一種解藻酸弧菌及其用于水體脫氮的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明自半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖生物濾池中篩選到一株解藻酸弧菌HA2。該菌株能高效降解水體中的氨態(tài)氮，同時(shí)又不造成亞硝態(tài)氮的積累，這與現(xiàn)有技術(shù)中解藻酸弧菌的常規(guī)生理特性具有明顯區(qū)別：現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的解藻酸弧菌不具有氨態(tài)氮降解能力，更無法杜絕氨態(tài)氮降解過程中亞硝態(tài)氮的積累積累問題。因此本發(fā)明所提供的解藻酸弧菌HA2產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果?；谝陨戏e極的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明確定了利用其進(jìn)行水體脫氮的應(yīng)用；由于該菌株?duì)I養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、繁殖能力強(qiáng)，且無毒性代謝產(chǎn)物，因此可尤其適用于養(yǎng)殖水體的脫氮作業(yè)。CGMCC911520140430
【專利說明】
-種解藻酸弧菌及其用于水體脫氮的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步設(shè)及新的微生物品系及其用途，具體設(shè) 及一種解藻酸弧菌及其用于水體脫氮的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 解藻酸弧菌(V化rio alginol^icus)，又稱為溶藻弧菌，屬弧菌科，弧菌屬，革蘭 氏陰性短桿菌，無芽抱、無夾僕，單獨(dú)存在或尾端相連構(gòu)成"C"形或"S"形。此類菌種具嗜鹽 性和嗜溫性，在世界范圍內(nèi)的水體中均有分布，最適生長(zhǎng)溫度為17~35°C?，F(xiàn)有技術(shù)研究表 明，此類菌種明確屬于兼性厭氧型微生物，可寄生于多種海洋微生物中；此外，現(xiàn)有技術(shù)中 發(fā)現(xiàn)此類菌種具有水體脫氮作用。
[0003] 高密度的海水養(yǎng)殖水體中，生物排泄物及巧料殘?jiān)谖⑸镒饔孟聲?huì)導(dǎo)致水體氮 元素積累、富營(yíng)養(yǎng)化加劇，從而破壞水體環(huán)境、導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生病變。針對(duì)運(yùn)一問題，現(xiàn)有 技術(shù)中主要通過頻繁換注新水或定期曝氣的方式降低氨氮含量。W達(dá)到水質(zhì)要求。此類方 法受水源位置的影響，且能耗較高，同時(shí)還可能導(dǎo)致魚類氣泡病、細(xì)菌性觸病的發(fā)生，因此 現(xiàn)有技術(shù)對(duì)氨氮污染的控制效果并不理想。
[0004] 為了降低水體中氮素含量，微生物處理技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，利用脫氮微生物 自身代謝W降低氮素含量，具有能耗低、操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。此類方法的核屯、 在于微生物的處理性能，一方面要求菌種具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力，另一方面對(duì)氨氮和硝 態(tài)氮的降解能力突出，同時(shí)代謝產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)無毒無害。現(xiàn)有技術(shù)中同時(shí)滿足上述要求的優(yōu)良 菌種較為稀缺，因此有必要開發(fā)新的、性能優(yōu)異的水體脫氮菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種新的解藻酸弧菌，W解決現(xiàn)有技 術(shù)缺乏此株解藻酸弧菌的技術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的解藻酸弧菌無法降解氨氮。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述解藻酸弧菌用于水體脫氮的應(yīng)用，W解決現(xiàn)有技術(shù)中，脫 氮微生物降解水體中氨氮效率較低的技術(shù)問題。
[000引本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中，脫氮微生物在降解水體中氨氮的過 程中易導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累的技術(shù)問題。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)W上技術(shù)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0010] -種解藻酸弧菌，其保藏編號(hào)為CGMCC NO.9115。該菌株由天津農(nóng)學(xué)院于2014年4 月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、。該菌株屬解藻酸弧菌 (vibrio alginol^icus)。該菌株在本發(fā)明中亦可稱為解藻酸弧菌HA2(下同）。
[0011] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述解藻酸弧菌用于水體脫氮的應(yīng)用。
[0012] 作為優(yōu)選，所述水體脫氮是降解水體中的氨氮。
[0013] 作為優(yōu)選，所述水體是養(yǎng)殖水體。
[0014] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述解藻酸弧菌用于制備水體脫氮菌劑的應(yīng)用。
[0015] 作為優(yōu)選，所述制備包括W下步驟:培養(yǎng)所述解藻酸弧菌，收集菌體，冷凍干燥，即 得到所述水體脫氮菌劑。
[0016]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述水體脫氮菌劑中菌體含量為1 X 109~2.7 X 109c化/邑。
[0017] 在W上技術(shù)方案中，所述水體脫氮，是指降解水體中的氮素(包括氨氮）；所述水體 脫氮菌劑，是指W微生物為物質(zhì)基礎(chǔ)的、用于添加至水體中降解氮素(包括氨氮)的物質(zhì);所 述養(yǎng)殖水體，是指用于養(yǎng)殖水生生物的水體，包括水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的水體，也包括水產(chǎn)養(yǎng)殖 后所產(chǎn)生的廢水。
[0018] 本發(fā)明自半滑舌錦工廠化養(yǎng)殖生物濾池中篩選到一株解藻酸弧菌HA2。該菌株能 高效降解水體中的氨態(tài)氮，同時(shí)又不造成亞硝態(tài)氮的積累，運(yùn)與現(xiàn)有技術(shù)中解藻酸弧菌的 常規(guī)生理特性具有明顯區(qū)別(現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的解藻酸弧菌不具有氨態(tài)氮降解能力，更無 法杜絕氨態(tài)氮降解過程中亞硝態(tài)氮的積累積累問題），因此本發(fā)明所提供的解藻酸弧菌HA2 產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果?；赪上積極的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明確定了利用其進(jìn)行水體脫氮的 應(yīng)用；由于該菌株?duì)I養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、繁殖能力強(qiáng)，且無毒性代謝產(chǎn)物，因此可尤其適用于養(yǎng)殖 水體的脫氮作業(yè)。進(jìn)一步的，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)W該菌株為有效成分制備的脫氮菌劑使用方便、效 果突出，尤其在限定了特定菌體濃度的基礎(chǔ)上，更有利于保證水體處理效果。
[0019] 本發(fā)明W創(chuàng)新性的技術(shù)改進(jìn)實(shí)現(xiàn)了突出的技術(shù)效果，同時(shí)成本較低、易于實(shí)現(xiàn)，因 此具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中不同菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h時(shí)培養(yǎng)液pH及 0D600檢測(cè)結(jié)果。
[0021] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中不同菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h時(shí)培養(yǎng)液中氨氮及 總氮濃度檢測(cè)結(jié)果。
[0022] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中不同菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2地時(shí)亞硝態(tài)氮濃度檢 測(cè)結(jié)果。
[0023] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中不同菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h時(shí)1C濃度及TO切農(nóng) 度檢測(cè)結(jié)果。
[0024] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中抑隨時(shí)間變化圖。
[0025] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中溫度隨時(shí)間變化圖。
[0026] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中總氨氮濃度隨時(shí)間變化圖。
[0027] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中總氮濃度隨時(shí)間變化圖。
[0028] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中亞硝態(tài)氮濃度隨時(shí)間變化圖。
[0029] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例2中，將由解藻酸弧菌HA2所制備的脫氮菌劑加入至養(yǎng)殖水體 后，水體中硝態(tài)氮濃度隨時(shí)間變化圖。
[0030] 在W上圖5~10中，B組表示實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)，K1組表示對(duì)照組數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在 W下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0032] W下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確 數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的范圍 內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第一數(shù)值到 第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言 可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0033] 除有定義外，W下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0034] W下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑;所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置=次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值;W下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0035] 實(shí)施例1(解藻酸弧菌HA2分離篩選及鑒定）
[0036] 本實(shí)施例中篩選的生物濾料取自天津立達(dá)海水發(fā)展有限公司循環(huán)水養(yǎng)殖的生物 濾池。
[0037] 1.1培養(yǎng)基
[003引 （1)富集培養(yǎng)基:畑祀1 0.5;巧樣酸鋼5.66;維氏鹽溶液50血;9^.0。
[0039] 維氏鹽溶液（g ? L-i):K2HP〇4 5.0;MgS〇4 ? 7此0 2.5;FeS〇2 ? 7此0 0.05;MnS〇4 ? 4出0 0.05;鹽度為15的面水。
[0040] (2)分離培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加15g的瓊脂粉；
[0041 ] (3)篩選培養(yǎng)基:K此P04 1.5;MgS〇4 ? 7此0 0.01;化抽P〇4 7.9;微量元素溶液211〇^; 鹽度為15的海水;pH7.0-7.5;巧樣酸鋼5.66;NaN03 0.8415，l血l%BTB。
[0042] 微量元素溶液（g ? L-1) :EDTA 50;ZnS〇4 2.2;CaCl2 5.5;MnCl ? 4出0 5.06; 化S02*7出0 5.0;(NH4)6M〇7〇2*4出0 1.1;CuS〇2*5出0 1.57;CoCl2*6出0 1.61。1.2篩選：
[0043] 取半滑舌錦生物濾池中濾料，加水?dāng)垊?，震?min后，取上清接種于富集培養(yǎng)基， 于23°C培養(yǎng)，富集一周，發(fā)酵液經(jīng)梯度稀釋后涂布在倒置的分離培養(yǎng)基平板上，于23°C培 養(yǎng)，挑選平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，直到得到單菌株的純培養(yǎng)，本次試驗(yàn)共獲 得9株單菌落，并依此命名為HA1、HA2、HA4、HA7、HA8、HA9、HA11、HA12、HA13。將純化得到的菌 株接種到篩選培養(yǎng)基中，測(cè)試該菌株在23°C、120r/min培養(yǎng)2地時(shí)上述9株菌對(duì)氨氮、總氮及 總碳的降解情況，其中菌株HA2的綜合效果較好，為96.28%、95.52% (實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1~4及 表1所示）。
[0044] 表1不同菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h時(shí)的氨氮和總氮去除率
[0045]
[0046] 數(shù)據(jù)表示：mean±S;E，n = 6。
[0047] 本試驗(yàn)中分離純化的9株菌，經(jīng)24h培養(yǎng)后，TN的濃度隨著NH4+-腳^度降低而降低， 各菌株培養(yǎng)液中幾乎無 N02^N的積累，經(jīng)24h培養(yǎng)后，各培養(yǎng)液抑均有不同程度的升高，升高 的程度與OD600、氨氮和總氮的降解率有關(guān)，細(xì)菌生長(zhǎng)量越大，氨氮與總氮的降解率也越大， pH升高的幅度也越大，不同菌種對(duì)碳源的利用情況不同。
[004引1.3解藻酸弧菌HA2的鑒定
[0049] (1)菌落形態(tài)特征:將HA2菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2地，呈現(xiàn)為黃色、圓形、凸 起、表面濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、直徑約為2-3mm的菌落，鏡檢其細(xì)胞為卵圓形。鑒定證實(shí)該菌 株為解藻酸弧菌，與生化鑒定結(jié)果一致。
[0050] (2)通過半自動(dòng)鑒定儀(ATB1525)對(duì)HA2的32項(xiàng)生化反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定并自動(dòng)比對(duì)，初 步鑒定HA2為Vibrio alginolyticus(可信度:96.1% )。將菌株交予送往英俊生物測(cè)序公司 測(cè)定16S rRNA序列，測(cè)序后獲得長(zhǎng)度為1385bp的片段，通過化AST比對(duì)分析，其與Vibrio alginol^kus ATCC(NR_044825.1)的16S rRNA序列具有99%相似性。
[0化1] (3)將HA2菌株命名為解藻酸弧菌HA2(Vibrio alginol}rticus)，已于2014年04月 30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，其保藏編號(hào)為CGMCC 9115。
[0052] 實(shí)施例2(解藻酸弧菌HA2微生物制劑降解水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水實(shí)驗(yàn)）
[0053] 將解藻酸弧菌HA2活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)液體發(fā)酵，離屯、收集菌泥，加入凍干保護(hù)劑， 真空冷凍干燥制成的菌粉。實(shí)驗(yàn)分為2組，對(duì)照化1)生化濾器中不添加任何菌劑，飼喂基礎(chǔ) 日糧，1個(gè)集水槽1個(gè)生化濾器帶3個(gè)養(yǎng)殖槽;B組水中添加 HA2菌劑，飼喂基礎(chǔ)日糧，1個(gè)集水 槽1個(gè)生化濾器帶3個(gè)養(yǎng)殖槽。對(duì)照組生物濾器中注入自來水，實(shí)驗(yàn)組中按體積比1%注入菌 液，并注入一定量的培養(yǎng)液，其余用曝氣自來水補(bǔ)充。在試驗(yàn)開始前靜置3天。實(shí)驗(yàn)開始后每 天與于早9點(diǎn)晚5點(diǎn)W體重的1%喂食，晚上喂食后將養(yǎng)殖槽的糞便析出（此處相當(dāng)于弧形 篩）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)在自然條件下進(jìn)行，每24h測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 集水槽中氨氮、亞硝態(tài)氮、溫度、抑的含量，結(jié)果如圖5~10所示。
[0054] 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，HA2菌粉對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的氨氮有較強(qiáng)的降解作用，與對(duì)照相 比，使用菌株后都能不同程度的提高水體的pH值，使用菌株后亞硝態(tài)氮濃度的降低與氨氮 濃度的降低是同步的，且與對(duì)照相比硝態(tài)氮濃度和總氮濃度降低，使用該菌株后能縮短掛 膜時(shí)間，生物濾器達(dá)到穩(wěn)定成熟所需要的時(shí)間為24d。
[0055] W上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用W限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種解藻酸弧菌，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9115。2. -種權(quán)利要求1所述解藻酸弧菌用于水體脫氮的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述水體脫氮是降解水體中的氨氮。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述水體是養(yǎng)殖水體。5. -種權(quán)利要求1所述解藻酸弧菌用于制備水體脫氮菌劑的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述制備包括以下步驟:培養(yǎng)所述解藻酸弧 菌，收集菌體，冷凍干燥，即得到所述水體脫氮菌劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述水體脫氮菌劑中菌體含量為IX 109~ 2.7X109cfu/g〇
【文檔編號(hào)】C02F103/20GK106047742SQ201610242070
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】陳成勛, 孫朦朦, 路斌, 孫學(xué)亮, 李連星, 王慶奎, 邢克智
【申請(qǐng)人】天津農(nóng)學(xué)院