一種利用甲殼素合成pha的菌株和合成方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用甲殼素合成PHA的菌株，假單胞菌YJY25，保藏號為：CCTCC M 2016075，保藏時間：2016.02.28；合成方法包括利用甲殼素復(fù)合酶降解甲殼素形成酶解產(chǎn)物的步驟、以酶解產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)假單胞菌YJY25的步驟和收集假單胞菌YJY25發(fā)酵產(chǎn)物獲得PHA的步驟；PHA除了作為生物塑料，還可以通過合成水處理制劑用于廢水處理。通過低成本的方法得到可降解的生物塑料，解決了目前難降解的塑料對環(huán)境造成極大污染和可降解生物塑料造價成本高的現(xiàn)狀，并將其利用于廢水的脫氮處理工藝，并對甲殼素這一低價、可再生生物資源的合理利用。CCTCC NO: M 201607520160228
【專利說明】
-種利用甲亮素合成PHA的菌株和合成方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及利用復(fù)合酶降解甲殼素并W此作為聚徑基脂肪酸醋 (Polyhy化〇巧日化anoates，PHA)合成菌的碳源發(fā)酵合成PHA，設(shè)及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，是 對低廉生物資源的二次優(yōu)化利用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，W石油為原料生產(chǎn)的塑料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)中。然而廢棄塑料帶來 的"白色污染"和垃圾圍城現(xiàn)象W及塑料燃燒產(chǎn)生的大氣污染、水污染嚴(yán)重地影響了人們的 生活環(huán)境。隨著塑料產(chǎn)量的不斷增長和應(yīng)用領(lǐng)域的日益擴大，塑料廢棄物對環(huán)境的污染也 日趨嚴(yán)重，作為保護環(huán)境的重要措施之一，降解塑料的開發(fā)成為世界熱點問題。而生物可降 解塑料作為W石油為原料生產(chǎn)的塑料的替代品受到了廣泛的關(guān)注。聚徑基脂肪酸醋(PHA) 是一類微生物在體內(nèi)積累碳源形成的胞內(nèi)聚合物。他是許多細菌在生長不平衡條件下合成 的碳源儲藏性顆粒，它除具有與傳統(tǒng)塑料相近的性質(zhì)，還兼有具有良好的物理特性、生物相 容性和生物可降解性，在自然生態(tài)環(huán)境中可完全降解為水和二氧化碳，環(huán)境污染小，被認為 是未來替代化工塑料的重要物質(zhì)，在解決環(huán)境污染和能源緊張方面具有很大的潛力。目前， 工業(yè)生產(chǎn)PHA多W純菌發(fā)酵，包括產(chǎn)堿桿菌、固氮菌、假單胞菌W及重組大腸桿菌等。但純菌 發(fā)酵需使用優(yōu)質(zhì)底物，W及滅菌等發(fā)酵控制工藝造成PHA生產(chǎn)成本昂貴，其市場價格大約為 20美元/千克，高于傳統(tǒng)塑料的5-10倍，高昂的成本限制了其廣泛應(yīng)用。在微生物發(fā)酵合成 PHA的所有發(fā)酵條件因素中，碳源是一個重要因素，其成本占到總成本的28-50%。為此， 可W通過使用廉價發(fā)酵可大大降低PHA的生產(chǎn)成本。因此利用來源廣泛、價格低廉，W其為 碳源又可W降低PHA的生產(chǎn)成本，使PHA運種可降解的生物塑料獲得更廣泛的應(yīng)用，從而減 少白色污染，實現(xiàn)資源的有效再利用是一項迫在眉睫的任務(wù)。
[0003] 甲殼素又名甲殼質(zhì)、幾下質(zhì)及殼多糖等，是由N-乙酷氨基-D-葡萄糖單體通過0-1， 4糖巧鍵連接而成的直鏈高分子化合物，不僅廣泛存在于郵、蟹等甲殼類海洋節(jié)肢動物中， 而且也大量存在于低等生物菌類、昆蟲外殼、藻類細胞中。每年其生物合成量約為100億噸， 產(chǎn)量僅次于纖維素，是地球上第二大再生資源，其中海洋生物的生成量為10億噸W。工業(yè)上 用來生產(chǎn)甲殼素的主要原料是水產(chǎn)加工廠廢棄的郵蟹殼等。高分子量的甲殼素水溶性差， 溶于弱酸性介質(zhì)，粘度高，不易吸收，很難被生物利用，導(dǎo)致運些可再生資源并沒有得到大 規(guī)模的回收再利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用甲殼素降解后的酶解產(chǎn)物，作為產(chǎn)PHA的假單胞 菌YJY25碳源，合成PHA的技術(shù)，通過低成本的方法得到可降解的生物塑料，解決了目前難降 解的塑料對環(huán)境造成極大污染和可降解生物塑料造價成本高的現(xiàn)狀，并將其利用于廢水的 脫氮處理工藝，并對甲殼素運一低價、可再生生物資源的合理利用。
[0005] 本發(fā)明所用到的假單胞菌YJY25(Pseudomonas SP. YJY25)為
【申請人】分離所獲，保 藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為：CCTCC NO:M 2016075，保藏時間：2016.02.28，能夠利用甲殼素酶解后的酶解產(chǎn)物，合成PHA。
[0006] 利用甲殼素合成PHA的方法，大致包括利用甲殼素復(fù)合酶降解甲殼素形成酶解產(chǎn) 物的步驟、W酶解產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)假單胞菌YJY25的步驟和收集假單胞菌YJY25發(fā)酵產(chǎn)物 獲得PHA的步驟。
[0007] 具體的操作步驟為：（1)將甲殼素制備成膠體溶液，并調(diào)節(jié)pH值為5.0~6.5，加入5~ 20%的復(fù)合酶制劑，于35~60°C搖床進行酶降解，降解時間1~lOh，降解產(chǎn)物經(jīng)絮凝，沉淀，過 濾即得酶解產(chǎn)物;（2)將假單胞菌YJY25進行活化，然后接種到W步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn) 物為碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；（3)步驟(2)得到的培養(yǎng)物經(jīng)細胞壁破碎、絮凝、過濾沉淀、 洗涂干燥，即可獲得PHA。
[0008] 作為更加優(yōu)選，所述步驟(2)中，步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物作為假單胞菌YJY25 培養(yǎng)的唯一碳源。
[0009] 作為優(yōu)選，所述步驟(2)中，假單胞菌YJY25在W步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物為碳 源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度25~35°C，pH為7.0~7.5，培養(yǎng)時間為48-6化。
[0010] 作為優(yōu)選，假單胞菌YJY25的活化條件為30~35°C，搖床200~25化/min,活化24~ 4化;活化后菌液W1.~2.0%(v%)的接種量接入含酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)中進行培養(yǎng)。
[0011] 上述得到的PHA除了作為生物塑料，還可W通過合成水處理制劑用于廢水處理，尤 其是對廢水的脫氮處理，尤其是用于處理養(yǎng)殖廢水中的脫氮處理。
[0012] 所述的水處理制劑的組分包括50~lOOg塑形劑、300~500評HA粉末、50~lOOg增效 劑。通過在100~150°C條件下造粒形成。
[0013] 通過實施上述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點： 1. 本發(fā)明利用來源廣泛、價格低廉、可生物降解的甲殼素作為原料合成可生物降解的 優(yōu)質(zhì)材料PHA，既降低了生產(chǎn)成本又減少了其他合成原料的二次污染，也是對再生的能源再 次利用； 2. 本發(fā)明生產(chǎn)PHA生產(chǎn)工藝簡單，方便可控，且PHA合成產(chǎn)量較高，具有極廣工業(yè)和開發(fā) 前景； 3. 本發(fā)明還提供了 PHA除了作為優(yōu)質(zhì)材料之外的新功能，用于廢水處理，處理效果好， 水處理成本低，無副作用，將甲殼素充分利用。
【具體實施方式】
[0014] 為了更清楚的理解本發(fā)明制備過程，W下通過發(fā)明人給出的依本發(fā)明技術(shù)方案所 完成的具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，運些僅是本發(fā)明較好的實施例，但不 限于運些實施例。
[0015] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0016] 實施例1: 一種利用甲殼素合成PHA的方法，具體操作方法包括:（1)將甲殼素制備成膠體溶液，并 調(diào)節(jié)pH值為6.0,加入5%的復(fù)合酶制劑，于60°C搖床進行酶降解，降解時間化，降解產(chǎn)物經(jīng)絮 凝，沉淀，過濾即得酶解產(chǎn)物；（2)將假單胞菌YJY25在種子培養(yǎng)基中進行活化，活化條件為 30°C，搖床20化/min，活化4她;活化后菌液W1.0%(V%)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)中進行培 養(yǎng)，然后接種到w步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為溫度35°C，抑為7.0,培養(yǎng)時間為4她；（3)步驟(2)得到的培養(yǎng)物(也即發(fā)酵產(chǎn)物)經(jīng)細胞壁 破碎、絮凝、過濾沉淀、洗涂干燥，即可獲得PHA。
[0017]所得到的PHA用于各種塑料制品的原料。
[001引實施例2: 一種利用甲殼素合成PHA的方法，具體操作方法包括:（1)將甲殼素制備成膠體溶液，并 調(diào)節(jié)pH值為5.0,加入15%的復(fù)合酶制劑，于50°C搖床進行酶降解，降解時間lOh，降解產(chǎn)物經(jīng) 絮凝，沉淀，過濾即得酶解產(chǎn)物；（2)將假單胞菌YJY25在種子培養(yǎng)基中進行活化，活化條件 為35°C，搖床25化/min，活化2地;活化后菌液W2.0%( V%)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)中進行 培養(yǎng)，然后接種到W步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件為溫度30°C，pH為7.2，培養(yǎng)時間為50h; (3)步驟(2)得到的培養(yǎng)物經(jīng)細胞壁破碎、絮凝、過 濾沉淀、洗涂干燥，即可獲得PHA。
[0019]所得到的PHA用于養(yǎng)殖廢水的脫氮處理。先制備成水處理制劑，水處理制劑包括 80g塑形劑、420評HA粉末、1 OOg增效劑，各組分混合在150°C條件下造粒形成。
[0020] 實施例3: 一種利用甲殼素合成PHA的方法，具體操作方法包括:（1)將甲殼素制備成膠體溶液，并 調(diào)節(jié)抑值為6.5，加入20%的復(fù)合酶制劑，于35 °C搖床進行酶降解，降解時間化，降解產(chǎn)物經(jīng) 絮凝，沉淀，過濾即得酶解產(chǎn)物；（2)將假單胞菌YJY25在種子培養(yǎng)基中進行活化，活化條件 為32 °C，搖床23化/min，活化35h;活化后菌液W1.5%( V%)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)中進行 培養(yǎng)，然后接種到W步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件為溫度25 °C，pH為7.5，培養(yǎng)時間為60h; (3 )步驟(2 )得到的培養(yǎng)物經(jīng)細胞壁破碎、絮凝、過 濾沉淀、洗涂干燥，即可獲得PHA。
[0021] 所得到的PHA先制備成水處理制劑，利用水處理制劑可W進行廢水處理。水處理制 劑包括60g塑形劑、500評HA粉末、80g增效劑，各組分混合在100°C條件下造粒形成。
[0022] 實施例4: 一種利用甲殼素合成PHA的方法，具體操作方法包括:（1)將甲殼素制備成膠體溶液，并 調(diào)節(jié)抑值為6.5，加入20%的復(fù)合酶制劑，于35 °C搖床進行酶降解，降解時間化，降解產(chǎn)物經(jīng) 絮凝，沉淀，過濾即得酶解產(chǎn)物；（2)將假單胞菌YJY25在種子培養(yǎng)基中進行活化，活化條件 為32 °C，搖床23化/min，活化35h;活化后菌液W1.5%( V%)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)中進行 培養(yǎng)，然后接種到W步驟(1)中所得到的酶解產(chǎn)物為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件為溫度25 °C，pH為7.5，培養(yǎng)時間為60h; (3 )步驟(2 )得到的培養(yǎng)物經(jīng)細胞壁破碎、絮凝、過 濾沉淀、洗涂干燥，即可獲得PHA。
[0023] 所得到的PHA先制備成水處理制劑，利用水處理制劑可W進行廢水處理。水處理制 劑包括50g塑形劑、300評HA粉末、50g增效劑，各組分混合在130°C條件下造粒形成。
[0024] 實施例5: 水處理制劑包括70g塑形劑、430評HA粉末、lOOg增效劑，各組分混合在140°C條件下造 粒形成。
[0025] 甲魚污水W-定的流速從反應(yīng)器1進水，反應(yīng)器1為硝化處理池，主要為毛刷掛膜 材料，之后水勻速進入反應(yīng)器2,即加有水處理制劑的處理器，處理水經(jīng)微型累再循環(huán)至甲 魚污水室，整個載水量為65升，水累調(diào)節(jié)為24小時循環(huán)一次。反應(yīng)器1溫度為室溫，反應(yīng)器2 溫度控制為30°C。處理結(jié)果如表1:
由表可知:經(jīng)過5天的處理，系統(tǒng)中氨氮的去除率達90.9%，亞硝酸鹽氮的去除率92.6%， 總氮的去除率為93.7%。
【主權(quán)項】
1. 一種利用甲殼素合成PHA的菌株，名稱為：假單胞菌YJY25( Pseuc/offio/jas sp . YJY25);保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC N0:M 2016075,保藏日期 為：2016年02月28日。2. -種利用甲殼素合成PHA的方法，其特征在于，包括利用甲殼素復(fù)合酶降解甲殼素形 成酶解產(chǎn)物的步驟、以酶解產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)假單胞菌YJY25的步驟和收集假單胞菌YJY25 發(fā)酵產(chǎn)物獲得PHA的步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，具體操作方法包括：（1)將甲殼素制備成膠 體溶液，并調(diào)節(jié)pH值為5.0~6.5，加入5~20%的復(fù)合酶制劑，于35~60 °C搖床進行酶降解，降解 時間1~10h，降解產(chǎn)物經(jīng)絮凝，沉淀，過濾即得酶解產(chǎn)物；（2)將假單胞菌YJY2進行活化，然后 接種到以步驟（1)中所得到的酶解產(chǎn)物為碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；（3)步驟(2)得到的培 養(yǎng)物經(jīng)細胞壁破碎、絮凝、過濾沉淀、洗滌干燥，即可獲得PHA。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，步驟（1)中所得到的酶解 產(chǎn)物作為假單胞菌YJY25培養(yǎng)的唯一碳源。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，假單胞菌YJY25的培養(yǎng)條 件為溫度25~35°C，pH為7.0~7.5，培養(yǎng)時間為48-60h。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，假單胞菌YJY25的活化條件為30~35°C，搖 床200~250r/min，活化24~48h;活化后菌液以1.0~2.0%( v%)的接種量接入含酶解產(chǎn)物的培 養(yǎng)中進行培養(yǎng)。7. 如權(quán)利要求2所述的方法制備得到的PHA的應(yīng)用，其特征在于，用于廢水的脫氮處理。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，通過合成水處理制劑用于廢水的脫氮處 理。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水處理制劑的組分包括50~100g塑形 劑、300~500gPHA粉末、50~100g增效劑。
【文檔編號】C02F1/00GK106047741SQ201610122279
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年3月4日 公開號201610122279.X, CN 106047741 A, CN 106047741A, CN 201610122279, CN-A-106047741, CN106047741 A, CN106047741A, CN201610122279, CN201610122279.X
【發(fā)明人】李濤, 姚嘉赟
【申請人】李濤, 姚嘉赟