本發(fā)明涉及一種線粒體熒光探針及應(yīng)用，尤其涉及一種線粒體靶向比率型次氯酸熒光探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

活性氧物種(ROS)是一類重要的信號分子，能調(diào)控多種細胞活動。ROS種類很多，如次氯酸(HOCl)、過氧化氫(H₂O₂)、單線態(tài)氧(¹O₂)等。生物體內(nèi)的次氯酸是過氧化氫與氯離子在髓過氧化物酶(MPO)的催化作用下產(chǎn)生的。免疫系統(tǒng)中，次氯酸能夠?qū)ξ⑸锏娜肭制鸬揭欢ǖ姆烙饔?。但是，若體內(nèi)次氯酸水平過量，容易導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化甚至癌癥等疾病[O’Brien,P.J.,Chem.-Biol.Interact.2000,129,113-139；Pattison,D.I.et al,Biochemistry 2006,45,8152-8162]。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的重要部位，由于線粒體內(nèi)的次氯酸水平與細胞內(nèi)氧化還原平衡密切相關(guān)，因此檢測線粒體內(nèi)次氯酸的濃度變化至關(guān)重要[Hou,J.T.et al,Chem.Commun.2015,51,6781-6784]。

目前多種分析方法已被用于次氯酸的檢測，其中熒光探針因靈敏度高、選擇性好、檢測限低、對生物體損傷小等特點而受到廣泛關(guān)注并得到了長足的發(fā)展。檢索發(fā)現(xiàn)，有關(guān)線粒體靶向定位的比率型次氯酸熒光探針的報道很少[Hou,J.T.et al,Chem.Commun.2015,51,6781-6784；Xiao,H.D.et al,J.Mater.Chem.B 2015,3,1633-1638]，而應(yīng)用于線粒體內(nèi)次氯酸濃度的測定更是鮮見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種線粒體靶向比率型次氯酸熒光探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針，其特征是：所述熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如(I)所示，

構(gòu)建比率型熒光探針的常用策略是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，F(xiàn)RET型熒光探針能減少測量誤差，提高結(jié)果的準確性。為減少測量誤差，本發(fā)明采取比率測量的手段，即計算兩個最大發(fā)射波長處熒光強度的比值，該比值與次氯酸濃度成線性關(guān)系，從而實現(xiàn)次氯酸的精確測定。

本申請中發(fā)明人設(shè)計以香豆素?zé)晒鈭F作為能量供體，羅丹明熒光團作為能量受體，很好地協(xié)調(diào)了能量傳遞效率與兩個發(fā)射峰距離。雙酰肼結(jié)構(gòu)為響應(yīng)基團，吡啶鹽正離子為線粒體靶向基團，基于FRET機理構(gòu)建了比率型熒光探針，并應(yīng)用于線粒體內(nèi)次氯酸濃度的測定。

本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在檢測含次氯酸樣品中的應(yīng)用。

其中：所述含次氯酸樣品優(yōu)選是含有次氯酸的溶液或生物細胞。

實驗證實，本發(fā)明所述的熒光探針可以高選擇性和高靈敏度地與次氯酸作用。在沒有次氯酸時，探針發(fā)射香豆素基團的藍光(483nm)；當有次氯酸存在時，探針中的雙酰肼結(jié)構(gòu)被氧化轉(zhuǎn)變成羧酸，羅丹明結(jié)構(gòu)螺環(huán)打開，香豆素基團和羅丹明基團之間發(fā)生FRET過程，探針在570nm處發(fā)射熒光，隨著次氯酸濃度的增加，570nm處的熒光逐漸增強，而483nm處的熒光強度減弱，二者的比值(I₅₇₀/I₄₈₃、I₄₈₃/I₅₇₀)與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)(0-8eq)呈良好的線性關(guān)系。另外，探針結(jié)構(gòu)中的吡啶鹽結(jié)構(gòu)，具有良好的線粒體靶向作用，探針可用于線粒體內(nèi)次氯酸的檢測。

具體的：配制上述次氯酸探針的乙醇與PBS(0.01M)緩沖溶液(V/V＝0.5：99.5，pH 7.40)的溶液，分別加入一定量HOCl、ON、ONOO^-、·OH、H₂O₂、¹O₂、^-O₂、t-BuO·、t-BuOOH、S^2-、SO₄^2-、AcO^-、Br^-、^-HCO₃、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺，然后對上述樣品進行熒光測試，結(jié)果表明探針對次氯酸有良好的選擇性，I₅₇₀/I₄₈₃變化明顯，見圖1。

在上述次氯酸探針的乙醇與PBS(0.01M)緩沖溶液(V/V＝0.5：99.5，pH 7.40)的溶液中，伴隨加入次氯酸濃度的依次增加，在550nm處出現(xiàn)一個新的紫外吸收峰(見圖2)，說明在次氯酸作用下，探針的羅丹明結(jié)構(gòu)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)。在熒光發(fā)射譜中，570nm處的熒光強度逐漸增強，而483nm處的熒光強度逐漸減弱，二者的比值(I₅₇₀/I₄₈₃或I₄₈₃/I₅₇₀)與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)(0-8eq)呈良好的線性關(guān)系，表明探針對次氯酸具有較強的響應(yīng)能力(見圖3、4)。

進一步的，本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針可以用于檢測線粒體內(nèi)次氯酸濃度的變化。

用上述探針孵育后的RAW264.7細胞，未用LPS處理的細胞藍光較強，而紅光很弱。若LPS培養(yǎng)細胞后進行成像，探針的藍光減弱而紅光明顯增強，統(tǒng)計結(jié)果更加直觀地呈現(xiàn)了這種趨勢，即經(jīng)過LPS處理后的細胞紅光與藍光之比明顯升高，預(yù)示該探針能用于內(nèi)源性次氯酸的檢測(見圖5)。

本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在檢測線粒體內(nèi)次氯酸中的應(yīng)用。

借助商品化線粒體染料Mito Tracker Deep Red探究探針在上述細胞內(nèi)的分布。用LPS處理RAW264.7細胞后，再依次用上述探針和Mito Tracker Deep Red繼續(xù)孵育，結(jié)果由圖6c的重疊情況及圖6e中共定位系數(shù)(0.91)可知，本發(fā)明的探針能夠?qū)€粒體進行靶向定位，這是因為探針分子內(nèi)存在吡啶鹽的結(jié)構(gòu)(見圖6)。

綜上所述，本發(fā)明所述的線粒體靶向比率型次氯酸熒光探針，不僅可以在較低濃度下檢測溶液中的次氯酸，而且可以用于細胞線粒體內(nèi)次氯酸的檢測，預(yù)示其在生命科學(xué)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是不同分析物加到本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針溶液前后，探針的熒光發(fā)射譜(a)及相對熒光強度比值(R-R₀)/R₀(b)的變化情況。

其中，R代表加入分析物后探針的I₅₇₀/I₄₈₃值；R₀代表不加分析物時探針的I₅₇₀/I₄₈₃值，即空白樣品。1:Blank,2:ON,3:ONOO^-,4:·OH,5:H₂O₂,6:¹O₂,7:^-O₂,8:t-BuO·,9:t-BuOOH,10:S^2-,11:SO₄^2-,12:AcO^-,13:Br^-,14:^-HCO₃,15:Ca²⁺,16:Zn²⁺,17:Mg²⁺,18:Fe³⁺,19:Fe²⁺,20:Cu²⁺,21:HOCl。

測試條件：探針濃度為5μM，次氯酸濃度為50μM，其他活性氧的濃度均為150μM，陰離子和陽離子濃度均為100μM。溶劑體系為PBS緩沖液/EtOH＝99.5/0.5(V/V)，pH＝7.4，λex＝420nm。

圖2是本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在不同當量次氯酸時的紫外吸收譜。

測試條件：探針濃度為5μM，次氯酸濃度為0-50μM，溶劑體系為PBS緩沖液/EtOH＝99.5/0.5(V/V)，pH＝7.4。

圖3是本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在不同當量次氯酸時的熒光發(fā)射譜。

測試條件：探針濃度為5μM，次氯酸濃度為0-50μM，溶劑體系為PBS緩沖液/EtOH＝99.5/0.5(V/V)，pH＝7.4，λex＝420nm。

圖4是本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針的熒光強度比值I₅₇₀/I₄₈₃(a)與I₄₈₃/I₅₇₀(b)在不同當量次氯酸時的變化情況。

測試條件：探針濃度為5μM，次氯酸濃度為0-50μM，溶劑體系為PBS緩沖液/EtOH＝99.5/0.5(V/V)，pH＝7.4，λex＝420nm。

圖5是本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在RAW264.7細胞內(nèi)的熒光成像情況。

其中(a)RAW264.7細胞未經(jīng)或經(jīng)過LPS處理后，再用探針孵育細胞后的熒光成像。探針藍光收集波段為405-555nm，紅光收集波段為560-700nm；(b)利用Image J獲得的紅光與藍光比值的量化結(jié)果。

圖6是本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針與Mito Tracker Deep Red在RAW264.7細胞內(nèi)的共定位實驗。

其中(a)探針紅色通道(560-700nm)收集到的熒光圖像，選用綠光偽色以便于區(qū)分；(b)Mito Tracker Deep Red的熒光圖像；(c)為(a)、(b)的疊加圖；(d)亮場圖像；(e)共定位系數(shù)為0.91。

具體實施方式

實施例1：本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針的合成方法

將化合物1(455mg,0.64mmol)溶解于10mL干燥的二氯甲烷中，再加入三乙胺(130mg,1.28mmol)。在冰水浴條件下，將化合物2(272mg,1.92mmol)分批加到反應(yīng)液中。反應(yīng)液氮氣保護，0℃下反應(yīng)半小時后，再在室溫下反應(yīng)5小時，TLC檢測反應(yīng)完全。向反應(yīng)液中加入150mL二氯甲烷，有機相用飽和食鹽水洗滌(150mL×3)，再用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸餾得到粗產(chǎn)品，以二氯甲烷/甲醇＝20/1為洗脫劑，柱層析得425mg中間體3的純品，為黃色固體，產(chǎn)率為81.4％。反應(yīng)式如下：

以IR、¹H NMR、¹³C NMR及HRMS對其進行表征，數(shù)據(jù)如下：

IR(KBr),ν/cm^-1:3434,2967,2921,2854,1722,1614,1513,1452,1215,1125,990.¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):1.06(t,6H,J＝6.9Hz,NCH₂CH₃),1.13(t,6H,J＝6.9Hz,NCH₂CH₃),3.16-3.35(m,8H,N(CH₂CH₂)₂NCO,NCH₂CH₃),3.45(q,4H,J＝6.9Hz,NCH₂CH₃),3.45(m,2H,N(CH₂CH₂)₂NCO),3.69(br,2H,N(CH₂CH₂)₂NCO)),6.35(t,2H,J＝9.0Hz,ArH),6.53(d,1H,J＝8.7Hz,ArH),6.56(d,1H,J＝2.1Hz,ArH),6.63(m,3H,ArH),6.74(dd,1H,J＝9.0Hz,2.4Hz,ArH),7.13(dd,1H,J＝6.3Hz,1.8Hz,ArH),7.47(m,3H,ArH),7.63(m,2H,ArH),7.89(m,1H,ArH),8.00(s,1H,ArH),8.66(dd,2H,J＝4.5Hz,1.8Hz,ArH),10.50(s,1H,CONH)；¹³C NMR(100MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):164.53,164.42,163.92,158.92,157.11,153.71,153.48,151.82,151.74,151.27,150.65,148.95,144.42,139.77,133.94,130.61,130.06,129.59,129.28,124.62,123.27,121.98,116.26,111.62,109.88,108.95,108.31,107.60,104.67,101.74,97.32,96.78,65.83,55.38,46.65,44.65,44.09,12.87,12.77；HRMS m/z:calcd for C₄₈H₄₈N₇O₆[M+H]⁺:818.3666；found:818.3660.

將化合物3(363mg,0.44mmol)和碘甲烷(630mg,4.44mmol)溶解于5mL乙腈中，反應(yīng)液回流2小時，TLC檢測反應(yīng)完全。減壓蒸餾除去溶劑，得到粗產(chǎn)品。以二氯甲烷/甲醇＝10/1為洗脫劑，柱層析得278mg本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針，為黃色固體，產(chǎn)率為65.3％。

以IR、¹H NMR、¹³C NMR及HRMS對其進行表征，數(shù)據(jù)如下：

IR(KBr),ν/cm^-1:3445,2968,2922,2857,1720,1613,1512,1453,1213,1125,988.¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):1.07(t,6H,J＝6.8Hz,NCH₂CH₃),1.13(t,6H,J＝6.8Hz,NCH₂CH₃),3.16-3.30(m,8H,N(CH₂CH₂)₂NCO,NCH₂CH₃),3.40-3.50(m,6H,NCH₂CH₃,N(CH₂CH₂)₂NCO),3.66-3.73(br,2H,N(CH₂CH₂)₂NCO),4.34(s,3H,CH₃),6.31(d,1H,J＝2.4Hz,ArH),6.38-6.41(m,1H,ArH),6.53-6.56(m,2H,ArH),6.61-6.66(m,3H,ArH),6.75(dd,1H,J＝8.8Hz,2.0Hz,ArH),7.14(d,1H,J＝7.6Hz,ArH),7.50(s,1H,J＝8.8Hz,ArH),7.62-7.66(m,2H,ArH),7.91(d,1H,J＝7.2Hz,ArH),8.00(s,1H,ArH),8.12(d,2H,J＝7.2Hz,ArH),9.06(d,2H,J＝6.0Hz,ArH),11.02(s,1H,CONH)；¹³C NMR(100MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):164.57,163.76,161.70,158.94,157.11,153.68,153.47,151.92,151.79,151.26,149.09,147.17,145.84,144.41,134.19,130.62,129.98,129.90,129.42,129.19,126.03,124.65,123.39,116.25,111.71,109.93,108.60,108.48,107.61,104.42,101.75,97.37,96.79,66.00,49.08,48.75,44.66,44.12,12.90,12.78；HRMS m/z:calcd for C₄₉H₅₀N₇O₆[M]⁺:832.3823；found:832.3845；m/z:calcd forC₄₉H₅₁N₇O₆[M+H]²⁺/2:416.69505；found:416.6960。

實施例2：本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在檢測含次氯酸樣品中的應(yīng)用

配制實施例1制備的探針的乙醇與PBS(0.01M)緩沖溶液(V/V＝0.5：99.5，pH 7.40)的溶液，分別加入一定量HOCl、ON、ONOO^-、·OH、H₂O₂、¹O₂、^-O₂、t-BuO·、t-BuOOH、S^2-、SO₄^2-、AcO^-、Br^-、^-HCO₃、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺，然后對上述樣品進行熒光測試，結(jié)果表明探針對次氯酸有良好的選擇性，I₅₇₀/I₄₈₃變化明顯，見圖1。

在上述次氯酸探針的乙醇與PBS(0.01M)緩沖溶液(V/V＝0.5：99.5，pH 7.40)的溶液中，伴隨加入次氯酸濃度的依次增加，在550nm處出現(xiàn)一個新的紫外吸收峰(見圖2)，說明在次氯酸作用下，探針的羅丹明結(jié)構(gòu)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)。在熒光發(fā)射譜中，570nm處的熒光強度逐漸增強，而483nm處的熒光強度逐漸減弱，二者的比值(I₅₇₀/I₄₈₃或I₄₈₃/I₅₇₀)與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)(0-8eq)呈良好的線性關(guān)系，表明探針對次氯酸具有較強的響應(yīng)能力(見圖3、4)。

實施例3：本發(fā)明所述線粒體靶向的比率型次氯酸熒光探針在檢測線粒體內(nèi)次氯酸中的應(yīng)用

借助商品化線粒體染料Mito Tracker Deep Red探究探針在RAW264.7細胞內(nèi)的分布。用LPS處理RAW264.7細胞后，再依次用上述探針和Mito Tracker Deep Red繼續(xù)孵育，結(jié)果由圖6c的重疊情況及圖6e中共定位系數(shù)(0.91)可知，本發(fā)明的探針能夠?qū)€粒體進行靶向定位，這是因為探針分子內(nèi)存在吡啶鹽的結(jié)構(gòu)(見圖6)。