本發(fā)明屬于熒光檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測谷胱甘肽的熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術：

谷胱甘肽是一種具有重要生理功能的天然活性肽，它由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。谷胱甘肽在體內(nèi)以兩種形態(tài)存在，即還原型谷胱甘肽(gsh)和氧化型谷胱甘肽(gssg)，在機體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽，通常所指的谷胱甘肽也是還原型谷胱甘肽。醫(yī)學研究表明谷胱甘肽與很多疾病有關，比如腎功能衰竭、老年癡呆癥等，它們在生物體內(nèi)的含量變化可以作為這些疾病診斷的依據(jù)，開發(fā)選擇性識別谷胱甘肽的檢測方法顯得尤為重要。

目前測定活性肽含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循環(huán)法、毛細管電泳法和hplc法等，這些方法各有優(yōu)點，但也都有不足之處。

比色法是以生成有色化合物的顯色反應為基礎的，一般包括兩個步驟：首先是選擇適當?shù)娘@色試劑與待測組分反應，形成有色化合物，然后再比較或測量有色化合物的顏色深度，在此過程中，溶液的酸度、顯色劑的用量、溫度、溶劑等對顯色反應都有影響，測量的靈敏度和準確度較差；

碘量法是氧化還原滴定法中，應用比較廣泛的一種方法，但對樣品溶液的酸度和溫度反應敏感，不易操作；

酶循環(huán)法是利用酶的底物特異性來放大被測物質的測定方法，但使用的工具酶用量大，成本較高；

毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，毛細管直徑小，使光路太短，靈敏度較低，而且電滲會因樣品組成而變化，進而影響分離重現(xiàn)性；

hplc法準確性高，樣品處理簡單，但受色譜柱局限，且耗費時間很長。

而熒光探針檢測法以無損、可視化原位檢測等優(yōu)點備受研究者重視，但是能夠與谷胱甘肽特異性響應的熒光探針尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種用于檢測谷胱甘肽的熒光探針及其制備方法和應用。

本發(fā)明采用如下技術方案：

一種用于檢測谷胱甘肽的熒光探針，所述熒光探針的結構式如下：

上述用于檢測谷胱甘肽的熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺反應得到n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

(2)以銅鹽作催化劑，將步驟(1)所得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺與甲醇鈉反應得到n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

(3)將步驟(2)所得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺與濃hbr反應得到n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

(4)取步驟(3)所得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺，依次加入4-二甲氨基吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺，加入ds，反應后經(jīng)后處理即得；

ds結構如下：

優(yōu)選地，所述步驟(1)的具體合成方法如下：將摩爾比為1：1.2-6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺加入到乙醇中，氮氣保護下回流反應至反應液澄清，濃縮后冷卻析出晶體，乙醇重結晶后即得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺。

優(yōu)選地，所述步驟(2)的具體合成方法如下：取步驟(1)所得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺溶于甲醇中，然后加入甲醇鈉和硫酸銅，回流反應2-4小時，濃縮后，冷卻析出晶體，去離子水洗滌后即得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺；

n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺與甲醇鈉的摩爾比為1：8-12。

優(yōu)選地，所述步驟(3)的具體合成方法如下：將步驟(2)所得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺加入到濃hbr中，回流反應10-20小時，冷卻過濾，乙醚洗滌后即得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺。

優(yōu)選地，所述步驟(4)的具體合成方法如下：將步驟(3)所得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺溶于無水二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶和ds，0-5℃攪拌10min后，再滴加二環(huán)己基碳二亞胺的無水二氯甲烷溶液，滴加時間控制在5-15min，滴加完成后，0-5℃攪拌10-20min，然后于氮氣保護下，室溫反應10-24h，冷凍(-20℃，2h)后過濾，真空干燥得粗產(chǎn)品，將所得粗產(chǎn)品采用柱色譜分離即得所述熒光探針；

柱色譜分離所用的洗脫劑為二氯甲烷：乙酸乙酯＝400-50：1；

n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺、4-二甲氨基吡啶、ds與二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：0.05：1.2：1.2。

上述用于檢測谷胱甘肽的熒光探針的應用，用于待測樣品中谷胱甘肽含量的熒光檢測、目視定性檢測和細胞成像檢測，其中細胞成像檢測的具體操作過程為本領域所公知，本發(fā)明不再贅述。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明提供了一種用于檢測谷胱甘肽的熒光探針，其制備過程和后處理過程相對簡單，有良好的選擇性和較高的靈敏度，抗干擾能力強。此外，在待測樣品中加入本發(fā)明所述熒光探針后，用肉眼就可以觀察到溶液的顏色變化。故而，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的檢測谷胱甘肽的熒光探針，在小分子檢測領域具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述熒光探針的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明所述熒光探針的核磁氫譜圖；

圖3為本發(fā)明所述熒光探針的核磁碳譜圖；

圖4為本發(fā)明所述熒光探針的核磁質譜圖；

圖5為本發(fā)明所述熒光探針與不同氨基酸及離子反應后的熒光譜圖；

圖6為本發(fā)明所述熒光探針與不同氨基酸及離子反應后的紫外-可見吸收光譜的變化結果；

圖7為本發(fā)明所述熒光探針與不同當量的谷胱甘肽、半胱氨酸反應后的熒光光譜的變化結果；

圖8為本發(fā)明所述熒光探針與10當量的谷胱甘肽、半胱氨酸反應后的熒光強度隨時間的變化結果；

圖9為本發(fā)明所述熒光探針與不同當量的谷胱甘肽、半胱氨酸反應后的紫外-可見吸收光譜的變化結果；

圖10為本發(fā)明所述熒光探針與10當量的谷胱甘肽、半胱氨酸反應后的紫外-可見吸收光譜隨時間的變化結果；

具體實施方式

為了使本發(fā)明的技術目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術方案作出進一步的說明。

實施例1

一種用于檢測谷胱甘肽的熒光探針，其制備方法，包括以下步驟：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺反應得到n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

所述步驟(1)的具體合成方法如下：將摩爾比為1：1.2-6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐與正丁胺加入到乙醇中，氮氣保護下回流反應至反應液澄清，濃縮后冷卻析出晶體，乙醇重結晶后即得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺。

(2)以銅鹽作催化劑，將步驟(1)所得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺與甲醇鈉反應得到n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

所述步驟(2)的具體合成方法如下：取步驟(1)所得n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺溶于甲醇中，然后依次加入甲醇鈉和硫酸銅，回流反應2-4小時(此時tlc監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺已反應完全)，濃縮后，冷卻析出晶體，去離子水洗滌后即得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺；

n-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺與甲醇鈉的摩爾比為1：8-12。

(3)將步驟(2)所得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺與濃hbr反應得到n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺，其結構式如下：

所述步驟(3)的具體合成方法如下：將步驟(2)所得n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺1.5-2.5g加入到20-30ml濃hbr中，回流反應10-20小時(此時tlc監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，n-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酰亞胺已反應完全)，冷卻過濾，乙醚洗滌后即得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺。

(4)取步驟(3)所得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺，加入4-二甲氨基吡啶、ds和二環(huán)己基碳二亞胺，反應后經(jīng)后處理即得，ds結構式如下：

ds的合成方法如下：

化合物3-1的合成方法如下：

將苯并噻吩-2-硼酸(3.09g,17mmol)加入100ml的圓底燒瓶中，然后加入30ml的乙醇，在機械攪拌的條件下逐滴滴加過氧化氫(5.6ml,30％)，反應8h后，溶液的顏色由粉紅變?yōu)樯罴t，減壓蒸出乙醇，剩余物溶于100ml水中，用氯仿(每次60ml)萃取3次，有機層用mgso4干燥，并且在真空的條件下濃縮，濃縮得到的剩余物用200-300目硅膠分離得化合物3-1，分離時所用洗脫劑為體積比為9：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑。

化合物3-1：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.41-7.14(m,1h),3.95(s,1h).

化合物3-2的合成

在100ml的圓底燒瓶中，取化合物3-1(200mg)溶解在10ml四氫呋喃中，升溫至55～65℃，加入單水氫氧化鋰的水溶液，攪拌15～18小時后，冷卻至室溫，加入水和乙醚的混合溶液至反應停止，加入濃鹽酸調節(jié)ph值為1.8～2.2，分離有機層，飽和食鹽水洗滌后，無水na2so4干燥，然后減壓蒸除有機溶劑，剩余物用柱色譜分離得桔色晶體化合物3-2，分離時所用的洗脫劑為體積比為9：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑；其中，中間體3-1與單水氫氧化鋰的摩爾比為1：1.2-2。

化合物3-2：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.45-7.36(m,1h),7.23(t,j＝4.8hz,1h),7.19(dd,j＝5.6,3.6hz,2h),3.82(s,2h),3.49(s,1h).ms(m/z):166.9[m-h]-

化合物ds的合成

在100ml的圓底燒瓶中，加入2,2’-二硫二吡啶(220mg)，用30ml的二氯甲烷溶解，冷卻至0℃，在此條件下加入化合物3-2(168mg)，0℃反應10分鐘后，再室溫反應4-8小時，然后減壓蒸除有機溶劑，用200-300目硅膠分離得到白色固體化合物ds，分離時所用的洗脫劑為體積比為3：1的石油醚和丙酮的混合溶劑。

ds：1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ8.43(d,j＝5.0hz,1h),7.84–7.61(m,3h),7.27(tdd,j＝10.5,5.7,2.5hz,3h),5.51(s,2h).13cnmr(101mhz,meod)δ173.17,159.02,149.02,137.85,135.68,134.68,130.95,129.07,127.98,121.32,120.29.)

所述步驟(4)的具體合成方法如下：將步驟(3)所得n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺溶于無水二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶(dmap)和ds，0-5℃攪拌10min后，再滴加二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)的無水二氯甲烷溶液，滴加時間控制在5-15min，滴加完成后，0-5℃攪拌10-20min，然后于氮氣保護下，室溫反應10-24h，冷凍(冷凍條件為-20℃，2h)后過濾，真空干燥得粗產(chǎn)品，將所得粗產(chǎn)品采用柱色譜分離即得所述熒光探針；

柱色譜分離所用的洗脫劑為二氯甲烷：乙酸乙酯＝400-50：1；

n-正丁基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺、4-二甲氨基吡啶、ds與二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：0.05：1.2：1.2。

根據(jù)圖2至圖4的結構表征結果，可以判斷，上述制備方法得到了預期結構的熒光探針，所述熒光探針的結構式如下：

熒光檢測應用試驗

(1)試劑準備

a.熒光探針溶液(1.00×10^-3mol·l^-1)的配制：

取0.00264g(m＝528.12)實施例1所制備的熒光探針溶于5ml乙腈中，配制成濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的熒光探針溶液；

b.各種氨基酸及陰離子標準溶液的配制

各種氨基酸及陰離子的標準品均用去離子水配置成為濃度為1.00×10^-3mol·l^-1和1.00×10^-2mol·l^-1的標準溶液，所述氨基酸及陰離子列舉如下：谷胱甘肽(gsh)，半胱氨酸(cys)、no2^-、ch3coo^-、br^-、f^-、hs^-、i^-、hso3^-、so4^2-、cl^-、so3^2-；、co3^2-、hco3^-、cn^-；

其中，谷胱甘肽和半胱氨酸分別另外配制一組1.00×10^-2mol·l^-1的標準溶液；

c.pbs緩沖溶液(0.01mol·l^-1，ph＝7.4)的配制：

母液配置：0.2mol·l^-1k2hpo4溶液：稱取78gk2hpo4·12h2o溶于1000ml水中；

0.2mol·l^-1kh2po4溶液：稱取27.2gkh2po4·2h2o溶于1000ml水中；

0.2mol·l^-1pbs母液(ph＝7.4)：取19ml的0.2mol·l^-1kh2po4溶液，81ml的0.2mol·l^-1k2hpo4溶液混合，然后取50ml、0.2mol·l^-1pbs母液，加水稀釋至1000ml即可。

配置16組體積均為3ml的緩沖體系，所述緩沖體系由ph為7.4的pbs緩沖液(10mm)和占pbs緩沖液33％(體積比)的乙醇混合而成，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，并依次作以下處理：

第0組——空白對照；第1組——100μmgsh；第2組——100μmcys；第3組——100μmno2^-；第4組——100μmch3coo^-；第5組——100μmbr^-；第6組——100μmf^-；第7組——100μmhs^-；第8組——100μmi^-；第9組——100μmhso3^-；第10組——100μmso4^2-；第11組——100μmcl^-；第12組——100μmso3^2-；第13組——100μmco3^2-；第14組——100μmhco3^-；第15組——100μmcn^-；然后室溫下進行熒光光譜檢測(激發(fā)波長：450nm，發(fā)射波長：550nm，狹縫:5/5nm)，熒光檢測結果如圖5所示，可以看出，第1組和第2組的熒光強度明顯高于其余組，說明本發(fā)明所述熒光探針對谷胱甘肽和半胱氨酸存在特異響應。需要說明的是，雖然本發(fā)明所述熒光探針對谷胱甘肽和半胱氨酸均存在特異響應，但是在病變的細胞中，谷胱甘肽含量的含量要遠遠大于半胱氨酸，也就是說，半胱氨酸對谷胱甘肽的影響基本可以忽略，不少文章中也出現(xiàn)類似情況，探針本身對谷胱甘肽和半胱氨酸都有響應，但是通常認為這是一種檢測谷胱甘肽的熒光探針！

配置11組體積均為3ml的上述緩沖體系，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，并依次作以下處理：

第1組——空白對照；第2組——100μmgsh；第3組——100μmcys；第4組——100μmno2^-；第5組——100μmbr^-；第6組——100μmf^-；第7組——100μmhs^-；第8組——100μmi^-；第9組——100μmso4^2-；第10組——100μmcl^-；第11組——100μmso3^2-，然后室溫下進行紫外-可見光譜檢測，如圖6所示，可以看出，探針在加入谷胱甘肽與半胱氨酸后，紫外-可見光譜發(fā)生明顯變化，可利用紫外-可見光譜實現(xiàn)探針對含硫氨基酸尤其是谷胱甘肽的選擇性識別。

配置多組3ml緩沖體系，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，并依次加入當量梯度變化(變化范圍為0-3當量)的濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的谷胱甘肽或半胱氨酸的標準液，然后室溫下進行熒光光譜檢測(激發(fā)波長：450nm，發(fā)射波長：550nm，狹縫:5/5nm)，如圖7所示，可以看出，谷胱甘肽和半胱氨酸的變化趨勢相同，均是隨著加入當量的增加，熒光強度逐漸增強，且在一定范圍內(nèi)，熒光強度與半胱氨酸或谷胱甘肽當量存在線性關系，由此可實現(xiàn)一定范圍內(nèi)的定量檢測，具體的定量檢測方法為本領域技術人員所公知，此處不再贅述。

配置兩組3ml緩沖體系，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，然后分別加入濃度為1.00×10^-2mol·l^-1的谷胱甘肽和半胱氨酸的標準液30μl，室溫下進行熒光光譜檢測(激發(fā)波長:450nm，狹縫:5/5nm)，開始每隔10s進行熒光檢測，以后時間間隔逐漸變大，檢測結果如圖8所示，隨著檢測時間的遞增，熒光強度逐漸增強，說明探針與谷胱甘肽或者半胱氨酸有一定的響應時間，只有探針與含硫氨基酸作用一定時間后，才能釋放最強熒光，時間效應的確定將有助于其他探針響應性，選擇性的測試。

配置多組3ml緩沖體系，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，并依次加入當量梯度變化(變化范圍為0-3當量)的濃度為1.00×10^-3mol·l^-1的谷胱甘肽或半胱氨酸的標準液，然后室溫下進行紫外-可見光譜檢測，表明探針紫外-可見光譜與谷胱甘肽濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈線性變化，以此可利用紫外-可見光譜實現(xiàn)含硫氨基酸的定量分析。紫外-可見光譜如圖9所示，

同時，圖9中涵蓋了目視定性檢測結果，谷胱甘肽圖中為僅熒光探針(左)和熒光探針+谷胱甘肽(右)，半胱氨酸圖中為僅熒光探針(左)和熒光探針+半胱氨酸(右)，通過兩者的對比，可以明顯看出，熒光探針與谷胱甘肽或半胱氨酸共存時存在熒光響應，在待測樣品溶液中，加入熒光探針后，熒光檢測如能肉眼觀察到熒光，即可判定谷胱甘肽或半胱氨酸的存在。

配置兩組3ml緩沖體系，在緩沖體系中加入步驟a所配制的熒光探針溶液30μl，然后分別加入濃度為1.00×10^-2mol·l^-1的谷胱甘肽和半胱氨酸的標準液30μl，室溫下進行紫外-可見光譜檢測，開始每隔10s進行紫外-可見光譜檢測，以后時間間隔逐漸變大，檢測結果如圖10所示，確定探針與含硫氨基酸反應的時間效應，以便在其他紫外測試中保證探針與含硫氨基酸是充分反應后進行測試。

最后所應說明的是：上述實施例僅用于說明而非限制本發(fā)明的技術方案，任何對本發(fā)明進行的等同替換及不脫離本發(fā)明精神和范圍的修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明權利要求保護的范圍之內(nèi)。