本發(fā)明涉及單線態(tài)氧檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)單線態(tài)氧的化合物和包含該化合物的探針，其合成方法及在檢測(cè)單線態(tài)氧中的用途。

背景技術(shù)：

單線態(tài)氧(singletoxygen，¹o2)，與通常呼吸的穩(wěn)定基態(tài)氧分子的氧氣不同，是一種處于激發(fā)態(tài)氧分子的存在形式。與基態(tài)相比，單線態(tài)氧的化學(xué)性質(zhì)更活潑，更不穩(wěn)定，氧化性很強(qiáng)，可以導(dǎo)致各種物質(zhì)的氧化。單線態(tài)氧能夠參與多種機(jī)體生化反應(yīng)和生理過程，例如信號(hào)傳導(dǎo)、酶反應(yīng)、細(xì)胞分裂、組織過氧化、炎癥、衰老、吞噬殺菌、腫瘤和化學(xué)中毒，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多種復(fù)雜的雙重作用。一方面，單線態(tài)氧具有較強(qiáng)的毒性，可造成機(jī)體的損傷，引發(fā)衰老和各種疾病；而另一方面，它又是生物體免疫系統(tǒng)的主要?dú)⒕鷦?，還可用于癌癥的光動(dòng)力療法。

目前，在生理?xiàng)l件下的水溶液中定量檢測(cè)少量單線態(tài)氧(¹o2)存在困難，主要在于其壽命短、反應(yīng)活性高(lindig，b.a.；rodgers，m.a.j.j.phys.chem.1979，83，1683-1688；(b)schweitzer，c.；schmidt，r.chem.rev.2003，103，1685-1757)?，F(xiàn)有的單線態(tài)氧檢測(cè)的方法主要分為氣相中檢測(cè)方法(例如順磁共振技術(shù)、發(fā)射光譜、光電離技術(shù)和熱量測(cè)定等)和液相中檢測(cè)方法(例如磷光檢測(cè)法、化學(xué)捕獲吸光光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光檢測(cè)法等)。其中，磷光檢測(cè)法檢測(cè)¹o2自身淬滅在1270nm處產(chǎn)生的磷光，對(duì)生物體無侵害，選擇性高，是單線態(tài)氧檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法之一；但是，其缺陷在于¹o2發(fā)光效率低，靈敏度低，檢出信號(hào)弱，用于低濃度單線態(tài)氧檢測(cè)時(shí)存在困難(krasnovsky，a.a.，jr.biol.membr.1998，15，530-548；keszthelyi，t.；weldon，d.；andersen，t.n.；poulsen，t.d.；mikkelsen，k.v.；ogilby，p.r.photochem.photobiol.1999，70，531-539；和nonell，s.；braslavsky，s.e.methodsenzymol.2000，319，37-49)。

基于吸光度的¹o2檢測(cè)探針，例如2，5-二甲基呋喃(zepp，r.g.；wolfe，n.l.；baughman，g.l.；hollis，r.c.nature(london)1977，267，421-423)、糠醇(haag，w.r.；hoigne，j.environ.sci.technol.1986，20，341-348.)、9，10-聯(lián)苯蒽((a)steinbeck，m.j.；khan，a.u.；karnovsky，m.j.j.biol.chem.1992，267，13425-13438.(b)steinbeck，m.j.；khan，a.u.；karnovsky，m.j.j.biol.chem.1993，268，15649-15654.)和叔丁基-3，4，5-三甲基吡咯-羧酸甲酯(denham，k.；milofsky，r.e.anal.chem.1998，70，4081-4085.)，利用探針分子與¹o2反應(yīng)消耗量來檢測(cè)¹o2，該檢測(cè)法亦存在靈敏度較低的問題，因?yàn)榇朔椒ㄒ蕾囉谖舛葴y(cè)量?；瘜W(xué)發(fā)光法和熒光檢測(cè)法，優(yōu)點(diǎn)在于選擇性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快。因此，也通過將活性蒽部分摻入氧雜蒽環(huán)，來開發(fā)得到一些靈敏的¹o2熒光探針，其可以與¹o2反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的內(nèi)過氧化物，從而提供靈敏的熒光相應(yīng)。但是，9-[2-(3-羧基-9，10-二苯基)蒽基]-6-羥基-3h-呫噸-3-酮(dpaxs)和9-[2-(3-羧基-9，10-二甲基)蒽基]-6-羥基-3h-呫噸-3-酮(dmax)均對(duì)ph極為敏感，因此不適用于低ph值環(huán)境中的監(jiān)測(cè)((a)umezawa，n.；tanaka，k.；urano，y.；kikuchi，k.；higuchi，t.；nagano，t.angew.chem.，int.ed.1999，38，2899-2901.(b)tanaka，k.；miura，t.；umezawa，n.；urano，y.；kikuchi，k.；higuchi，t.；nagano，t.j.am.chem.soc.2001，123，2530-2536.)。

目前市場(chǎng)上僅有的單線態(tài)氧探針為singletoxygen(sosg)用于定量檢測(cè)磷酸緩沖液中的卟啉光敏劑(psd-007)產(chǎn)生的¹o2(flors，c.；fryer，m.j.；waring，j.；reeder，b.；bechtold，u.；mullineaux，p.m.；nonell，s.；wilson，m.t.；baker，n.r.j.exp.bot.，2006，57，1725–1734.)。近來，還出現(xiàn)了幾種基于硫富瓦烯取代的蒽陷阱和二氧雜環(huán)丁烷前體的靈敏¹o2化學(xué)發(fā)光探針((a)li，x.h.；zhang，g.x.；ma，h.m.；zhang，d.q.；li，j.；zhu，d.b.j.am.chem.soc.2004，126，11543-11548.(b)macmanus-spencer，l.a.；latch，d.e.；kroncke，k.)。但是，并未證實(shí)上述探針可用于活細(xì)胞中的¹o2檢測(cè)。

一種基于eu³⁺螯合物的磷光探針，[4'-(9-蒽基)-2，2'：6'，2”-三聯(lián)吡啶-6，6'-二基]雙(亞甲基次氮)四(乙酸)-eu³⁺(atta-eu³⁺)，也具有9-蒽基基團(tuán)作為單線態(tài)氧的反應(yīng)部分，且相對(duì)于其他活性氧(ros)對(duì)單線態(tài)氧具有很好的選擇性(m.；mcneill，k.anal.chem.2005，77，1200-1205.(c)macmanus-spencer，l.a.；mcneill，k.j.am.chem.soc.2005，127，18954-18955.)，但該探針的合成步驟繁多，耗時(shí)耗力，而且在細(xì)胞系中對(duì)單線態(tài)氧的響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(song，b.；wang，g.-l.；tan，m.-q.；yuan，j.-l.j.am.chem.soc.2006，128，13442-13450)。已經(jīng)有研究推出了一種基于羅丹明的單線態(tài)氧檢測(cè)熒光探針(yu，h.；liu，x.；wu，q.-f.；liq.；wang，s.；guo，y.chem.lett.2015，44，244–246.)，該探針在水溶液中具有良好光物理和光化學(xué)性能，且能夠在長(zhǎng)波長(zhǎng)下激發(fā)，從而令細(xì)胞損傷最小化，但該探針與單線態(tài)氧反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的倍數(shù)小于4倍。此外，該熒光探針主要在可見光范圍內(nèi)(400至700nm)，由此鑒于活細(xì)胞和組織基質(zhì)的干擾，其體內(nèi)成像應(yīng)用受限。因此，為了克服這一限制，急需設(shè)計(jì)并合成新的近紅外區(qū)域(nir)探針。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中的單線態(tài)氧檢測(cè)用熒光探針，面臨著合成困難、成本高、靈敏度低的問題。另外，對(duì)單線態(tài)氧具有高靈敏度和選擇性的熒光淬滅劑也甚為稀缺。這些缺陷都限制了¹o2探針在化學(xué)和生物系統(tǒng)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種化合物，其結(jié)構(gòu)式如下式(i)所示：

其中，r1為氫，烷基，烷氧基或芳香基；r2為羥基，胺基，烷氧基或巰基。在一些實(shí)施例中，r1可以是甲基、乙基或苯基。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供合成上述如式i所示化合物的方法，包括以下步驟：將9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧基氯與路易斯酸、甲苯和硝基苯以1：10～50：1～15：1～60的摩爾比例混合，在-10至150℃的反應(yīng)溫度下，反應(yīng)5分鐘至7天后，得到式i所示化合物。優(yōu)選地，反應(yīng)物的摩爾比例可以是1：10～30：5～10：20～40。

在一些實(shí)施例中，所述路易斯酸可以選自三氟化鋁、三氯化鋁和三溴化鋁、三氟化硼、三氯化硼、四氯化鈦、四氯化鋯或其組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該路易斯酸是三氯化鋁。反應(yīng)溫度可介于-10℃至150℃之間，優(yōu)選為-10～80℃，更優(yōu)選為-10～50℃，更優(yōu)選為-10～35℃。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，反應(yīng)溫度為室溫。反應(yīng)時(shí)間可以在5分鐘至7天之間，優(yōu)選為1～5天。

在一些實(shí)施例中，令9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧酸與氯化劑(氯化亞砜)反應(yīng)，以得到上述9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二酰氯。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供一種用于檢測(cè)單線態(tài)氧的熒光探針，其由上述式i化合物和熒光基團(tuán)化學(xué)連接形成，例如上述式i化合物和熒光基團(tuán)通過共價(jià)鍵連接。其中，所述熒光基團(tuán)可以是任何可以與式i化合物形成連接的適合熒光物質(zhì)，例如熒光素、羅丹明b等等。

在一些實(shí)施例中，上述熒光探針如下式ii所示：

其中fl為熒光基團(tuán)，x為可以連接所述熒光基團(tuán)和式i化合物的任何基團(tuán)。

優(yōu)選地，所述x選自o，nh，s或n(ch2ch2)2n。

在一些實(shí)施例中，所述r為甲基，x選自n(ch2ch2)2n，且所述fl的結(jié)構(gòu)為氟硼二吡咯的衍生物，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)如下式iia所示：

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供如式i所示化合物的胺衍生物與含氯熒光活性基團(tuán)反應(yīng)生成上述熒光探針的方法。

在一些實(shí)施例中，所示如式i所示化合物的胺衍生物的制備步驟如下：在含有偶聯(lián)劑和堿的有機(jī)溶劑中，令所述如式i所示化合物與胺化合物接觸。優(yōu)選地，所述的化合物的胺衍生物為如式ii所示的哌嗪衍生物，所述哌嗪衍生物與含氯熒光活性基團(tuán)按1：0.1～10的比例，在-5～50℃，反應(yīng)30分鐘到24小時(shí)(優(yōu)選為1～10小時(shí)，更優(yōu)選為2～8小時(shí))，得到熒光探針。優(yōu)選地，所述堿為有機(jī)胺或碳酸鹽。所述有機(jī)胺例如但不限于，三乙胺、二異丙胺、三丁胺、4-(n，n-二甲氨基)吡啶或其組合。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)劑選自二環(huán)己基碳二亞胺(dcci)、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)、2-(6-氯-1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n'，n'-四甲基銨六氟磷酸鹽(hctu)或其組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，選用hbtu作為偶聯(lián)試劑。

優(yōu)選地，所述含氯熒光活性基團(tuán)為氟硼二吡咯的衍生物，其結(jié)構(gòu)如下所示：

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供一種制備二甲基同核二蒽酮(dimethylhomoecoerdianthrone，hocd，即下文所述化合物2)的方法，包括以下步驟：在-10℃至150℃下(優(yōu)選為0～100℃，更優(yōu)選為0～50℃，更優(yōu)選為0～35℃)，令如式i所示化合物與過量濃酸反應(yīng)15分鐘到2小時(shí)。

在一些實(shí)施例中，所述濃酸可以選自鹽酸、硫酸、硝酸、四氟硼酸、磷酸、三氟乙酸、三鹵化鋁、氫溴酸、氫氟酸或其組合。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供一種用于檢測(cè)單線態(tài)氧的熒光探針，其是包含二甲基同核二蒽酮和熒光基團(tuán)的化合物，可以是hocd與熒光基團(tuán)共價(jià)連接的化合物。其中，所述熒光基團(tuán)可以是任何可以與式i化合物形成連接的適合熒光物質(zhì)，例如熒光素、羅丹明b等等。

在一些實(shí)施例中，所述由hocd與熒光基團(tuán)反應(yīng)生成的熒光探針如下式iii所示:

iii,iiia(r＝ch3)

其中r為氫、烷基或芳香基。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供制備所述由hocd與熒光基團(tuán)反應(yīng)生成的熒光探針的方法，包括以下步驟：在堿的存在下，令二甲基同核二蒽酮磺酰氯(hocd-so2cl，即下文所述化合物6)與胺功能化熒光基團(tuán)(例如但不限于，羅丹明b基哌嗪，即下文所述化合物7)接觸，反應(yīng)生成由兩個(gè)發(fā)色團(tuán)組成的單線態(tài)氧探針，其中hocd和熒光團(tuán)可以通過共價(jià)鍵連接，hocd在探針中可以起到熒光猝滅劑和單線態(tài)氧的反應(yīng)中心的作用。

在一些實(shí)施例中，可選地，hocd-so2cl可以是令化合物2(hocd)與氯磺酸接觸反應(yīng)生成的。

在一些實(shí)施例中，所述堿可以選自有機(jī)胺和碳酸鹽。優(yōu)選地，所述有機(jī)胺選自三乙胺，二異丙胺或其組合。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供用于令上述任一種單線態(tài)氧探針得到熒光增強(qiáng)的方法，包括：在光敏劑的存在下和光線影響下，令所述單線態(tài)氧探針與氧分子接觸。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供根據(jù)上述方法所得的熒光增強(qiáng)的單線態(tài)氧探針。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供使用上述任一種單線態(tài)氧探針或熒光增強(qiáng)的單線態(tài)氧探針在生物系統(tǒng)中進(jìn)行單線態(tài)氧檢測(cè)的方法，包括以下步驟：使細(xì)胞與含有單線態(tài)氧探針的陽(yáng)離子脂質(zhì)體接觸；培養(yǎng)細(xì)胞，以允許探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；洗滌細(xì)胞(例如但不限于，用緩沖液洗滌)；用活化劑處理細(xì)胞，以觸發(fā)內(nèi)源性單線態(tài)氧的產(chǎn)生；在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。優(yōu)選地，所述活化劑為佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(pma)。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供上述任一種單線態(tài)氧探針或熒光增強(qiáng)的單線態(tài)氧探針在環(huán)境或生物系統(tǒng)中進(jìn)行單線態(tài)氧檢測(cè)的用途。

在本發(fā)明的又一些方面中，還提供式i所述化合物或hocd化合物用于制備單線態(tài)氧探針的用途，及其作為化學(xué)系統(tǒng)中檢測(cè)單線態(tài)氧的熒光淬滅劑和/或單線態(tài)氧反應(yīng)中心的用途。

在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供用于檢測(cè)單線態(tài)氧的試劑盒，包含根據(jù)上述單線態(tài)氧探針或熒光增強(qiáng)的單線態(tài)氧探針或其組合。

二甲基同核二蒽醌(hocd)最早由scholl研究團(tuán)隊(duì)在1934年合成(scholl，r.；meyer，k.justusliebigsann.chem.1934，512，112–124)，但產(chǎn)率很低，此外該化合物也沒有被進(jìn)行結(jié)構(gòu)性質(zhì)或用途研究。本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該亮藍(lán)色化合物具有非常廣域的可見吸收光譜(500至700nm)，且易于與¹o2反應(yīng)形成內(nèi)過氧化物而脫色。本申請(qǐng)的發(fā)明人通過制備具有水溶性和功能性更好并具有近紅外吸光度的hocd衍生物，提供了用hocd結(jié)合不同有機(jī)熒光染料和量子點(diǎn)作為光學(xué)探針，從而檢測(cè)單線態(tài)氧。由于hocd對(duì)單線態(tài)氧有高度選擇性反應(yīng)，與hocd部分反應(yīng)后，探針熒光增強(qiáng)，使得所述探針對(duì)單線態(tài)氧表現(xiàn)出良好反應(yīng)。另外，hocd紫外吸收光譜寬，所以可以與有著不同發(fā)射峰波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)結(jié)合設(shè)計(jì)出不同檢測(cè)波長(zhǎng)的單線態(tài)氧高選擇性探針。

本發(fā)明提供的上述熒光探針，對(duì)單線態(tài)氧具有高靈敏度和選擇性，大大擴(kuò)展了此類熒光探針的應(yīng)用范圍，例如可用于環(huán)境、化學(xué)食品和生物醫(yī)療領(lǐng)域中的單線態(tài)氧檢測(cè)。尤其是，實(shí)現(xiàn)了生物系統(tǒng)中特別是活細(xì)胞內(nèi)的單線態(tài)氧活動(dòng)的成像。該探針可用于分子探針制作，單線態(tài)氧和疾病光能療法研究，以及單線態(tài)氧試劑盒制作。另外，本發(fā)明提供的熒光探針和相關(guān)化合物的合成方法，相比于現(xiàn)有熒光探針合成方法大大簡(jiǎn)化，因此降低了合成成本。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，合成式i所示化合物(化合物1)和hocd(化合物2)的方法步驟流程示意圖。

圖2所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，合成式i化合物的哌嗪衍生物(化合物5)和單線態(tài)氧式iia探針的步驟流程示意圖。

圖3所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，合成單線態(tài)氧式iiia探針的步驟流程示意圖。

圖4所示為室溫下dmf中的式iia單線態(tài)氧探針(1μm)與¹o2反應(yīng)前后的熒光發(fā)射圖譜(λex＝400nm)，其中¹o2由光激發(fā)光敏劑(玫瑰紅)15分鐘產(chǎn)生。

圖5所示為室溫下dmf中的式iiia單線態(tài)氧探針(0.1μm)與¹o2前后的熒光發(fā)射圖譜(λex＝480nm)，其中¹o2由光激發(fā)光敏劑(玫瑰紅)10分鐘產(chǎn)生。

圖6所示為室溫下10mmpbs緩沖液(ph7.4)中通過20當(dāng)量dotap遞送的式iiia單線態(tài)氧探針(1.0μm)在與¹o2反應(yīng)前后的熒光發(fā)射圖譜(λex＝480nm)，其中¹o2由光激發(fā)光敏劑(玫瑰紅)10分鐘產(chǎn)生。

圖7所示為室溫下10mmpbs緩沖液(ph7.4)中通過20當(dāng)量dotap遞送的式iiia單線態(tài)氧探針(0.1μm)對(duì)常見的活性氧物種(10μm)：次氯酸根(clo^-)；過氧化氫(h2o2)，超氧化物自由基(o2^.-)；羥基自由基(oh)和抗氧化劑維生素c(vc)、谷胱甘肽(gsh)(1000當(dāng)量，0.1mm)的選擇性研究，(λex＝480nm)，其中¹o2由光激發(fā)光敏劑(玫瑰紅)15分鐘產(chǎn)生。

圖8所示為使用式iiia單線態(tài)氧探針在raw264.7細(xì)胞中的進(jìn)行單線態(tài)氧的共聚焦顯微鏡成像；(a)未經(jīng)pma處理的細(xì)胞的白視場(chǎng)像；(b)未經(jīng)pma處理的細(xì)胞的熒光圖像；(c)8a與8b的重疊圖像；(d)經(jīng)pma(8μm)處理的細(xì)胞的白視場(chǎng)像；(e)經(jīng)pma激活的細(xì)胞的熒光圖像；(f)8d與8e的重疊圖像。

圖9所示為使用式iia單線態(tài)氧探針在raw264.7細(xì)胞中的進(jìn)行單線態(tài)氧的共聚焦顯微鏡成像；(a)未經(jīng)pma處理的細(xì)胞的白視場(chǎng)像；(b)經(jīng)pma(10μm)處理的細(xì)胞的白視場(chǎng)像；(c)經(jīng)組氨酸(1mm)預(yù)處理后再用pma(10μm)處理的細(xì)胞的白視場(chǎng)像(d)未經(jīng)pma處理的細(xì)胞的熒光圖像；(e)經(jīng)pma激活的細(xì)胞的熒光圖像；(f)經(jīng)組氨酸(1mm)預(yù)處理后再用pma(10μm)處理的細(xì)胞的熒光圖像。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：式i探針的合成

如圖1所示，以9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧基氯(例如，如casno.6937-78-6所示)為原料，制備合成式i化合物。可選地，為了得到9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧基氯，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可以使用商購(gòu)的或合成的9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧酸(例如，casno.54292-11-4),令其與氯化劑(例如氯化亞砜)進(jìn)行氯化反應(yīng)。

例如，可以先合成9，10-二氧-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧酸：以濃硫酸(45.9ml)和去離子水(15.7ml)混合溶液制備1，4-二甲基蒽醌(1.3g，5.51mmol)懸濁液，在80℃下邊攪拌邊分批加入活性mno2(6.88g，79.1mmol)。15分鐘后，加熱到110℃并保持4小時(shí)。然后，待反應(yīng)混合物冷卻后，緩慢地將其倒入冷水中。分離所得固體，將其溶解在稀氨水溶液中并過濾。向?yàn)V液中加入鹽酸，分離得到0.641g淡黃色固體9，10-二氧-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧酸，產(chǎn)率為57％。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，dmso-d6)：δ＝13.41(br，2h)，8.17-8.14(m，2h)，7.94-7.91(m，2h)，7.87(s，2h)ppm；

¹³cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ＝181.56，169.86，136.83，134.86，132.70，132.32，129.90，126.83ppm；

c16h7o6[m-h]^-hresi-msm/z計(jì)算值：295.0248；測(cè)定值：295.0247。

然后，取合成所得的9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二羧酸(0.4g，1.35mmol)，與4ml氯化亞砜混合并回流3小時(shí)，由此得到9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二酰氯，減壓蒸餾除去過量氯化亞砜，殘余物可以不經(jīng)純化直接用于下一步驟。

在0℃下，取10當(dāng)量的alcl3，同1ml甲苯和4ml硝基苯一起添加到9，10-二氧代-9，10-二氫化蒽-1，4-二酰氯中，在氬氣(ar)環(huán)境下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后將溫度提升至室溫，攪拌3天。反應(yīng)完畢后，在0℃下，向反應(yīng)物中添加冷水(10ml)，并攪拌15分鐘，然后以有機(jī)溶劑(例如ch2cl2)萃取。濃縮有機(jī)相，并添加大量非極性有機(jī)溶劑(例如己烷)，過濾棕色沉淀，并以熱乙酸乙酯重結(jié)晶純化兩次，得到0.51g紅色的化合物i(其中r1為甲基，r2為羥基)，產(chǎn)率為90％。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用其他方法純化該反應(yīng)的產(chǎn)物，例如柱色譜法。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cdcl3/cd3od＝5：1)：δ＝8.69(d，j＝9.0hz，1h)，8.56(d，j＝9.0hz，1h)，8.25(d，j＝9.0hz，1h)，8.18(s，1h)，7.73(d，j＝9.0hz，1h)，7.65(d，j＝9.0hz，1h)，7.49-7.44(m，2h)，7.33(d，j＝9.0hz，1h)，7.26-7.18(m，4h)，2.45(s，3h)，2.39(s，3h)ppm；

¹³c{¹h}nmr(75mhz，dmso-d6)：δ＝183.05，169.60，138.23，137.37，134.35，133.97，132.47，132.26，131.24，130.54，128.24，127.58，127.40，127.28，126.58，125.10，21.16，20.77ppm；

c30h19o3[m-h]^-hresi-ms：m/z計(jì)算值：427.1340；測(cè)定值：427.1333。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，在合成期間將式i中的r1由甲基取代為氫，其他烷基或烷芳基，例如乙基或苯基，所述取代過程屬于現(xiàn)有技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，為簡(jiǎn)要起見，在此不做詳細(xì)累述。

實(shí)施例2：式i化合物的哌嗪衍生物合成

如圖2所示，制備式i化合物的哌嗪衍生物。例如，取哌嗪(5.31mg，0.062mmol)溶于干燥二氯甲烷(dcm)(6ml)中，然后加入苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)34.3mg，0.091mmol)，n，n-二異丙基乙基胺(dipea)(31μl，0.184mmol)后，與化合物1(34mg，0.062mmol)在室溫下攪拌過夜，即得式(i)化合物的哌嗪衍生物(即化合物5)的粗產(chǎn)物?？梢詫?duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別用hcl(1m，10ml)和nahco3水溶液(2x10ml)洗滌反應(yīng)混合物。收集有機(jī)相并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。通過硅膠柱層析(洗脫液：ch2cl2/meoh，v/v＝97：3))純化粗產(chǎn)物，得到純凈的紫色式(i)化合物的哌嗪衍生物(其中r1為甲基，r2為n(ch2ch2)2nh，即化合物5)(27.4mg，產(chǎn)率：89％)。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝8.76(d，j＝9hz，1h)，8.68(d，j＝9hz，1h)，8.31(d，j＝6hz，2h)，7.57-7.49(m，5h)，7.40-7.35(m，3h)，7.11(d，j＝6hz，1h)，3.94(d，j＝12h，1h)，3.26(d，j＝12h，1h)，2.98-2.67(m，5h)，2.56(s，3h)，2.50(s，3h)，2.32(t，j＝12h，1h)ppm；

¹³cnmr(126mhz，cdcl3)δ＝184.72，168.67，139.35，138.39，138.26，135.00，134.34，133.66，133.62，133.56，132.15，130.75，129.65，129.21，128.82，128.23，128.14，127.59，127.14，126.66，126.14，126.06，125.79，125.64，47.96，45.39，41.28，21.55，21.37ppm；

c34h29n2o2[m]⁺hresi-ms計(jì)算值：497.2224；測(cè)定值：497.2225。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，在合成期間將式ii中的r由甲基取代為氫，其他烷基或烷芳基，例如乙基或苯基，所述取代過程屬于現(xiàn)有技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，為簡(jiǎn)要起見，在此不做詳細(xì)累述。

實(shí)施例3：式iia單線態(tài)氧探針的合成

如圖2所示，根據(jù)以下步驟，合成式iia單線態(tài)氧熒光檢測(cè)探針。

化合物3的合成：根據(jù)sunaharaetal.2007(sunahara，h.；urano，y.；kojima，h.；nagano，t.j.am.chem.soc.2007，129，5597-5604)中的記載，制備化合物3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2中的化合物3所示。

化合物4的合成：向化合物3(35mg，0.10mmol)的無水二氯甲烷(8ml)溶液中加入氯乙酰氯(30μl，0.41mmol，溶于1ml二氯甲烷中)和三乙胺(30μl，0.215mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后分別用nahco3水溶液(3x10ml)和去離子水(3x10ml)洗滌反應(yīng)混合液。收集有機(jī)相并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，然后不經(jīng)純化就進(jìn)一步用于下一步驟。所得為純凈橙色化合物4(37.6mg，產(chǎn)率為88％),其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2中的化合物4所示，且產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cdcl3)：δ＝8.39(d，j＝9，2h)，7.55-7.49(m，1h)，7.30(d，j＝9，1h)，6.02(s，2h)，4.03(s，2h)，2.57(s，6h)，1.43(s，6h)ppm；

¹³cnmr(300mhz，cdcl3)：δ＝164.27，157.09，143.10，134.53，134.53，130.60，128.90，125.82，125.05，121.95，121.34，43.11，29.82，14.85，13.96ppm；

c21h21bclf2n3ona⁺[m+na⁺]hrms(esi)：m/z計(jì)算值：438.1330；測(cè)定值：438.1341。

式iia探針的合成：向化合物4(7.47mg，0.018mmol)的無水乙腈(5ml)溶液中，加入化合物5(9mg，0.018mmol)，ki(6mg，0.036mmol)和k2co3(25.04mg，0.181mm)。在氬氣環(huán)境下以60-100攝氏度回流反應(yīng)混合物5小時(shí)，即得式iia探針粗產(chǎn)物。為了純化產(chǎn)物，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)溶劑，將殘余物溶解在二氯甲烷中，用水洗滌直到水相的ph達(dá)到中性，然后蒸發(fā)干燥有機(jī)相，通過硅膠柱層析法(洗脫液：chcl3/hexanes，v/v＝3：2)純化所得固體，得到純凈紅色式iia探針(27.4mg，產(chǎn)率：53％)。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cdcl3)：δ＝9.17(s，1h)，8.77-8.72(m，2h)，8.33(d，j＝9，2h)，7.63-7.47(m，7h)，7.37(d，j＝6，1h)，7.31(d，j＝6，2h)，7.19(d，j＝9，1h)，5.98(s，1h)，5.95(s，1h)，3.30-3.06(m，3h)，2.96(s，2h)，2.57(s，1h)，2.47(s，1h)，2.41-2.40)m，3h)，2.13(s，2h)，1.42(s，3h)，1.40(s，3h)ppm.c55h48bfn5o3^-[m-f^-]esi-ms,m/z計(jì)算值：856.4；測(cè)定值：856.4。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，在合成期間將式ii中的r由甲基取代為氫，其他烷基或烷芳基，例如乙基或苯基，所述取代過程屬于現(xiàn)有技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，為簡(jiǎn)要起見，在此不做詳細(xì)累述。

實(shí)施例4：hocd(化合物2)的合成

將1(72mg，0.17mmol)添加到5ml濃硫酸中，室溫下攪拌1小時(shí)，然后加入10ml冰水以停止反應(yīng)，形成藍(lán)色沉淀，即化合物2；過濾、去離子水洗滌并晾干，然后通過硅膠柱層析(chcl3)純化該藍(lán)色粗產(chǎn)物，得到純凈的hocd(48mg，產(chǎn)率70％)。產(chǎn)物表征如下：¹hnmr(300mhz，cdcl3)，δ＝8.79(s，2h)，8.73(d，j＝6hz，2h)，8.28(s，2h)，8.25(d，j＝6hz，2h)，7.59-7.56(m，4h)，2.55(s，6h)ppm；

¹³cnmr(75mhz，cdcl3)，δ＝184.73，139.09，134.67，133.96，132.06，131.62，131.58，130.21，129.10，128.66，127.71，127.38，125.29，21.45ppm；

c30h18o2[m]⁺hrei-ms計(jì)算值：410.1307；測(cè)定值：410.1294。

實(shí)施例5：式iiia單線態(tài)氧探針(即式iii中r為甲基的情況)的合成

如圖3所示，根據(jù)以下步驟，合成式iiia單線態(tài)氧熒光檢測(cè)探針。

羅丹明b基哌嗪(rb，即化合物7)的合成：根據(jù)sunaharaetal.2007(beija，m.；afonso，c.a.m.；farinha，j.p.s.；charreyre，m.t.；martinho，j.m.g.polymer2011，52，5933-5946)中的記載，制備化合物7。

hocd-so2cl(即化合物6)的合成：室溫下將hocd(26mg，0.06mmol)加入氯磺酸(1ml)中，反應(yīng)混合物呈紅棕色，攪拌2天后，將反應(yīng)混合物緩慢倒入加冰的水中，得到墨水藍(lán)色溶液。用ch2cl2萃取2次，然后合并ch2cl2層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析法(洗脫液：氯仿/己烷，v/v＝1：1)純化，得到墨水藍(lán)色純凈磺酰氯產(chǎn)物6(23mg，產(chǎn)率74％)。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cd2cl2)：δ＝9.34(d，j＝3hz，1h)，8.86(d，j＝9hz，1h)，8.70(d，j＝9.0hz，1h)，8.66(d，j＝9hz，1h)，8.22(s，1h)，8.21(s，1h)，8.09(d，j＝9hz，1h)，8.02(d，j＝9hz，1h)，7.97(dd，j＝9，3hz，1h)ppm，7.66(d，j＝9hz，1h)，7.60(d，j＝9.0hz，1h)，2.56(s，3h)，2.55(s，3h)ppm；

¹³cnmr(75mhz，cdcl3)：δ＝182.94，182.91，142.05，140.67，140.15，134.57，134.14，132.93，132.58，131.40，131.34，130.80，130.70，130.63，130.00，129.78，129.64，129.54，129.39，129.26，129.17，128.88，128.39，128.09，126.22，125.36，121.68，21.45ppm；

c30h17clo4s[m^·]^-(低響應(yīng))hresi-msm/z計(jì)算值：508.0542；測(cè)定值：508.0545；c30h17o5s[m-h]^-(6的磺酸，高響應(yīng))計(jì)算值：489.0802；測(cè)定值：489.0808。

式iiia探針的合成：取化合物6(9.2mg，0.018mmol)溶于干燥dcm(5ml)中，然后加入三乙胺(triethylamine，tea)(3μl，0.022mmol)，氬氣環(huán)境下攪拌15分鐘，然后加入化合物7(10.2mg，0.020mmol)。繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，即得式iiia探針粗產(chǎn)物，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。通過堿性氧化鋁柱層析(洗脫液：氯仿)純化粗產(chǎn)物，得到純凈的紫色式iii探針(11.65mg，產(chǎn)率：66％)。產(chǎn)物表征如下：

¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝9.08(s，1h)，8.79-8.73(m，3h)，8.23(s，2h)，8.17(d，j＝9hz，1h)，8.04(d，j＝6hz，1h)，7.78(d，j＝9hz，1h)，7.62(s，4h)，7.45(s，1h)，6.92(d，j＝6hz，2h)，3.52(t，j＝6，14h)，3.26-3.14(m，5h)，2.54(s，3h)，2.53(s，3h)，1.25(m，與脂峰重疊，12h)ppm；

¹³cnmr(126mhz，cdcl3)δ＝183.71，183.67，168.02，157.79，156.24，155.76，134.91，134.71，132.28，131.48，131.46，130.36，129.20，114.33，113.87，96.23，46.09，29.81，21.43，12.67，8.79ppm；

c62h55n4o6s[m]⁺hresi-ms計(jì)算值：983.3837；測(cè)定值：983.3834。

實(shí)施例6：式iia探針和式iiia探針對(duì)光敏作用產(chǎn)生的單線態(tài)氧的響應(yīng)

分別取光敏劑玫瑰紅(2μl，0.5mg/ml，溶于10mmpbs緩沖液，ph＝7.4)儲(chǔ)藏液，加入式iia探針或式iiia探針溶液(3ml，1μm)中并混合。將溶液暴露在纖維照明器的光線下數(shù)分鐘，并用熒光計(jì)記錄熒光強(qiáng)度變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖4-6中所示。

從圖4可以看出來，在室溫下dmf中濃度為1μm式iia探針與單線態(tài)氧反應(yīng)后熒光激發(fā)譜強(qiáng)度增強(qiáng)了4倍。。

如圖3所示，以哌嗪為鏈接基團(tuán)，將有強(qiáng)熒光性的羅丹明b和可以與單線態(tài)氧反應(yīng)生成內(nèi)過氧化物的hocd衍生物相連，設(shè)計(jì)合成了式iiia探針。式iiia探針不具備熒光，其與單線態(tài)氧反應(yīng)后，羅丹明b部分與hocd部分之間的能量傳遞過程被阻斷，探針的熒光恢復(fù)。在dmf溶液中，濃度為0.1μm的式iiia探針與單線態(tài)氧反應(yīng)后，熒光激發(fā)譜強(qiáng)度高達(dá)60倍(圖5)。

在模擬生物生理環(huán)境的pbs緩沖液中，濃度為0.1μm的式iiia探針與單線態(tài)氧反應(yīng)后熒光激發(fā)譜強(qiáng)度了19倍(圖6)，與有機(jī)溶劑dmf中測(cè)到的結(jié)果相比降低了許多，我們認(rèn)為這是由溶劑效應(yīng)和探針溶解度所致。但是與目前報(bào)道的其他檢測(cè)單線態(tài)氧探針性能相比，本發(fā)明的探針?biāo)铦舛鹊?0.1μm)，但是與單線態(tài)氧反應(yīng)后熒光增強(qiáng)倍數(shù)卻提高很多，說明本發(fā)明的探針具有極高靈敏性。

同時(shí)測(cè)試了式iiia探針對(duì)常見的活性氧物種(reactiveoxygenspecies，ros)、抗氧化劑和單線態(tài)氧的選擇性，探針濃度是0.1μm，活性氧物種(10當(dāng)量，10μm)：clo^-；h2o2，o2^.-；^.oh，抗氧化劑維生素c(vc)和谷胱甘肽(gsh)(1000當(dāng)量，0.1mm)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。圖7為探針與各檢測(cè)物種反應(yīng)后熒光強(qiáng)度變化圖，從圖7可見與單線態(tài)氧相比，其他活性氧物種和抗氧化劑對(duì)探針響應(yīng)很小，說明式iiia探針對(duì)單線態(tài)氧具有高選擇性。

實(shí)施例7：式iia探針和式iiia探針對(duì)細(xì)胞株中的單線態(tài)氧活動(dòng)成像

將式iia探針或式iiia探針(64μl，1mg/ml)溶于氯仿中，然后加入20當(dāng)量的dotap(n-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化銨)的氯仿溶液(52.6μl，25mg/ml)，混合均勻后，通過氬氣氣流完全除去氯仿，得到探針-dotap膜。向該膜加水(1.0ml)，所得混合物超聲處理15分鐘，得到式iia探針-dotap和式iiia-dotap探針脂質(zhì)體的儲(chǔ)藏液(探針和dotap的最終濃度分別是50μm和1.0mm)，然后用達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(dmem，dulbecco'smodifiedeagle'smedium)稀釋到探針檢測(cè)濃度(5μm)并用于細(xì)胞成像。

將10毫米的細(xì)胞培養(yǎng)片中raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)液離心后剩余的顆粒溶解在1毫升新鮮的dmem中，然后涂布在分隔為小室的蓋玻片(用于式iia探針和式iiia探針的每孔細(xì)胞分別是1x10⁴和6x10³)，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，接著用pbs洗滌細(xì)胞三次后加入佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(pma，式iia探針加10μm，式iiia探針加8μm)，30分鐘后再用pbs洗滌一次并加入檢測(cè)濃度探針(5μm)的脂質(zhì)體，30分鐘后再用pbs洗去分隔孔中過量的探針-脂質(zhì)體后接著加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。未用pma刺激的細(xì)胞作為細(xì)胞形態(tài)變化對(duì)照體，未用探針處理的細(xì)胞被用做探針檢測(cè)單線態(tài)氧的空白實(shí)驗(yàn)。式iia探針用組氨酸處理30分鐘后又加pma并刺激。用共聚焦顯微鏡二維成像(olympusix81，fluoviewfv1000)以上處理后的細(xì)胞，式iia探針的激發(fā)波長(zhǎng)是405納米，熒光圖像選擇過濾片是520納米。式iiia探針的激發(fā)波長(zhǎng)是480納米，熒光圖像選擇過濾片是540納米。熒光圖像用imaris3.0(bitplaneag)軟件處理。細(xì)胞熒光成像圖如圖8，9所示。

pma刺激探針處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度(8e,9e)明顯高于只用探針處理的細(xì)胞(8b,9d)，這證明了在細(xì)胞中pma刺激后可以產(chǎn)生單線態(tài)氧。細(xì)胞核薄膜周圍熒光增強(qiáng)闡明了單線態(tài)氧產(chǎn)生于線粒體。8f和8c對(duì)照可以證明pma刺激和探針處理的細(xì)胞形態(tài)并沒有被影響。式iia探針處理后的細(xì)胞先用組氨酸預(yù)處理再進(jìn)行pma處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本和只用探針處理的對(duì)照體細(xì)胞熒光響度相同(9f)，這表明組氨酸可以抑制pma刺激細(xì)胞產(chǎn)生單線態(tài)氧。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。