的20mL
已滅菌水中劃幾下，酒精燈灼熱接種環(huán)，再用冷卻的接種環(huán)在水滴中劃lmin，使菌體分布均勻，自然晾干；②初染將載玻片在火焰中來回過2_3s，熱固定涂布，結(jié)晶紫染色lmin，自來水清洗涂片，自然晾干；③媒染碘液lmin，自來水清洗涂片，自然晾干；④脫色脫色液輕洗涂片3s (時(shí)間嚴(yán)格控制)，自來水輕洗涂片，自然晾干；⑤復(fù)染復(fù)染液染色lmin，自來水輕洗涂片，自然晾干；⑥油鏡觀察以革蘭氏陰性菌E. coli為對(duì)照。革蘭氏陽性菌表現(xiàn)為藍(lán)色或紫色，而革蘭氏陰性菌表現(xiàn)為紅色。(2)氧化酶在干凈培養(yǎng)皿中放一張濾紙。滴上鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺的1 %水溶液，僅使濾紙濕潤(rùn)即可，不可過濕。用白金接種環(huán)(可用滅菌玻棒或牙簽代替)取18-M小時(shí)培養(yǎng)的菌苔。涂抹在濕潤(rùn)的濾紙上，在IOs內(nèi)涂抹的菌苔出現(xiàn)紅色者為陽性，10-60s出現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，60s以上者出現(xiàn)紅色者不計(jì)，按陰性處理。注意鐵、鎳等金屬可催化二甲基對(duì)苯撐二胺呈紅色，不宜使用。(3)接角蟲酶將18小時(shí)培養(yǎng)的菌株，以鉬絲接種環(huán)取一小環(huán)涂抹于已滴有3%的過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡為陰性。(4)最適 pH將待測(cè)菌株用LB液體培養(yǎng)基活化后，用微量進(jìn)樣器取50 μ 1菌液，接種于ρΗ2、4、 6、7、8、10的LB液體培養(yǎng)基中，并以不接種的試管3支作對(duì)照，30°C培養(yǎng)2天，觀察結(jié)果。(5)耐鹽性實(shí)驗(yàn)將待測(cè)菌株用LB液體培養(yǎng)基活化后，用微量進(jìn)樣器取50 μ 1菌液，接種于NaCl濃度分別為0-10(% W/V)的LB液體培養(yǎng)基，每株菌每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，以不接菌的試管3 支作對(duì)照，30°C培養(yǎng)2天，觀察結(jié)果。(6)硝酸還原實(shí)驗(yàn)將試驗(yàn)菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，并以不接菌的試管作為對(duì)照，室溫培養(yǎng)1、 3、5天。取2支干凈的試管倒入少許培養(yǎng)液，然后在其中分別各加1滴GrissA液和GrissB
7液，在對(duì)照管中同樣加試劑，當(dāng)培養(yǎng)液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時(shí)，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。如無紅色出現(xiàn)，可加1 2滴二苯胺試劑，此時(shí)培養(yǎng)液如果呈現(xiàn)藍(lán)色，則表示培養(yǎng)液中仍然有硝酸鹽，如不呈藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都已經(jīng)還原成其他物質(zhì)，故仍應(yīng)按硝酸鹽還原陽性處理。(7)酪蛋白水解實(shí)驗(yàn)將待測(cè)菌點(diǎn)種于酪蛋白水解平板上，30°C培養(yǎng)7-14天，觀察。酪氨酸被水解而變透明者為陽性，否則記為陰性。(8)產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)將試驗(yàn)菌接種后培養(yǎng)2-4天，檢測(cè)時(shí)沿試管壁緩緩加入3_5mL的對(duì)二甲基氨基苯甲醛，勿搖動(dòng)試管，在液層界面形成紅色環(huán)者為陽性反應(yīng)，如仍為黃色記為陰性。若顏色不明顯，可加入4-5滴乙醚于培養(yǎng)液中，搖動(dòng)使乙醚分散于液體中靜置，待乙醚浮至液面后， 再加檢測(cè)試劑，如培養(yǎng)液中有吲哚時(shí)，吲哚被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)顏色會(huì)更明顯。(9)七葉苷水解實(shí)驗(yàn)將七葉苷培養(yǎng)基制成斜面，劃線接種，2-7天后觀察，如果菌苔及周圍的培養(yǎng)基變?yōu)楹谏邽殛栃裕瑹o黑色為陰性。(10)尿素水解在尿素水解培養(yǎng)基上劃線接種，2-5天后培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，反之為陰性。(11)吐溫80水解在TweenSO水解平板上點(diǎn)種待測(cè)菌株，30°C培養(yǎng)2-4天，菌落周圍出現(xiàn)白色暈圈者為陽性，反之為陰性。(12)淀粉水解將活化的菌種接種于平板上，30°C培養(yǎng)4天，形成菌落后，在平板上滴加盧氏碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈的大小為水解淀粉能力的大小。(6). G+C mol %含量的測(cè)定和DNA-DNA雜交(1)細(xì)菌基因組的提取，方法同上O) DNA濃度、純度的檢測(cè)將提取的DNA樣品，分別測(cè)定其230nm、260nm、280nm的吸光度，如果
A260 A280 A230 ^ 1 0.515 0.450，則其純度符合要求。如果不符合要求需要再次去除蛋白或RNA，使其符合要求。DNA的濃度要求A26tl > 2. 0 (約100 μ g/mL)。(3) Tm值及G+C mol%含量的測(cè)定采用熱變性溫度法來測(cè)定DNA G+C mo 1 %，所用儀器由Lambda Bio 20型紫外分光光度計(jì)、PTP-I溫度控制儀、循環(huán)水浴和計(jì)算機(jī)組成。整個(gè)測(cè)定過程由UV Winlab軟件控制。①Tm值的測(cè)定將待測(cè)DNA樣品用0. IX SSC適當(dāng)稀釋，使其吸光度為0.2 0.5。以E.coilK12 菌株的DNA作參比，以消除實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差。測(cè)定結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件計(jì)算出變性曲線的一階導(dǎo)數(shù)曲線，記錄一階導(dǎo)數(shù)曲線峰值所對(duì)應(yīng)的溫度，即為DNA樣品的解鏈溫度，即Tm值。②DNA G+C mo 1 % 計(jì)算如果DNA G+C mol %值在25-75 %的范圍內(nèi)，其Tm值與DNA G+C mol %之間呈線形關(guān)系。在0. IXSSC溶液中，G+C mol %的計(jì)算公式為DNA G+C mol % = 51. 2+2. 08 [Tm(X)-Tm(R)]其中Tm(X)為待測(cè)菌的Tm值；Tm(R)為大腸桿菌K12的Tm值。(4) DNA-DNA 雜交①DNA樣品的剪切用于DNA-DNA雜交的樣品濃度要求A26tl大于2. 0 (約100 μ g/mL)，先將待測(cè)DNA樣品用0. 1 X SSC調(diào)到A26tl = 2. 0左右。為使樣品的濃度一致，要求各樣品的A26tl值的差異小于0.1。取3mL樣品置于5mL離心管中，加入0.72mL 10XSSC溶液，使緩沖液的終濃度為 2XSSC0用超聲波剪切DNA樣品，其輸出功率為120W，間隔時(shí)間為4秒，重復(fù)120次，每60 次之后取出顛倒混勻。因超聲波剪切時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，可能導(dǎo)致剪切的DNA樣品發(fā)生降解，因此在剪切過程中DNA樣品應(yīng)置于冰浴上。剪切完畢后迅速將樣品按0. 5mL分裝在 1.5mL離心管中，置于-20°C保存。通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)樣品的剪切質(zhì)量。一般要求 DNA片段的大小集中在2 5 X IO5Da (300 800bp)。②DNA變性取剪切好的樣品于室溫融化后等量混勻(共ImL)，裝入石英比色杯中。插入溫度傳感器探頭，然后將比色杯放入可加熱的比色架內(nèi)，通過溫度控制儀(PTP-I)來控溫，使 DNA樣品在100°C下變性15-20分鐘。③復(fù)性速率的測(cè)定變性結(jié)束后，將溫度控制儀的溫度設(shè)定為最適復(fù)性溫度[Tm = 0. 51X (G+C) % +47. 0]。當(dāng)變性DNA樣品的溫度迅速降至最適復(fù)性溫度，并穩(wěn)定2分鐘后，開始復(fù)性反應(yīng)， 一般進(jìn)行20分鐘。計(jì)算機(jī)可記錄^Onm處吸光值隨時(shí)間變化的復(fù)性反應(yīng)曲線，該曲線的斜率即為DNA樣品的復(fù)性速率。復(fù)性速率可以很方便的由計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件求得。復(fù)性溫度的計(jì)算公式Tor = 47. 0+ (G+Cmol % )④DNA-DNA同源性計(jì)算DNA同源性(H% )根據(jù)Deley等(1970)的公式計(jì)算EV0= [4Vm_(Va+Vb] + [2(VaXVbl/2] X100其中，VA表示樣品A的自身復(fù)性速率VB表示樣品B的自身復(fù)性速率Vm表示樣品A與B等量混合后的復(fù)性速率。上述百菌清降解細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色，為革蘭氏陰性菌；RB-38與溶桿菌屬 (Lysobacter)多株菌同源性達(dá)97%，與該屬內(nèi)其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性較低；G+C m0l%含量測(cè)定為64. 72%，屬于溶桿菌屬的范圍(62%-70. 1% )之內(nèi)，確實(shí)是溶桿菌屬的成員；與標(biāo)準(zhǔn)菌株L. daejeonensisGHl-9TDNA之間同源性均小于70% ；RB-38T脂肪酸的最主要成分是 C15:0 iso，含量 45. 5%，而 L. daejeonensis GH1_9T 的主要成分是 C16:(1 iso ;RB_38T 的醌組分為Q8，這與文獻(xiàn)中溶桿菌屬的所有菌株成分一致；RB-38T主要包括三種極性脂成分磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油和磷脂酰甘油-N-乙酰氨基葡萄糖，這與報(bào)道的溶桿菌屬的極性脂成分一致。生理生化實(shí)驗(yàn)表明，RB_38T與參比菌株L. daejeonensis GH1_9T生理生化特征相似，但個(gè)別性狀也有不同，相同性狀排述硝酸鹽還原陽性，接觸酶弱陽性，氧化酶陽性性， 產(chǎn)吲哚，不能利用L-ser，蘋果酸鹽，不能水解淀粉、尿素、DNA。不同性狀的描述1 -3爐較 GH1-9T耐受的溫度范圍較窄，但它的耐酸堿能力和耐鹽能力范圍均比GH1-9T廣，RB_38T不能利用檸檬酸鹽、醋酸鹽、而GH1-9T卻可以利用檸檬酸鹽、醋酸鹽生長(zhǎng)，RB-38T不能水解吐溫80，而GH1-9T卻與之相反。上述百菌清降解細(xì)菌的制備方法，其特征在于該制備方法按以下步驟進(jìn)行(1).試管培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，H2O IOOOmLJlC 脂20g，用lmol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0)，將該菌接種在試管培養(yǎng)基上，30 37°C 培養(yǎng)1天。(2).平板培養(yǎng)采用基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NH4NO3 1. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g， (NH4)2SO4O. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4 1. 5g, H2O lOOOmL，瓊脂 20g，用 lmol/L HCl 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0 ；加入百菌清IOOmg)，將上述試管中培養(yǎng)菌劃線接種在平板培養(yǎng)基上，于30 37°C暗培養(yǎng)2 3天，作為液體培養(yǎng)用種子。(3).液體培養(yǎng)采用加百菌清基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基=NH4NO3 1. OgjMgSO4 ·7Η20 0. 5g， (NH4)2SO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4 1. 5g, H2O lOOOmL，用 lmol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7. 0 ；加入百菌清100mg。于37 39°C，每分鐘250轉(zhuǎn)，振蕩培養(yǎng)2 3天。上述液體培養(yǎng)獲得的菌液，可直接用于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間土壤百菌清降解用液體菌劑；也可以經(jīng)過每分鐘10000轉(zhuǎn)離心30分鐘獲得固體菌劑，用于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間土壤百菌清降解。采用本發(fā)明的百菌清降解細(xì)菌及其液體或固體菌劑，用于百菌清污染土壤中百菌清的降解，可快速降解污染土壤中的百菌清，快速修復(fù)百菌清污染土壤。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 用天平稱取IOg 土樣，置于90mL無菌水中，30°C，180rpm，20min,打散土壤顆粒，制均勻土壤懸液，室溫靜置30min，取上清作為上壤原液(10°)，再用ImL無菌吸管吸取ImL上清液加入9mL無菌水中，充分搖勻后制得KT1稀釋液，依次稀釋得到10_2，10_3稀釋液。分別吸取10_3、10_4、10_5稀釋液200ul涂布到含有百菌清的固體選擇平板上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。RB-38T可產(chǎn)生透明圈。實(shí)施例2:將菌株接種于LB平板上(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg5H2O lOOOmL，瓊脂20g， 用lmol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0)，50°C培養(yǎng)18小時(shí)，進(jìn)行革蘭氏染色，以革蘭氏陰性菌E. coli為對(duì)照，顯微鏡油鏡觀察。1 -3爐菌體長(zhǎng)桿狀，經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性。實(shí)施例3:Tm值與DNA G+C mo 1 %的測(cè)定。采用熱變性溫度法來測(cè)定DNA G+C mol%,所用儀器由Lambda Bio 20型紫外分光光度計(jì)、PTP-I溫度控制儀、循環(huán)水浴和計(jì)算機(jī)組成。整個(gè)測(cè)定過程由UV Winlab軟件控制。①Tm值的測(cè)定將待測(cè)DNA樣品用0. 1 X SSC適當(dāng)稀釋，使其吸光度為0. 2 0. 5。 以Ecoil K12菌株的DNA作參比，以消除實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差。測(cè)定結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件計(jì)算出變性曲線的一階導(dǎo)數(shù)曲線，記錄一階導(dǎo)數(shù)曲線峰值所對(duì)應(yīng)的溫度，即為DNA樣品的解鏈溫度，即Tm值。②DNA G+C mol%計(jì)算如果DNA G+C mol %值在25-75%的范圍內(nèi)，其Tm值與 DNAG+C mol%之間呈線形關(guān)系。在0. 1 X SSC溶液中，G+C mol %的計(jì)算公式為DNA G+C mol%= 51.2+2. 08 [Tm (X)-Tm (R)]其中 Tm(X)為待測(cè)菌的 Tm 值；Tm (R)為大腸桿菌 K12 的 Tm值。1 -387及標(biāo)準(zhǔn)菌株 Lysobacter daejeonensis GH1_9T 的測(cè)定結(jié)果，顯示 RB_38T 菌株G+Cm0l%含量屬于溶桿菌屬的范圍(62% -70. 1% )之內(nèi)，因此RB_38T確實(shí)是溶桿菌屬的成員。表菌株的 ιι值及G+C mol%測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種微生物，其特征在于它是一種用于降解百菌清的細(xì)菌RB-38TLyscAacter ruipuensis sp. nov，其保藏登記號(hào)為=CGMCC 1. 10344τ。
2.按權(quán)利要求1所述的微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于上述降解百菌清的細(xì)菌按以下方法分離培養(yǎng)用天平稱取IOg 土樣，置于90mL無菌水中，30°C，180rpm, 20min,打散土壤顆粒，制均勻土壤懸液，室溫靜置30min，取上清作為土壤原液(10°)，再用ImL無菌吸管吸取ImL上清液加入9mL無菌水中，充分搖勻后制得KT1稀釋液，依次稀釋得到10_2，10_3稀釋液。分別吸取10_3、10_4、10_5稀釋液200ul涂布到含有百菌清的固體選擇平板上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果；挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落在LB培養(yǎng)基上多次劃線純化，獲得純培養(yǎng)的百菌清降解細(xì)菌。
3.按權(quán)利要求1或2所述的微生物的保存方法，其特征在于純化后的菌種再接于含有百菌清的篩選培養(yǎng)基上復(fù)驗(yàn)，具有降解能力的菌株劃LB斜面4°C保存或接入LB液體培養(yǎng)基，待菌體長(zhǎng)入對(duì)數(shù)期后取等量菌液與30%甘油混勻置于小離心管，-70°C保存。
4.按權(quán)利要求1或2、或3所述的微生物的制備方法，其特征在于該制備方法按以下步驟進(jìn)行(1).試管培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g, H2O lOOOmL，瓊脂 20g，用lmol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0)，將該菌接種在試管培養(yǎng)基上，30 37°C培養(yǎng) 1天。(2).平板培養(yǎng)采用基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NH4NO31. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g， (NH4)2SO4O. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4 1. 5g, H2O lOOOmL，瓊脂 20g，用 lmol/L HCl 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0 ；加入百菌清IOOmg)，將上述試管中培養(yǎng)菌劃線接種在平板培養(yǎng)基上，于30 37°C暗培養(yǎng)2 3天，作為液體培養(yǎng)用種子。(3).液體培養(yǎng)采用加百菌清基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基=NH4NO31. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g， (NH4)2SO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4 1. 5g, H2O lOOOmL，用 lmol/L HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7. 0 ；加入百菌清100mg。于37 39°C，每分鐘250轉(zhuǎn)，振蕩培養(yǎng)2 3天。上述液體培養(yǎng)獲得的菌液，可直接用于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間土壤百菌清降解用液體菌劑； 也可以經(jīng)過每分鐘10000轉(zhuǎn)離心30分鐘獲得固體菌劑，用于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間土壤百菌清降解。
5.按權(quán)利要求1或2、或3所述的微生物，其特征在于能利用百菌清作為唯一的碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng)。
6.按權(quán)利要求1或2、或3所述的微生物的應(yīng)用，其特征在于將百菌清降解細(xì)菌用于土壤中殘留百菌清農(nóng)藥的降解。
全文摘要
一種降解百菌清的細(xì)菌菌株及制備方法。本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種降解百菌清的細(xì)菌菌株及制備方法本發(fā)明提供了一種用于降解百菌清的細(xì)菌RB-38TLysobacter ruipuensis sp.nov。將該降解百菌清的細(xì)菌在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并用其制備液體菌劑或固體菌劑，用于降解土壤中殘留的百菌清。利用該菌可以修復(fù)由于百菌清殘留污染的土壤，可減少百菌清殘留引起的土壤污染。本發(fā)明的微生物來自自然土壤，對(duì)環(huán)境無害，易于生產(chǎn)，通過產(chǎn)業(yè)化和商品化開發(fā)，可為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)、人類健康等提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102373165SQ20101026303
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者任曉潔, 李世東, 繆作清, 郭榮君, 陳三鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所