一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、維生素H、重組人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、橙皮苷和白藜蘆醇。本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基可以縮短角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁時(shí)間，防止角質(zhì)形成細(xì)胞分化和減少角質(zhì)形成細(xì)胞受成纖維細(xì)胞的污染；同時(shí)該皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基還能提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率，維持角質(zhì)形成細(xì)胞在傳代過程中的活力和細(xì)胞特性，是一種較為理想的角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)基。
【專利說明】
-種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體的皮膚是由表皮、真皮及皮下組織=部分組成。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的一種 角質(zhì)蛋白細(xì)胞，是構(gòu)成表皮的重要組成部分。正常情況下，人體表皮細(xì)胞有規(guī)律地進(jìn)行增 殖、分化和脫落，維持著皮膚糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)的平衡，具有保護(hù)自身、調(diào)節(jié)體 溫、排泄廢物和免疫調(diào)節(jié)等功能。
[0003] 角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞的主要組成部分，是一種能合成角質(zhì)蛋白的上皮細(xì)胞。 在角質(zhì)形成細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞演變的過程中，一般可W分為四層，即基底層、棘層、顆粒層W 及角質(zhì)層。有人把前=層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外，在某些部位，特別在掌 巧部位，角質(zhì)層下方還可見到透明層。
[0004] 角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)可W為皮膚毒理學(xué)、燒傷治療學(xué)、美容學(xué)和皮膚病發(fā)病 機(jī)制的研究提供了新的途徑。但是，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞在分離培養(yǎng)中過程中存在易分化、易 受成纖維細(xì)胞污染、不易貼壁等問題，而且角質(zhì)形成細(xì)胞的繁殖力較低、細(xì)胞活力較弱，細(xì) 胞的成活率不高。因此，建立一種體系穩(wěn)定、適合于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng) 方法成為當(dāng)務(wù)之急。
[0005] 張興等發(fā)表了一篇題目為"人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的制備及體外培養(yǎng)"的論文，該論 文主要探討了人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的制備及體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示:膜酶+分離酶消化可獲得 較純的角質(zhì)形成細(xì)胞，細(xì)胞在限制性KC-FSM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)4她、72h后測(cè)得的D值 顯著高于DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基。因此，膜酶+分離酶消化、限制性KC-FSM培養(yǎng)基體 外培養(yǎng)是制備和培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的好方法。但是，該限制性KC-FSM培養(yǎng)基在人皮 膚角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中仍存在細(xì)胞易分化，細(xì)胞貼壁時(shí)間較長(zhǎng)和細(xì)胞體外增殖率 較低的缺陷，不利于該方法的推廣和應(yīng)用。
[0006] 中國(guó)專利申請(qǐng)201510741542.9公開了一種培養(yǎng)基及其應(yīng)用與角質(zhì)形成細(xì)胞的培 養(yǎng)方法，所述角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基包括KC-FSM無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、KGF、EGF、谷氨酷胺和 非必需氨基酸。采用上述提供的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，可獲得數(shù)量大、活力高的角質(zhì)形成細(xì) 胞，細(xì)胞特性在傳代過程中保持良好，另外該培養(yǎng)基是采用無(wú)血清培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 在保證了細(xì)胞活力的前提下，避免了異源血清帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。但是，該角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方 法在細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在易氧化、易分化的缺陷，大大的限制了該角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方 法的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中角質(zhì)形成細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中存在細(xì)胞易分化、易受成纖 維細(xì)胞污染、易氧化、貼壁時(shí)間長(zhǎng)和細(xì)胞增殖率低的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種皮膚 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，w解決上述問題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括DMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如 下組分及其濃度:表皮生長(zhǎng)因子2-4ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3-5ng/ml、維生素 H l-3ug/ml、重 組人膜島素6-9mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5-8ug/ml、澄皮巧10-20umol/L和白襲蘆醇6-12umol/L。
[0009] 進(jìn)一步地，所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基包括DMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組 分及其濃度:表皮生長(zhǎng)因子化g/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子4ng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素 8mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16umo 1 /L和白襲蘆醇1 Oumo 1 /L。
[0010] 進(jìn)一步地，所述DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)基。
[0011] 進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-0。
[001^ 另外，本發(fā)明還提供了一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[001引 S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX 0.5cm的小塊放入酶液I中，放置4°C 條件下消化過夜；
[0014] S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎， 放置37°C條件下解育15-20min;
[0015] S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打6-12次，用200-240目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200- 150化/min離屯、，棄上清，得濾渣；
[0016] S4將步驟S3得到的濾渣接入權(quán)利要求1-4任一所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基 中，于37°C、5%C〇2的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟S1中酶液功質(zhì)量濃度為0.6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。
[001引進(jìn)一步地，所述步驟S1中酶液功質(zhì)量濃度為0.7 %的中性蛋白酶溶液。
[0019] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的酶液II由質(zhì)量濃度為0.3-0.5%的乙二胺四乙酸和質(zhì) 量濃度為0.4-0.6 %的膜酶組成。
[0020] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的酶液II由質(zhì)量濃度為0.4%的乙二胺四乙酸和質(zhì)量濃 度為0.5 %的膜酶組成。
[0021] 本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基的組分中，表皮生長(zhǎng)因子是一種多功能 的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-e可W調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化;維生素 H是細(xì)胞 內(nèi)多種酶的輔酶，在蛋白質(zhì)合成和物質(zhì)代謝中起著重要的作用，有利于角質(zhì)形成細(xì)胞的生 長(zhǎng);重組人膜島素可W提高合成代謝能力，刺激細(xì)胞的生長(zhǎng);轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中主要的鐵傳 遞蛋白，為細(xì)胞內(nèi)化和細(xì)胞代謝提供所需的鐵。
[0022] 澄皮巧，分子式為C2姐34〇15，CAS號(hào)為520-26-3，白襲蘆醇，分子式為Ci4出2〇3，CAS號(hào) 為501-36-0。澄皮巧和白襲蘆醇具有抗氧化作用，有利于維持細(xì)胞的生物功能。
[0023] 進(jìn)一步地，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì) 形成細(xì)胞在1化內(nèi)貼壁，角質(zhì)形成細(xì)胞在1化內(nèi)呈圓形，繼而呈楠圓形，體積變大，2天左右可 見數(shù)個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞形成小集落，5天左右細(xì)胞匯合成片。而且使用本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì) 形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，輪廓清楚，折光性好，成鋪路石樣形態(tài)，培 養(yǎng)初期可見極少量梭形纖維細(xì)胞，隨著傳代和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成纖維樣細(xì)胞逐漸消失，可 W獲得較高純度的角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0024] 進(jìn)一步地，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與高糖型DMEM培養(yǎng)基相比，使用本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形 成細(xì)胞培養(yǎng)基在4她和72h內(nèi)可W極顯著的（P<0.01)提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率，說明本 發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增長(zhǎng)的作用， 可W有效的提高角質(zhì)形成細(xì)胞的產(chǎn)率。
[0025] 本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起縮短角質(zhì)形成細(xì)胞 的貼壁時(shí)間，防止角質(zhì)形成細(xì)胞分化和減少角質(zhì)形成細(xì)胞受成纖維細(xì)胞污染的作用；同時(shí) 該皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基還能提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率，維持角質(zhì)形成細(xì)胞在傳代過 程中的活力和細(xì)胞特性，是一種較為理想的角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)基。
[0026] 總之，本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0027] 1)本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基可W有效的縮短角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁 時(shí)間，防止角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，減少角質(zhì)形成細(xì)胞受成纖維細(xì)胞的污染；
[0028] 2)本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基可W有效提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率， 維持角質(zhì)形成細(xì)胞在傳代過程中的活力和細(xì)胞特性，是一種較為理想的角質(zhì)形成細(xì)胞體外 培養(yǎng)基。
【具體實(shí)施方式】
[0029] W下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明不僅僅限于W下實(shí)施例。在本發(fā) 明的范圍內(nèi)或者在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的變更、組合或替 換，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，且包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中的各 組分均為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如:表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)于上海恒斐生物科技有限公司，重組人膜島 素購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司，中性蛋白酶溶和膜酶購(gòu)于Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于 Gibco公司。
[0030] 實(shí)施例1、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0031 ]所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子化g/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-防ng/ml、維生素 H lug/ml、重組人膜島素6mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白加 g/ml、澄皮巧10皿ol/L和白襲蘆醇6皿ol/L。
[00創(chuàng)制備方法：
[0033] 向DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、維生素 H、重 組人膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、澄皮巧和白襲蘆醇，混勻，過膜除菌即得。
[0034] 實(shí)施例2、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0035] 所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子：3ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿01 /L和白襲蘆醇10皿01 /L。
[0036] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0037] 實(shí)施例3、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[003引所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子4ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-帖ng/ml、維生素 H 3ug/ml、重組人膜島素9mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白8ug/ml、澄皮巧20皿01/L和白襲蘆醇12皿01/L。
[0039] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0040] 實(shí)施例4、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法
[0041 ] S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX 0.5cm的小塊放入酶液I中，所述酶液 I為質(zhì)量濃度為0.7%的中性蛋白酶溶液，放置4°C條件下消化過夜；
[0042] S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎， 所述酶液II由質(zhì)量濃度為0.4 %的乙二胺四乙酸和質(zhì)量濃度為0.5 %的膜酶組成，放置37 °C 條件下解育18min;
[0043] S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打10次，用200目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200r/min離屯、， 棄上清，得濾渣；
[0044] S4將步驟S3得到的濾渣接入本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基中，于37 °C、5 % C〇2的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。
[0045] 對(duì)比例1、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0046] 所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括低糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子：3ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿ol/L和白襲蘆醇8皿ol/L。
[0047] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0048] 與實(shí)施例2的區(qū)別在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低糖型DMEM培養(yǎng)基。
[0049] 對(duì)比例2、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0050] 所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子：3ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml和澄皮巧24皿ol/L。
[0051] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0052] 與實(shí)施例2的區(qū)別在于，沒有添加白襲蘆醇，增加了澄皮巧的濃度。
[0053] 對(duì)比例3、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0054] 所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長(zhǎng)因子：3ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml和白襲蘆醇24umol/L。
[0055] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0056] 與實(shí)施例2的區(qū)別在于，沒有添加澄皮巧，增加了白襲蘆醇的濃度。
[0057] 對(duì)比例4、一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0058] 所述皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及 其濃度：表皮生長(zhǎng)因子化g/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素 8mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧12umo 1 /L和白襲蘆醇12umo 1 /L。
[0059] 制備方法與實(shí)施例1類似。
[0060] 實(shí)施例2的區(qū)別在于，澄皮巧和白襲蘆醇的濃度均為12皿ol/L。
[0061 ]試驗(yàn)例一、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)
[0062] 1、試驗(yàn)對(duì)象:皮膚組織取自健康婦女脫落的子宮內(nèi)膜。
[00創(chuàng) 2、試驗(yàn)材料:實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3和對(duì)比例4審。 備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0064] 3、試驗(yàn)方法：
[0065] 將脫落的子宮內(nèi)膜按照實(shí)施例4的步驟1-3進(jìn)行處理，然后把處理后的濾渣放入實(shí) 施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3和對(duì)比例4制備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 的培養(yǎng)基中，分別標(biāo)志為實(shí)施例1組、實(shí)施例2組、實(shí)施例3組、對(duì)比例1組、對(duì)比例2組、對(duì)比例 3組和對(duì)比例4組，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)5-8天，
[0066] 并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁時(shí)間和生長(zhǎng)情況。
[0067] 4、試驗(yàn)結(jié)果：
[0068] 試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0069] 表1皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)
[0072]由表1可知，使用本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在1化內(nèi)貼壁，在1化內(nèi)細(xì)胞呈圓形，繼而呈楠圓形，體積變大，2天左右可見數(shù)個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞形成小集落，5天左右細(xì)胞匯合成片。而使用對(duì)比例1-4制備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)
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[( 胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁時(shí)間和細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間均比本發(fā)明的實(shí)施例1-3的時(shí)間 長(zhǎng)，說明本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基可W有效的縮短角質(zhì)形成細(xì)胞的貼壁時(shí) 間，防止角質(zhì)形成細(xì)胞分化和減少角質(zhì)形成細(xì)胞受成纖維細(xì)胞污染，是一種較為理想的角 質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)基。
[0073] 試驗(yàn)例二、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)能力測(cè)定試驗(yàn)
[0074] 1、試驗(yàn)對(duì)象:皮膚組織取自健康婦女脫落的子宮內(nèi)膜。
[007引 2、試驗(yàn)材料:實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3和對(duì)比例4審。 備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0076] 3、試驗(yàn)方法：
[0077] 3.1、將脫落的子宮內(nèi)膜按照實(shí)施例4的步驟1-3進(jìn)行處理，然后把處理后的濾渣放 入實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3和對(duì)比例4制備的皮膚角質(zhì)形成 細(xì)胞的培養(yǎng)基，分別標(biāo)志為對(duì)照組、實(shí)施例1組、實(shí)施例2組、實(shí)施例3組、對(duì)比例1組、對(duì)比例2 組、對(duì)比例3組和對(duì)比例4組，于37°C、5 % C〇2的條件下培養(yǎng)，W高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì) 照組，將原代細(xì)胞W相同的劑量接種到96孔板上，每孔的細(xì)胞懸液為200ul，細(xì)胞數(shù)為IX 104個(gè)，每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)平行孔，分別解育4她、72h;
[0078] 3.2、將^巧容液溶解在0.1111〇1/1的？85中，使其濃度為5旨/1，將培養(yǎng)板的原培養(yǎng)液 棄去，每孔加入200ul培養(yǎng)液，每lOOul培養(yǎng)液中含MTTlOul，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培 養(yǎng)地，然后每孔加入20ul的DMS0中止反應(yīng)，將培養(yǎng)板放在振蕩器上充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定 570nm波長(zhǎng)時(shí)每孔的光密度值(0D值），每組重復(fù)3次，取平均值。
[00巧]4、試驗(yàn)結(jié)果：
[0080] 試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
[0081 ] 表2皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)能力測(cè)定試驗(yàn)(n = 3 +SD)
[0082]
[0083] 注:與對(duì)照組相比吁<0.05，*中<0.01。
[0084] 由表2可知，與對(duì)照組相比，使用本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培 養(yǎng)基可W極顯著的(P<〇.01)提高角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率，而使用本發(fā)明實(shí)施例1-4制備的 皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在4她和72h內(nèi)的細(xì)胞增殖率均比本發(fā)明的 實(shí)施例1-3的增殖率差，說明本發(fā)明提供的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起 促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增長(zhǎng)的作用，可W有效的提高角質(zhì)形成細(xì)胞的產(chǎn)率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組 分及其濃度:表皮生長(zhǎng)因子2_4ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3-5ng/ml、維生素 H l-3ug/ml、重組人 胰島素6_9mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5_8ug/ml、橙皮苷10_20umol/L和白藜蘆醇6_12umol/L〇2. 如權(quán)利要求1所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括D Μ E Μ基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，還包括如下組分及其濃度:表皮生長(zhǎng)因子3ng/ml、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子4ng/ml、維生素 H 2ug/ ml、重組人胰島素8mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ug/ml、橙皮苷16umol/L和白藜蘆醇10umol/L〇3. 如權(quán)利要求1或2所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述DMEM基礎(chǔ)培 養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)基。4. 如權(quán)利要求1或2所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β。5. -種皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX0.5cm的小塊放入酶液I中，放置4°C條件 下消化過夜； S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎，放置 37°C條件下孵育15-20min; S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打6-12次，用200-240目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200-1500r/ min離心，棄上清，得濾渣； S4將步驟S3得到的濾渣接入權(quán)利要求1-4任一所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基中， 于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。6. 如權(quán)利要求5所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1中酶液 I為質(zhì)量濃度為〇. 6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。7. 如權(quán)利要求6所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1中酶液 I為質(zhì)量濃度為〇. 7 %的中性蛋白酶溶液。8. 如權(quán)利要求5所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2中的酶 液II由質(zhì)量濃度為〇. 3-0.5 %的乙二胺四乙酸和質(zhì)量濃度為0.4-0.6 %的胰酶組成。9. 如權(quán)利要求8所述的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2中的酶 液II由質(zhì)量濃度為〇. 4 %的乙二胺四乙酸和質(zhì)量濃度為0.5 %的胰酶組成。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK106047793SQ201610439563
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】陳松彬, 易萍, 倪彥艷, 張愛萍, 劉杰森
【申請(qǐng)人】廣東科瑋生物技術(shù)股份有限公司