一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一類既含有線粒體靶向基團(tuán)又含有次氯酸根(ClO?)識(shí)別基團(tuán)的磷光銥配合物探針及其應(yīng)用，屬于有機(jī)光電功能材料技術(shù)領(lǐng)域。該類配合物材料由含肟基團(tuán)的環(huán)金屬配體、金屬中心和含有三苯基膦的線粒體靶向基團(tuán)的N^N配體組成，結(jié)構(gòu)通式如下式所示。該材料合成步驟簡(jiǎn)單、條件溫和，在次氯酸根檢測(cè)、線粒體靶向成像和生物標(biāo)記中有非常好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，具體涉及一類 既含有線粒體靶向基團(tuán)又含有次氯酸根(CKT)識(shí)別基團(tuán)的磷光銥配合物探針及其應(yīng)用，屬 于有機(jī)光電功能材料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子氧是所有耗氧有機(jī)體維持其生命活動(dòng)的必需組分，活性氧物種(R0S)是人體 代謝過(guò)程中產(chǎn)生的分子氧的一種，它包括過(guò)氧化物、羥基、過(guò)氧自由基、過(guò)氧化氫、單線態(tài)的 氧和次氯酸/次氯酸根。人體內(nèi)的活性氧物種R0S主要是通過(guò)線粒體呼吸過(guò)程產(chǎn)生的氧氣， 同時(shí)，也可通過(guò)外部干擾誘導(dǎo)有機(jī)體內(nèi)生成，例如外源性化學(xué)物質(zhì)，傳染劑和紫外線。ROSS 與廣泛的生理和病理過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，炎癥，癌變和神經(jīng)組織衰退性損傷。雖然在正常的 細(xì)胞環(huán)境中產(chǎn)生R0S對(duì)于生命是必須的，但是當(dāng)它們?cè)谕庠葱源碳は律蛇^(guò)量時(shí)，對(duì)有機(jī)體 也是有危害的。過(guò)量的R0S通過(guò)生物分子的氧化引起的氧化應(yīng)激，例如，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的氧化作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0003] R0S調(diào)節(jié)各種各樣的生理過(guò)程。次氯酸(H0C1)，一個(gè)生物學(xué)意義的活性氧，是在活 化白細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)髓過(guò)氧化酶催化過(guò)氧化氯離子產(chǎn)生的。在自然防御中，次氯酸也是一種重 要的殺菌劑。然而，次氯酸水平的異常與許多炎癥相關(guān)的疾病有著密切的聯(lián)系，包括心血管 疾病，人體紅細(xì)胞的損傷，肺病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥。所以，次氯酸的檢測(cè)是非常重要的。 目前，已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)次氯酸的方法，例如，電解法，電勢(shì)法，分光光度法，化學(xué)發(fā)光檢 測(cè)等。Weiying Lin組合成了一種檢測(cè)CKT的比率熒光探針，當(dāng)作用于分析物時(shí)，熒光發(fā)射 比率（15〇9/1 439)的可從〇.28增加到2.74，且具有較高的選擇性（(^11^1^.入，2009，15， 2305-2309)。此探針是基于熒光信號(hào)的檢測(cè)。相比于熒光信號(hào)，磷光信號(hào)檢測(cè)具有以下優(yōu) 勢(shì):具有大的Stokes位移、可見(jiàn)光激發(fā)、良好的光穩(wěn)定性、長(zhǎng)的發(fā)射壽命、高的量子效率和發(fā) 射波長(zhǎng)易調(diào)節(jié)等。我們課題組已開(kāi)發(fā)出基于磷光信號(hào)檢測(cè)的次氯酸根探針（CN 201310525077.6)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)次氯酸根的磷光信號(hào)檢測(cè)。
[0004] 不同的活性氧對(duì)各種疾病的致病機(jī)理作用不同，為了更加深入的研究某種活性氧 物種對(duì)疾病的作用機(jī)制，這就要求廣大科研工作者設(shè)計(jì)出能夠?qū)Ｒ恍詸z測(cè)某種活性氧的熒 光分子探針。
[0005] 線粒體是細(xì)胞中的"能量加工廠"，對(duì)細(xì)胞存亡起著至關(guān)重要的作用。如果線粒體 機(jī)能發(fā)生紊亂，就會(huì)引發(fā)一系列的疾病，例如:代謝紊亂和某些癌癥。線粒體也是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn) 生活性氧的重要部位，同樣，當(dāng)這些活性氧的產(chǎn)生發(fā)生紊亂的時(shí)候也會(huì)產(chǎn)生一系列的疾病， 如:癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病、神經(jīng)退行性疾病等等。因此開(kāi)發(fā)出能特定實(shí)現(xiàn)線粒體中次 氯酸根檢測(cè)的探針是非常重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有線粒體靶向功能的磷光銥 配合物探針，給出它們的制備方法，并提出這類配合物在次氯酸根檢測(cè)、細(xì)胞成像以及生物 標(biāo)記中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 為了解決上述其中一個(gè)技術(shù)問(wèn)題提出的技術(shù)方案是:本發(fā)明涉及具有線粒體靶向 功能的磷光銥配合物探針，其環(huán)金屬配體上含有次氯酸根(CKT)識(shí)別基團(tuán)肟基(C = N-〇H)， 輔助N~N配體上含有線粒體靶向基團(tuán)三苯基膦，可以用于線粒體的靶向成像以及其中的次 氯酸根檢測(cè)；
[0008] 所述的銥配合物探針具有如下結(jié)構(gòu)通式：
[0010] 其中：
jSl-lO的正整數(shù)。
[0011] -種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的制備方法，該制備方法的 合成路線如下：
S
[0013] 其中，
η為1-10的正整數(shù)。
[0014] 具體是在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，
與三水合三氯化銥在2-乙氧基乙醇/ 水(3:1，v: v)混合液中110 °C密閉反應(yīng)24小時(shí)得到相應(yīng)的銥二氯橋化合物;再將得到的銥二 氯橋化合物與化合物2在二氯甲烷/甲醇(2:1，v:v)混合液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下40°C密閉反應(yīng)4小 時(shí)，冷卻至室溫后加入六氟磷酸鉀繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，分離提純得到含有醛基(CHO)的銥配合 物3;再將含有醛基的銥配合物再與鹽酸羥胺在乙醇/三乙胺混合液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下60°C密閉 反應(yīng)3小時(shí)，分離提純得到含有肟基團(tuán)（C = N-〇H)的配合物4;最后將4和三苯基磷溶于DMF 中，在氮?dú)鈿夥罩衛(wèi)〇〇°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，再經(jīng)過(guò)柱層析提純得到 最終的配合物探針5.
[0015] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 應(yīng)用于次氯酸根檢測(cè)。
[0016] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 應(yīng)用于細(xì)胞成像和生物標(biāo)記。
[0017] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 該材料應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體的標(biāo)記。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明合成的材料用作CKT磷光探針，在CKT存在下磷光發(fā)射顯著增強(qiáng)，為turnon 型磷光探針，檢測(cè)效果顯著。本發(fā)明制備的磷光探針材料對(duì) CKT 具有高的選擇性，并且響 應(yīng)快。
[0020] 本探針材料具有低生物毒性，具有一定的水溶性，且容易進(jìn)入細(xì)胞線粒體中，使得 這類探針可用于細(xì)胞內(nèi)線粒體中CKT檢測(cè)，這對(duì)深入研究CKT在生物體體內(nèi)的生理和毒理 作用具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0022] 圖1.為實(shí)施例1中配合物Irl的CH30H/H20混合溶液的磷光發(fā)射光譜對(duì)CKT的響應(yīng) 性。
[0023] 圖2.為實(shí)施例1中配合物Irl對(duì)C1(T的選擇性示意圖。
[0024]圖3.為實(shí)施例1中配合物Irl的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0025] 圖4.為實(shí)施例1中配合物Irl與商業(yè)線粒體染料的共染細(xì)胞成像。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]為了更好地理解本發(fā)明專利的內(nèi)容，下面通過(guò)具體的實(shí)例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的 技術(shù)方案。但這些實(shí)施實(shí)例并不限制本發(fā)明。
[0028] 實(shí)施例1:當(dāng)n = 2
時(shí)，探針I(yè)rl的制備：
[0029]合成路線如下所示：
[0031] 化合物2a的制備：在反應(yīng)瓶中加入氫氧化鉀51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol，并加入離子液體20ml?；旌衔镱A(yù)先攪拌5分鐘后，加入1，6-二溴己燒8ml，在室溫 下攪拌反應(yīng)5h。反應(yīng)完成后，用乙醚萃取三次，合并油相，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑。得到的 粗產(chǎn)物用柱層析進(jìn)行分離，淋洗液為石油醚：乙酸乙酯= 3:1，最后得到無(wú)色油狀液體2.2g， 產(chǎn)率60%</Η NMR(400MHz，CDCl3)j = 8.70(d，J = 4.80Hz，lH)，8.41(d，J = 7.97Hz，lH)， 7.88-7.33(m，2H)，7.46-7.44(m，lH)，7.37-7.30(m，3H)，4.84(t，J=7.6Hz，2H)，3.38(t，J =6·8Hz，2H)，1·95-1·88(m，2H)，1·86-1·79(m，2H)，1·53-1·44(m，2H)，1·42-1·35(m，2H)。
[0032] 配合物3a的制備:稱取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè) 反應(yīng)體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進(jìn)反應(yīng)體系中，升溫至110°C，磁 力攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將體系冷卻至室溫，過(guò)濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固 體產(chǎn)物即為吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物。稱取吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物（lmm 〇 1 )、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用 氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應(yīng)5小時(shí)后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續(xù)攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反 應(yīng)結(jié)束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結(jié)晶，得到固體產(chǎn)物即為銥配合物3a。產(chǎn) 率：64% </H NMR(400MHz，DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz，2H)，8.64((1, J = 8.2Hz，2H)，8.47((1, J = 8.1Hz,lH) ,8.37 (d,J = 8.8Hz,lH) ,8.33( td,J = 8.2,1.5Ηζ,1Η) ,8.20(d,J = 8.0Hz, lH),8.18(dd ,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH), 8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t ,J = 7.9Hz,lH),7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH),6.73(d ,J = 1.2Hz,lH) ,6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6·8Hz，2H)，1·98-1·84(m，2H)，1·75-1·63(m，2H)，1·30-1·17(m，2H)·
[0033] 配合物4a的制備:稱取銥配合物3a( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。注入 5mL蒸過(guò)的乙醇溶液，5mmo 1蒸過(guò)的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮提純。得 到紅色固體產(chǎn)物即為銥配合物4a。產(chǎn)率：81% ,Η MMR(400MHz，DMS0) :δ = 11.13(s，2H)， 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H)，1.30-1.17(m，2H)〇
[0034] 配合物Irl的制備：將4a(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮?dú)鈿夥罩?l〇〇°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過(guò)柱子提純，得到最終 產(chǎn)物Irl。產(chǎn)率60%</Η MMR(400MHz，DMS0) :S = 11.13(s，2H)，10.36(s，2H)，8.64(d，J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0035] 探針I(yè)rl的發(fā)射光譜對(duì)C10_的響應(yīng)性：：
[0036] 將銥配合物&1溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10一的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 C1(T后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使C1(T與銥配 合物Irl充分反應(yīng)，隨后測(cè)試其熒光發(fā)射光譜，如圖1所示。在583nm處，銥配合物Irl溶液本 身發(fā)光很弱，隨著CKT的加入，銥配合物Irl溶液的熒光光譜立刻發(fā)生了變化，伴隨著CKT滴 加濃度的升高，銥配合物Irl的熒光光譜藍(lán)移并在575nm處的熒光強(qiáng)度逐漸升高。當(dāng)CKT的 滴加濃度當(dāng)量達(dá)到30eq.時(shí)，滴定達(dá)到終點(diǎn)，再繼續(xù)滴加 CKT，光譜則不再發(fā)生變化。
[0037] 探針I(yè)rl在溶液中對(duì)C10_的選擇性實(shí)驗(yàn)：
[0038] 配制1(^11的配合物&1溶液(〇130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2))，移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中，加入過(guò)量的（超過(guò)200倍當(dāng)量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：12、!12〇2、似(：10 3、似勵(lì)2、他(：10溶液，分別測(cè)其發(fā)射光譜。測(cè)試結(jié)果如圖2所 示，其他離子均無(wú)明顯影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：材料對(duì)CKT有較好的選擇性。
[0039] 配合物Irl的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：
[0040]將消化后的細(xì)胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個(gè)/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。吸除不新鮮的培養(yǎng)液后用不同濃度&1(1、5、10、25、5(^1〇的細(xì)胞 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)候終止培養(yǎng)。吸除 培養(yǎng)液，每孔加入150yL DMS0,搖床震蕩10分鐘后使用酶標(biāo)儀測(cè)試0D570。
[00411 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在配合物的濃度為1~50μΜ時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)候的 細(xì)胞存活率均大于80%，證明該配合物具有較低的細(xì)胞毒性，可用于細(xì)胞成像。
[0042] 配合物Irl與商業(yè)線粒體染料Mito-Track Green對(duì)活細(xì)胞線粒體的共染實(shí)驗(yàn)：
[0043] 本發(fā)明采用的細(xì)胞均為人宮頸癌HeLa細(xì)胞。將消化后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液后用 Irl(5yM)的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞12小時(shí)。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細(xì)胞培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0044] 配合物Irl與商業(yè)線粒體染料Mito-Tracker Green的細(xì)胞共染成像圖如圖4所示。 Mito-Tracker Green由488nm藍(lán)光激發(fā)，收集500_540nm綠光發(fā)射，Ir 1由405nm藍(lán)紫光激發(fā)， 收集560-640nm紅光發(fā)射。將線粒體染料Mito-Tracker Green的發(fā)射區(qū)域與配合物Ir 1的發(fā) 射區(qū)域向疊加，發(fā)現(xiàn)二者重合度高，由計(jì)算可得，共染系數(shù)為0.85,證明本發(fā)明的配合物Irl 能夠靶向活細(xì)胞線粒體，可用于活細(xì)胞線粒體標(biāo)記。
[0045] 實(shí)施例2:當(dāng)n = l，
!l時(shí)，探針I(yè)r2的制備：
[0046] 合成路線如下所示：
[0048]化合物2b的制備：在反應(yīng)瓶中加入氫氧化鉀51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol，并加入離子液體20ml?；旌衔镱A(yù)先攪拌5分鐘后，加入1，4-二溴丁烷8ml，在室溫 下攪拌反應(yīng)5h。反應(yīng)完成后，用乙醚萃取三次，合并油相，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑。得到的 粗產(chǎn)物用柱層析進(jìn)行分離，淋洗液為石油醚：乙酸乙酯= 3:1，最后得到無(wú)色油狀液體2.2g， 產(chǎn)率62%</H NMR(400MHz，CDCl3)j = 8.70(d，J = 4.80Hz，lH)，8.41(d，J = 7.97Hz，lH)， 7.88-7.33(m，2H)，7.46-7.44(m，lH)，7.37-7.30(m，3H)，4.86(t，J=7.6Hz，2H)，3.39(t，J =6.8Hz，2H)，1.92-1.886(m，2H)，1.84-1.78(m，2H)。
[0049] 配合物3b的制備:稱取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè) 反應(yīng)體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進(jìn)反應(yīng)體系中，升溫至110°C，磁 力攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將體系冷卻至室溫，過(guò)濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固 體產(chǎn)物即為吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物。稱取吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物（lmm〇 1)、2b (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用 氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應(yīng)5小時(shí)后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續(xù)攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反 應(yīng)結(jié)束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結(jié)晶，得到固體產(chǎn)物即為銥配合物3b。產(chǎn) 率：71% ,Η ΜΚΗΟΟΜΗζ,ΟΜΒΟ)1!! NMR(400MHz，DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz，2H)，8.64((1, J = 8.2Hz,2H),8.47(d ,J = 8.1Hz,lH),8.37(d ,J = 8.8Hz,lH),8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz,lH), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m,2H).
[0050] 配合物4b的制備:稱取銥配合物3b( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。注入 5mL蒸過(guò)的乙醇溶液，5mmo 1蒸過(guò)的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮提純。得 到紅色固體產(chǎn)物即為銥配合物4a。產(chǎn)率：81% ,Η MMR(400MHz，DMS0) :δ = 11.13(s，2H)， 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H)〇
[0051 ] 配合物Ir2的制備：將4b(0 · 2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮?dú)鈿夥罩?l〇〇°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過(guò)柱子提純，得到最終 產(chǎn)物Ir2。產(chǎn)率60%</Η MMR(400MHz，DMS0) :S = 11.13(s，2H)，10.36(s，2H)，8.64(d，J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0052] 探針I(yè)r2的發(fā)射光譜對(duì)C10_的響應(yīng)性：：
[0053] 將銥配合物&2溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10一的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 C1(T后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使C1(T與銥配 合物Ir2充分反應(yīng)，隨后測(cè)試其熒光發(fā)射光譜。在583nm處，銥配合物Ir2溶液本身發(fā)光很弱， 隨著CKT的加入，銥配合物Ir2溶液的熒光光譜立刻發(fā)生了變化，伴隨著CKT滴加濃度的升 高，銥配合物Ir2的熒光光譜藍(lán)移并在575nm處的熒光強(qiáng)度逐漸升高。當(dāng)CKT的滴加濃度當(dāng) 量達(dá)到30eq.時(shí)，滴定達(dá)到終點(diǎn)，再繼續(xù)滴加 CKT，光譜則不再發(fā)生變化。
[0054] 探針I(yè)r2在溶液中對(duì)C10_的選擇性實(shí)驗(yàn)：
[0055] 配制ΙΟμΜ的配合物Ir2溶液(CH30H/H20(v/v，2:1，pH 7 · 2))，移取2 · 5mL所配化合物 溶液于比色皿中，加入過(guò)量的（超過(guò)200倍當(dāng)量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：1 2、!12〇2、似(：103、似勵(lì)2、他(：10溶液，分別測(cè)其發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明 ：材 料對(duì)CKT有較好的選擇性。
[0056] 配合物Ir2的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：
[0057]將消化后的細(xì)胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個(gè)/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。吸除不新鮮的培養(yǎng)液后用不同濃度&2(1、5、10、25、5(^1〇的細(xì)胞 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)候終止培養(yǎng)。吸除 培養(yǎng)液，每孔加入150yL DMS0，搖床震蕩10分鐘后使用酶標(biāo)儀測(cè)試0D570 JTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明在配合物的濃度為1~50μΜ時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)候的細(xì)胞存活率均大于80 %，證明該配 合物具有較低的細(xì)胞毒性，可用于細(xì)胞成像。
[0058] 配合物Ir2與商業(yè)線粒體染料Mito-Track Green對(duì)活細(xì)胞線粒體的共染實(shí)驗(yàn)： [0059]本發(fā)明采用的細(xì)胞均為人宮頸癌HeLa細(xì)胞。將消化后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液后用 Ir2(5yM)的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞12小時(shí)。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細(xì)胞培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0000] 配合物Ir2與商業(yè)線粒體染料Mito-Tracker Green的細(xì)胞共染成像結(jié)果表明本發(fā) 明的配合物Ir3能夠靶向活細(xì)胞線粒體，可用于活細(xì)胞線粒體標(biāo)記。
[0061 ] 實(shí)施例3:當(dāng)n = 2，
I時(shí)，探針I(yè)r3的制備：
[0062]合成路線如下所示：
[0064] 對(duì)醛基苯喹啉（lc)的合成:在250mL兩口瓶中加入2-氯喹啉(818mg，5.Ommol)，對(duì) 醛基苯硼酸(750mg，5.0mmol)和四（三苯基膦)鈀催化劑(200mg)。體系密封，除氧充氮?dú)獗?護(hù)。然后用注射器加入鼓氮除氧半小時(shí)之后的溶劑甲苯(30mL)，乙醇（10mL)，飽和碳酸鈉水 溶液(10mL)。反應(yīng)時(shí)體系避光，80°C下回流反應(yīng)15小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，體系冷卻到室溫。用 二氯甲烷/水萃取反應(yīng)液3次，收集有機(jī)相，有機(jī)相濃縮，TLC點(diǎn)板，確認(rèn)產(chǎn)物點(diǎn)。粗產(chǎn)物過(guò)柱 提純(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到產(chǎn)物。產(chǎn)率85 %。4 NMR(CDC13，400MHz): δ (ppm) = 1 〇 · 12 (s，lH)，8.35(d，2H)，8.28(d，lH)，8.19(d，lH)，7.93(d，lH)，7.86(d，lH)，7.77(t，lH).
[0065] 配合物3c的制備:稱取對(duì)醛基苯喹啉(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合投入三 頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體 系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進(jìn)反應(yīng)體系中，升溫至110°C，磁力攪拌 反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將體系冷卻至室溫，過(guò)濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固體產(chǎn)物 即為對(duì)醛基苯喹啉銥二氯橋化合物。稱取對(duì)醛基苯喹啉銥二氯橋化合物（lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用 氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應(yīng)5小時(shí)后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續(xù)攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反 應(yīng)結(jié)束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結(jié)晶，得到固體產(chǎn)物即為銥配合物3c。 [00 66] 配合物4c的制備:稱取銥配合物3c( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。注入 5mL蒸過(guò)的乙醇溶液，5mmo 1蒸過(guò)的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮提純。得 到紅色固體產(chǎn)物即為銥配合物4c。
[0067] 配合物Ir3的制備：將4c(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮?dú)鈿夥罩?l〇〇°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過(guò)柱子提純，得到最終 產(chǎn)物Ir3。
[0068] 探針I(yè)r3的發(fā)射光譜對(duì)C10_的響應(yīng)性：：
[0069] 將銥配合物&3溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10_的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 CKT后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使CKT與銥配 合物Ir3充分反應(yīng)，隨后測(cè)試其熒光發(fā)射光譜。在610nm處，銥配合物Ir3溶液本身發(fā)光很弱， 隨著CKT的加入，銥配合物Ir3溶液的熒光光譜立刻發(fā)生了變化，伴隨著CKT滴加濃度的升 高，銥配合物Ir3的熒光光譜藍(lán)移并在603nm處的熒光強(qiáng)度逐漸升高。當(dāng)CKT的滴加濃度當(dāng) 量達(dá)到30eq.時(shí)，滴定達(dá)到終點(diǎn)，再繼續(xù)滴加 CKT，光譜則不再發(fā)生變化。
[0070] 探針I(yè)r3在溶液中對(duì)C10_的選擇性實(shí)驗(yàn)：
[0071] 配制1(^的配合物&3溶液(〇130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2))，移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中，加入過(guò)量的（超過(guò)200倍當(dāng)量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：12、!12〇2、似(：10 3、似勵(lì)2、他(：10溶液，分別測(cè)其發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：材 料對(duì)CKT有較好的選擇性。
[0072] 配合物Ir3的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：
[0073] 將消化后的細(xì)胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個(gè)/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。吸除不新鮮的培養(yǎng)液后用不同濃度&3(1、5、10、25、5(^1〇的細(xì)胞 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)候終止培養(yǎng)。吸除 培養(yǎng)液，每孔加入150yL DMS0，搖床震蕩10分鐘后使用酶標(biāo)儀測(cè)試0D570 JTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明在配合物的濃度為1~50μΜ時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)候的細(xì)胞存活率均大于80 %，證明該配 合物具有較低的細(xì)胞毒性，可用于細(xì)胞成像。
[0074] 配合物Ir3與商業(yè)線粒體染料Mito-Track Green對(duì)活細(xì)胞線粒體的共染實(shí)驗(yàn)：
[0075] 本發(fā)明采用的細(xì)胞均為人宮頸癌HeLa細(xì)胞。將消化后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液后用 Ir3(5yM)的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞12小時(shí)。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細(xì)胞培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0076] 配合物Ir3與商業(yè)線粒體染料Mito-Tracker Green的細(xì)胞共染成像圖結(jié)果表明本 發(fā)明的配合物Ir3能夠靶向活細(xì)胞線粒體，可用于活細(xì)胞線粒體標(biāo)記。
[0077] 實(shí)施例4:當(dāng)n = 2，
I時(shí)，探針I(yè)r4的制備：
[0078]合成路線如下所示：
[0080] 對(duì)醛基苯異喹啉（Id)的合成：在250mL兩口瓶中加入2-氯異喹啉（818mg， 5.0mmol)，對(duì)醛基苯硼酸(750mg，5.0mmol)和四（三苯基膦)鈀催化劑(200mg)。體系密封，除 氧充氮?dú)獗Ｗo(hù)。然后用注射器加入鼓氮除氧半小時(shí)之后的溶劑甲苯(30mL)，乙醇（10mL)，飽 和碳酸鈉水溶液（10mL)。反應(yīng)時(shí)體系避光，80°C下回流反應(yīng)15小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，體系冷 卻到室溫。用二氯甲烷/水萃取反應(yīng)液3次，收集有機(jī)相，有機(jī)相濃縮，TLC點(diǎn)板，確認(rèn)產(chǎn)物點(diǎn)。 粗產(chǎn)物過(guò)柱提純(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到產(chǎn)物。產(chǎn)率85 %。
[0081 ] 配合物3d的制備:稱取對(duì)醛基苯異喹啉(2.5mmol)與IrCh · 3H2〇(lmmol)混合投入 三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng) 體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進(jìn)反應(yīng)體系中，升溫至110°C，磁力攪 拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將體系冷卻至室溫，過(guò)濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固體產(chǎn) 物即為對(duì)醛基苯異喹啉銥二氯橋化合物。稱取對(duì)醛基苯異喹啉銥二氯橋化合物（lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用 氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應(yīng)5小時(shí)后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續(xù)攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反 應(yīng)結(jié)束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結(jié)晶，得到固體產(chǎn)物即為銥配合物3d。 [00 82] 配合物4d的制備:稱取銥配合物3d( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮?dú)?抽真空，循環(huán)往復(fù)三次，最后采用氮?dú)獗Ｗo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系。注入 5mL蒸過(guò)的乙醇溶液，5mmo 1蒸過(guò)的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮提純。得 到紅色固體產(chǎn)物即為銥配合物4d。
[0083] 配合物Ir4的制備：將4d(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮?dú)鈿夥罩?l〇〇°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過(guò)柱子提純，得到最終 產(chǎn)物Ir4。
[0084] 本發(fā)明的不局限于上述實(shí)施例所述的具體技術(shù)方案，凡采用等同替換形成的技術(shù) 方案均為本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，其特征在于其環(huán)金屬配體上 含有次氯酸根(C1CT)識(shí)別基團(tuán)肟基(C = N-〇H)，輔助N~N配體上含有線粒體靶向基團(tuán)三苯基 膦;該銥配合物具有如下結(jié)構(gòu)通式：2. -種如權(quán)利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的制備方 法，其特征在于該制備方法的合成路線如下：具體是在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，^與三水合三氯化銥在2-乙氧基乙醇/水3:1，v: 0昆合液中l(wèi)l〇°C密閉反應(yīng)24小時(shí)得到相應(yīng)的銥二氯橋化合物;再將得到的銥二氯橋化合物 與化合物2在二氯甲烷/甲醇2:1，v: v混合液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下40 °C密閉反應(yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫 后加入六氟磷酸鉀繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，分離提純得到含有醛基(CHO)的銥配合物3;再將含有醛 基的銥配合物再與鹽酸羥胺在乙醇/三乙胺混合液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下60°C密閉反應(yīng)3小時(shí)，分離 提純得到含有肟基團(tuán)（C = N-〇H)的配合物4;最后將配合物4和三苯基磷溶于DMF中，在氮?dú)?氣氛中100°C回流72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后減壓旋蒸除去DMF，再經(jīng)過(guò)柱層析提純得到最終的配 合物探針5。3. -種如權(quán)利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應(yīng)用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物應(yīng)用于次氯酸根檢測(cè)。4. 一種如權(quán)利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應(yīng)用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物應(yīng)用于細(xì)胞成像和生物標(biāo)記。5. -種如權(quán)利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應(yīng)用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物該材料應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體的標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106046059SQ201610398197
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】許文娟, 趙強(qiáng), 楊繼光, 黃維, 劉淑娟, 楊靖, 陳鍵, 狄隆康
【申請(qǐng)人】南京郵電大學(xué)