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一種kck多肽修飾的金納米簇及其制備方法

文檔序號:10644639閱讀:558來源:國知局
一種kck多肽修飾的金納米簇及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于功能性生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種KCK多肽修飾的金納米簇及其制備方法,通過設(shè)計作為表面穩(wěn)定劑的多肽序列,采用簡單綠色的水熱合成法制備對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用的紅色熒光金納米簇,其粒徑范圍在1.8?2.8nm,金納米簇在500nm附近有明顯的吸收峰,當(dāng)用480nm的激發(fā)光對金納米簇進行照射時,在600?800nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射,發(fā)射峰為680nm,金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為12%,對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用。該制備方法簡單,操作性強,成本低,材料表面用多肽穩(wěn)定,避免了納米粒子的團聚,生物親和性好,毒性低,穩(wěn)定性好,發(fā)射波長,良好地?zé)晒庑?,利于得到更好的核仁成像效果,對細胞核仁有特異性?biāo)記。
【專利說明】
一種KCK多肽修飾的金納米簇及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明屬于功能性生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種KCK多肽修飾的金納米簇及其制備方法,通過設(shè)計作為表面穩(wěn)定劑的多肽序列,采用簡單綠色的水熱合成法制備對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用的紅色熒光金納米簇。
【背景技術(shù)】
:
[0002]細胞核仁是細胞核內(nèi)的重要亞核結(jié)構(gòu),對于細胞的生長、增殖都有重要作用。除此之外,核仁還是細胞核內(nèi)rRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯以及核糖體組裝的場所,因此又被稱為“核糖體工廠”,甚至有文獻報道核仁也是某些病毒的靶向攻擊位置。細胞核仁并不是一直存在的,它形成于細胞分裂間期,由熔融態(tài)的核仁物質(zhì)聚集形成,目前對于細胞核仁的生物學(xué)作用的研究尚不成熟。研究核仁及其相關(guān)過程時,非常重要的步驟是將核仁可視化,然后才能更好的得到核仁結(jié)構(gòu)數(shù)量等相關(guān)信息。目前,對于核仁的可視化方法,得到普遍認同的有①銀染法一通過AgNO3與細胞核仁處的酸性蛋白反應(yīng),實現(xiàn)銀的還原,生成黑色銀顆粒,進而對核仁位置進行標(biāo)記,缺點是在光學(xué)顯微鏡下呈黑色且無熒光信號,不利于進一步的研究使用;②商業(yè)化的STYO染料染色法在480nm激發(fā)下有500nm的熒光發(fā)射,并且染料分子與RNA結(jié)合后熒光強度會存在數(shù)量級的變化,但染料分子的結(jié)構(gòu)沒有公開報道。
[0003]近年來,隨著研究的不斷深入,對核仁特異性染色的其他材料也相應(yīng)進入人們的視線,如以稀土元素銪為配位中心構(gòu)成的稀土配合物;以吡啶,吡咯及苯等芳環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的超低分子量的熒光探針;以及由過渡金屬元素鋨、銥組成的異核雙配位化合物均可對細胞核仁進行特異性的標(biāo)記。這類材料的共同特征就是表面含有大量的芳環(huán)結(jié)構(gòu),可能是對核仁進行靶向識別的作用基團。越來越多的熒光納米材料應(yīng)用于熒光標(biāo)記領(lǐng)域,與傳統(tǒng)的化學(xué)染料相比,熒光納米材料的抗光漂白性更好,并且通過對納米材料表面進行修飾,還會使得材料的生物親和性大大提高。通過調(diào)節(jié)納米材料的尺寸可以得到發(fā)射波長較長的材料,這對降低細胞成像的背景干擾,信噪比及細胞自熒光都是有利的。
[0004]基于以上論述,設(shè)計合理有效的途徑,合成可對細胞核仁靶向標(biāo)記的納米材料是非常有必要的,它將為研究細胞核仁及其相關(guān)過程提供更好的幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

:
[0005]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,尋求一種KCK多肽修飾的靶向標(biāo)記細胞核仁的金納米簇及其制備方法,降低現(xiàn)有細胞核仁標(biāo)記材料細胞成像的背景干擾以及解決現(xiàn)有細胞核仁標(biāo)記材料制作成本高、毒性大、制作工藝復(fù)雜的問題。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的制備方法,具體工藝步驟如下:
[0007](I)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCU、1.5mol/L的Na0H、20mmol/L的三(2-甲基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、0.1mmol/L的NaBH4和20mmol/L的KCK溶液,將玻璃瓶用王水浸泡處理,清洗干凈后烘干備用;
[0008](2)分別取500yL的KCK溶液和TCEP溶液加入到處理好的玻璃瓶中,混合均勻后置于恒溫水浴鍋中加熱I Omin,再向玻璃瓶中加入500yL的HAuCl4溶液,混合均勻后再次放入恒溫水浴鍋反應(yīng)15min,然后向玻璃瓶中依次加入50yL的NaOH溶液和8yL的NaBH4溶液,攪拌均勻,可觀察到玻璃瓶中溶液顏色迅速由淡黃色變?yōu)樽厣?,最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo I/L;
[0009](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi),70°080°(:恒溫反應(yīng)1211;
[0010](4)反應(yīng)結(jié)束后,將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì),將離心上清液中剩余的未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)除去得到金納米簇;
[0011]步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾,或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KCK多肽的中文全稱為賴氨酸--半胱氨酸--賴氨酸。
[0012]本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇,粒徑范圍在1.8-2.8nm,金納米簇在500nm附近有明顯的吸收峰,當(dāng)用480nm的激發(fā)光對金納米簇進行照射時,在600_800nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射,發(fā)射峰為680nm,金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為12%,對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的制備方法簡單,操作性強,成本低,材料表面用多肽穩(wěn)定,避免了納米粒子的團聚,生物親和性好,毒性低,穩(wěn)定性好,發(fā)射波長,良好地?zé)晒庑裕诘玫礁玫暮巳食上裥Ч?,此外,合成的納米材料對細胞核仁有特異性標(biāo)記,相對于比較常規(guī)的富芳環(huán)的熒光探針,這是一種全新的材料,為核仁的研究提供了新的思路與方法。
【附圖說明】
:
[0014]圖1為本發(fā)明涉及的KCK多肽的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2為本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的透射電子顯微鏡表征圖。
[0016]圖3為本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的紫外可見吸收光譜圖。
[0017]圖4為本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的熒光發(fā)射光譜。
[0018]圖5為本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇(A)和商品化細胞核仁探針SYTORNA-SeIect(B)分別與細胞共育2小時的熒光成像效果圖。
[0019]圖6為本發(fā)明涉及的KCK多肽修飾的金納米簇與商品化SYTORNA-Select分別與細胞共育之后在激光連續(xù)照射的條件下不同采集時間點成像效果圖。
【具體實施方式】
:
[0020]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明:
[0021]實施例1:
[0022]本實施例涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的制備方法,具體工藝步驟如下:
[0023](I)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCl4、1.5mol/L的Na0H、20mmol/L的三(2-甲基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、0.1mmol/L的NaBH4和20mmol/L的KCK溶液,將玻璃瓶用王水浸泡處理,清洗干凈后烘干備用;
[0024](2)分別取500yL的KCK溶液和TCEP溶液加入到處理好的玻璃瓶中,混合均勻后置于70 °C恒溫水浴鍋中加熱1min,再向玻璃瓶中加入500yL的HAuCl4溶液,混合均勻后再次放入70°C恒溫水浴鍋反應(yīng)15min,然后將玻璃瓶從水浴中拿出,向瓶中加入磁子,在300rpm攪拌下依次加入NaOH溶液和NaBH4溶液,可觀察到玻璃瓶中溶液顏色迅速由淡黃色變?yōu)樽厣詈笙虿A恐屑尤氤兯谷芤褐蠥u+的終濃度為2mmo 1/L;
[0025](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi),70°C恒溫反應(yīng)12h;
[0026](4)反應(yīng)結(jié)束后,將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中,8000rpm離心5min后取上清液,將離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾得到金納米簇;所述KCK多肽的中文全稱為賴氨酸(Lysine,K)—半胱氨酸(Cysteine,C)—賴氨酸(Lysine,K),購買于上海強耀生物科技有限公司。
[0027]由圖1-4可知,本實施例制備得到的金納米簇顆粒分散均勻,而且粒徑分布范圍相對較窄,在1.8-2.8nm范圍內(nèi),平均顆粒直徑為2.1醒,金納米簇在500nm附近有明顯的吸收峰,當(dāng)用480nm的激發(fā)光對金納米簇進行照射時,在600-800nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射,發(fā)射峰為680nm,金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為12%,對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用。
[0028]應(yīng)用例1:
[0029]將實施例1制備的KCK修飾的金納米簇(KCK-AuNCs,400yg/ml)與人纖維肉瘤細胞(HT1080)在37 °C,CO2含量5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育2小時得到細胞爬片;將上述細胞爬片用4%多聚甲醛固定后,用共聚焦激光掃描系統(tǒng)成像,成像條件100X油鏡在405nm的激光激發(fā),信號收集通道662-737nm0
[0030]對比例1:
[0031]將商品化細胞核仁探針(SYTO RNA-Select,400yg/ml)與人纖維肉瘤細胞(HT1080)在37 °C,CO2含量5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育2小時得到細胞爬片;將上述細胞爬片用4%多聚甲醛固定后,用共聚焦激光掃描系統(tǒng)成像,成像條件100X油鏡在405nm的激光激發(fā),信號收集通道662-737nm0
[0032]圖5為金納米簇KCK-AuNCs(A)和商品化SYTO RNA-Select(B)分別與細胞共育2小時的熒光成像效果圖。圖中金納米簇與SYTO RNA-Select的細胞內(nèi)定位相同,證明熒光金納米簇KCK-AuNCs可以對細胞的核仁部位進行靶向標(biāo)記。圖6為金納米簇與商品化SYTO RNA-Select分別與細胞共育之后在激光連續(xù)照射條件下不同時間點成像效果的比較。如圖所示,在6分鐘的連續(xù)照射的成像條件下,熒光金納米簇能夠較好地維持其熒光強度,而SYTORNA-Select的強度迅速下降,說明熒光金納米簇對比SYTO RNA Select具有更好的光穩(wěn)定性。
[0033]實施例2:
[0034]本實施例涉及的KCK多肽修飾的金納米簇的制備方法,具體工藝步驟如下:
[0035](I)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCl4、1.5mol/L的Na0H、20mmol/L的三(2-甲基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、0.1mmol/L的NaBH4和20mmol/L的KCK溶液,將玻璃瓶用王水浸泡處理,清洗干凈后烘干備用;
[0036](2)分別取500yL的KCK溶液和TCEP溶液加入到處理好的玻璃瓶中,混合均勻后置于70 0C恒溫水浴鍋中加熱1min,再向玻璃瓶中加入500yL的HAuCl4溶液,混合均勻后再次放入70°C恒溫水浴鍋反應(yīng)15min,然后將玻璃瓶從水浴中拿出,向瓶中加入磁子,在300rpm攪拌下依次加入NaOH溶液和NaBH4溶液,可觀察到玻璃瓶中溶液顏色迅速由淡黃色變?yōu)樽厣?,最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L;
[0037](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi),80°C恒溫反應(yīng)12h;
[0038](4)反應(yīng)結(jié)束后,將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中,8000rpm離心5min后取上清液,將離心上清液透析處理得到金納米簇;所述KCK多肽的中文全稱為賴氨酸(Lysine,K)—半胱氨酸(Cysteine,C)—賴氨酸(Lysine,K),購買于上海強耀生物科技有限公司。
[0039]進一步地,所述步驟(4)中離心上清液也可以外加甲醇、乙醇和丙酮任一種離心沉降處理得到金納米簇。
【主權(quán)項】
1.一種KCK多肽修飾的金納米簇的制備方法,其特征在于具體工藝步驟如下: (1)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCl4、1.5mol/L的Na0H、20mmol/L的三(2-甲基乙基)膦鹽酸鹽(1^?)、0.111111101/1的他8!14和2011111101/1的1(0(溶液,將玻璃瓶用王水浸泡處理,清洗干凈后烘干備用; (2)分別取500yL的KCK溶液和TCEP溶液加入到處理好的玻璃瓶中,混合均勻后置于恒溫水浴鍋中加熱I Omin,再向玻璃瓶中加入500yL的HAuCl4溶液,混合均勻后再次放入恒溫水浴鍋反應(yīng)15min,然后向玻璃瓶中依次加入50yL的NaOH溶液和8yL的NaBH4溶液,攪拌均勻,可觀察到玻璃瓶中溶液顏色迅速由淡黃色變?yōu)樽厣?,最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L; (3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi),70°C-80°C恒溫反應(yīng)12h; (4)反應(yīng)結(jié)束后,將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì),將離心上清液中剩余的未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)除去得到金納米簇; 步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾,或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KCK多肽的中文全稱為賴氨酸一半胱氨酸一賴氨酸。2.—種權(quán)利要求1所述的方法制備的金納米簇,其特征在于金納米簇粒徑范圍在1.8-2.8nm,金納米簇在500nm附近有明顯的吸收峰,當(dāng)用480nm的激發(fā)光對金納米簇進行照射時,在600-800nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射,發(fā)射峰為680nm,金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為12%,對細胞核仁具有靶向標(biāo)記作用。
【文檔編號】C12Q1/02GK106010513SQ201610387321
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】王曉娟, 黃方, 王雅楠, 曲劍波, 何化, 王生杰
【申請人】中國石油大學(xué)(華東)
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