粘質(zhì)沙雷氏菌rz 21-c6及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株粘質(zhì)沙雷氏菌RZ 21?C6及其應(yīng)用，本發(fā)明所述粘質(zhì)沙雷氏菌RZ21?C6，保藏編號為CGMCCNo.12714。本發(fā)明突變菌株具有底物利用效率高、遺傳穩(wěn)定性高、靈菌紅素產(chǎn)量高的優(yōu)點，其對木糖的利用效果尤佳。在5L發(fā)酵罐中，以木糖為主要成分的農(nóng)殘秸稈水解液廉價生物質(zhì)碳源被開發(fā)用于靈菌紅素生產(chǎn)，多批次發(fā)酵時靈菌紅素產(chǎn)量可達15?20g/L，總還原糖直接被用于靈菌紅素合成的轉(zhuǎn)化率在20％以上。本發(fā)明提供的粘質(zhì)沙雷氏菌常壓室溫等離子體誘變菌株生產(chǎn)靈菌紅素的方法，以及該菌對木糖和農(nóng)殘秸稈水解液的利用可以推進靈菌紅素產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)，可以用于生物醫(yī)藥、生態(tài)環(huán)境治理和農(nóng)業(yè)生防等領(lǐng)域。CGMCC No.1271420160628
【專利說明】
粘質(zhì)沙雷氏菌RZ 21-C6及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株常壓室溫等離子體誘變后的粘質(zhì)沙雷氏 菌高效利用木糖或農(nóng)殘秸桿水解液高產(chǎn)靈菌紅素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈菌紅素是一個天然紅色素家族的總稱，其基本結(jié)構(gòu)是由三個吡咯環(huán)組成的甲氧 基吡咯骨架，分子式為C2QH 25N30,分子量為323.2Da。自1929年Amako等在研究沙雷氏菌生長 時發(fā)現(xiàn)并由Harashima等在1960年首次分離獲得以來，對該物質(zhì)性質(zhì)及生物活性的研究一 直備受關(guān)注。除了作為一種天然的生物染料之外，它的許多生物學活性也被逐漸人們所認 識，包括抗細菌、抗瘧疾、抗真菌和抗原生動物的活性。大量報道還表明其在水體富營養(yǎng)化 的水污染治理和農(nóng)業(yè)生防上也有應(yīng)用價值。隨著近幾年對細胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素 能引起癌細胞的凋亡而對正常細胞的毒性卻很小，是一種良好的抗癌藥物。美國國立癌癥 研究所更是發(fā)現(xiàn)合適濃度的靈菌紅素對人的57種不同腫瘤細胞具有明顯抗性作用。
[0003]靈菌紅素作為一種次級代謝物，其生產(chǎn)主要是通過微生物合成的。自然界中產(chǎn)靈 菌紅素的菌株主要包括粘質(zhì)沙雷氏菌、放線菌、假單胞菌，以及近年來發(fā)現(xiàn)的某些特殊的海 洋細菌等。其中以對粘質(zhì)沙雷氏菌的研究最為廣泛。靈菌紅素產(chǎn)物在粘質(zhì)沙雷氏菌的生物 合成中是通過兩個雙歧途徑完成的，前體物是一個單吡咯前體2-甲基-3-戊基吡咯和一個 雙吡咯前體4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧基乙醛，經(jīng)過縮合酶縮合偶聯(lián)形成線性的三吡咯化 合物靈菌紅素。靈菌紅素的合成是由pig基因簇完成的，該基因簇包括16個基因，其中14個 基因直接負責靈菌紅素及其前體的合成，另外兩個基因負責調(diào)控這一生物合成過程。這表 明靈菌紅素的合成是一個多基因控制，受到多因素影響的復(fù)雜生物過程。
[0004] 目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素的產(chǎn)量千差萬別，文獻報道中產(chǎn)量大多不高于 lg/L，只有少數(shù)突破10g/L的產(chǎn)量。這主要是由于粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的條件影響極 為復(fù)雜。造成靈菌紅素產(chǎn)量差異很大的原因主要來自菌株差異、碳氮源等培養(yǎng)基底物成分、 溫度、pH值、通氣量等。而其中不同的底物和生產(chǎn)菌株本身的差異對色素成分及產(chǎn)量影響最 大。尤其是依賴于菌株自身的特性的粘質(zhì)沙雷氏菌對低值碳源的利用和靈菌紅素的高效合 成方面仍有極大的提升空間。值得一提的是目前尚沒有對木糖做底物合成靈菌紅素的相關(guān) 報道，而木糖主要是作為大自然界最豐富的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要成分木聚糖的單體，開 發(fā)能夠高效利用以木糖為主要成分的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液的遺傳穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)菌 株已經(jīng)成為可再生化學品和能源生物煉制領(lǐng)域的研究熱點。
[0005] 微生物的誘變育種因具有研究條件和技術(shù)要求不高、簡便快捷、效果顯著的特點， 成為實驗室和企業(yè)最常用的方法之一。對粘質(zhì)沙雷氏菌進行誘變育種以提高靈菌紅素的產(chǎn) 量也有報道，如氯化鋰和甲磺酸乙酯處理，紫外誘變和微波誘變等，但效果有限。而常壓室 溫等離子體由于自身溫度低、活性粒子濃度高、種類多樣且作用于微生物能夠改變其通透 性同時引起基因損傷，從而有望導致微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，引發(fā)微生物在 較大幾率上發(fā)生有益于生產(chǎn)的正突變。
[0006] 本發(fā)明利用本實驗室篩選的一株產(chǎn)靈菌紅素粘質(zhì)沙雷氏菌為出發(fā)菌株，前期通過 發(fā)酵優(yōu)化后靈菌紅素產(chǎn)量為2.64g/L，仍然存在產(chǎn)量偏低、菌株易退化，遺傳穩(wěn)定性較差等 缺陷。本發(fā)明擬通過常壓室溫等離子體進行誘變育種，期望解決上述菌株遺傳穩(wěn)定性較差， 靈菌紅素產(chǎn)量不高，對廉價生物質(zhì)碳源利用不足的問題，尤其是缺乏對含有木糖的大量農(nóng) 殘物秸桿水解液的利用能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌 CGMCCNo. 12714,以及使用該菌株高效生產(chǎn)靈菌紅素的方法。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0009] -株高產(chǎn)靈菌紅素的突變菌株，名稱為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)RZ 21-C6,保藏編號為CGMCCNo. 12714。所述菌株的獲得包括如下步驟：
[0010] (1)將經(jīng)過搖床培養(yǎng)的粘質(zhì)沙雷氏菌原始菌株的發(fā)酵液用生理鹽水稀釋到106-10 7 個/mL，取10yL涂布在ARTP誘變儀器金屬載體上，參數(shù)設(shè)置為:氣流量10-15L/min，電源功率 80-120W，處理時間為15-240S。誘變結(jié)束后，用無菌鑷子將金屬片放到裝有l(wèi)mL生理鹽水的 離心管中。在振蕩器上震蕩l_2min，把附著在金屬載片上的微生物洗脫下來形成菌懸液。
[0011] (2)將所得到的菌懸液進行合適的梯度稀釋，取O.lmL稀釋液涂布到含有發(fā)酵液培 養(yǎng)基的平板上，28-32 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，做致死率曲線。
[0012] (3)選取致死率在95%以上處理時間的紅色優(yōu)于原始菌株的單菌落接種到含有木 糖的96孔平板上避光培養(yǎng)，24-48h后檢測其生物量和色素量，篩選出色素產(chǎn)量和生物量顯 著高于其他的菌株。
[0013] (4)所獲得最佳菌株連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)10代以上以鑒定其穩(wěn)定性，獲得的穩(wěn)定高產(chǎn)突 變菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo. 12714。
[0014] 本發(fā)明突變菌株利用木糖或者農(nóng)殘秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的方法包括如 下步驟：
[0015] (1)接種2-3環(huán)粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo. 12714至30mL的一級種子培養(yǎng)基中，該培養(yǎng) 基配方為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH為7 · 0，28-32 °C、搖瓶轉(zhuǎn)速150-300rpm 培養(yǎng) 12-24h 至 0D6(X) = 1.0。
[0016] (2)取上述一級種子液，按3 %-5 %的接種量接種至30mL二級種子培養(yǎng)基，該培養(yǎng) 基配方為木糖20g//L以內(nèi)，蛋白胨25g/L，F(xiàn)eS〇4· 7H20 0.23mM和CaCl2 16.68mM，利用CaC03 控制pH在6.0-8.5，3 % -5 %接種量，在28-32 °C條件150-300rpm避光搖瓶培養(yǎng)24-48h;
[0017] (3)接種3%-5%的二級種子培養(yǎng)液在5L發(fā)酵罐里發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素，裝液量3L，初 始碳源為木糖或者農(nóng)殘秸桿水解液總還原糖濃度20g/L以內(nèi)，蛋白胨25g/L，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 0.23mM和CaCl2 16.68mM，培養(yǎng)基中農(nóng)殘秸桿水解液總還原糖初始濃度消耗至5g/L以下時， 單次直接補充濃縮農(nóng)殘秸桿水解液至總還原糖濃度為原初始濃度，補料次數(shù)不限，發(fā)酵溫 度為28-32°C，利用HC1和NaOH控制pH在6.0-8.5，溶氧40-60 %，轉(zhuǎn)速為300-400rpm，避光發(fā) 酵150-200h。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0019] (1)通過ARTP誘變育種，獲得一株性狀優(yōu)良，遺傳穩(wěn)定性高，高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì) 沙雷氏突變菌株。
[0020] (2)本發(fā)明獲得的粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo . 12714不僅能夠高效利用傳統(tǒng)的蔗糖等 碳源，而且還能利用木糖及其與其他單糖的混合組分發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素。
[0021] (3)以玉米秸桿水解液為代表的廉價農(nóng)殘秸桿生物質(zhì)首次被開發(fā)用于靈菌紅素的 生產(chǎn)，經(jīng)發(fā)酵補料策略優(yōu)化，靈菌紅素濃度可達15_20g/L。
【附圖說明】
[0022]圖1為粘質(zhì)沙雷氏菌ARTP誘變的致死率曲線。
[0023]圖2為19株正突變菌株菌體生長與色素合成的比較。
[0024] 圖3為靈菌紅素的紫外可見吸收光譜。
[0025] 圖4為靈菌紅素的高分辨率質(zhì)譜圖(FT-ICR-MS)。
[0026] 圖5為突變菌的菌體生長和色素合成的遺傳穩(wěn)定性分析。
[0027]圖6為原始菌株與突變菌株的TEM顯微觀察。
[0028] 圖7為原始菌株和突變菌株的細胞膜滲透性分析(A圖為外膜，B圖為內(nèi)膜）。
[0029] 圖8為模擬混糖發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的過程曲線。
[0030] 圖9為玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素 (A圖為單批次，B圖為多批次）。
[0031] 本發(fā)明中的菌株RZ 21-C6,保藏于中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地 址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏編號為CGMCC 1'1〇.12714，分類命名:粘質(zhì)沙雷氏菌361'瓜1:丨&1]1&1^68〇6118;保藏日期為2016年6月28日。
【具體實施方式】
[0032]以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0033]實施例1高產(chǎn)靈菌紅素菌株的ARTP誘變及篩選
[0034] (1)菌株誘變:粘質(zhì)沙雷氏菌原始菌株的常壓室溫等離子體誘變致死率曲線如圖1 所示(該原始菌株分離自市售水產(chǎn)用光合細菌菌劑，編號RZ 21，具體見文獻：閔濤玲，楊啟 銀，曩瀟瀟，等.光合細菌菌劑中一株粘質(zhì)沙雷氏菌的分離與鑒定.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34
[22] :5837-5838,5841.)，等離子體對粘質(zhì)沙雷氏菌殺傷力比較強，處理15s會殺死近60% 的菌體;處理60s以后致死率達到90%以上;處理240s致死率達到100%。突變本身具有隨機 性，其致死率和正突變之間的關(guān)系并不是十分清楚，但據(jù)文獻報道致死率越高，獲得正突變 率的幾率就會越大。本研究為了獲取更高正突變率的菌株并便于選擇單菌落，選取致死率 在96%以上的條件進行處理，即處理時間分別為120s，150s和180s三個處理，這三個處理時 間對應(yīng)的致死率分別為96.3%，97.9%和98.8%。
[0035] (2)菌株篩選:在上述三種處理的平板中挑選到19株顏色紅于原始菌的正突變菌 株，其中120s的正突變菌株4株，編號為A1-A4,150s的正突變菌株有6株，編號為B1-B6,180s 的正突變菌株有9株，編號為C1-C9。通過對以上菌株在含有木糖的96孔平板培養(yǎng)48h后OD535 和OD600的比較發(fā)現(xiàn)C6菌株的色素生產(chǎn)能力和菌體生長都是最好的（圖2)。
[0036] (3)突變菌所產(chǎn)色素的定性:誘變菌株C6所產(chǎn)色素溶于酸性氯仿(pH 3.0)在200- 800nm波長下掃描，圖譜如圖3所示。其特異性吸收峰峰值在535nm處，與文獻報道中靈菌紅 素在酸性條件下的檢測波長535nm完全一致，同時不存在其它物質(zhì)的雜峰，初步斷定C6所產(chǎn) 紅色素為靈菌紅素。對色素純化樣品進一步利用FTICRMS高分辨質(zhì)譜進行鑒定分析，圖譜顯 示其存在大小為324.20730Da[M+H+]的物質(zhì)碎片（圖4)，該物質(zhì)分子量Mr=[M+H+]-l = 323.2073與靈菌紅素 C2QH25N30的分子量Mr = 323.2完全一致，最終確定樣品中色素為靈菌紅 素。
[0037] (4)突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析:傳代過程中對各代的突變株進行生物量增長與靈 菌紅素產(chǎn)量的分析，從1代到10代進行了 24_48h的搖瓶發(fā)酵，檢測了此時的相對菌體生長及 色素產(chǎn)量，等離子體誘變的粘質(zhì)沙雷氏菌突變體兩個指標在10代之內(nèi)都保持良好的遺傳穩(wěn) 定性(圖5)。
[0038]實施例2突變菌株生理性能分析
[0039] (1)細胞形態(tài)變化的TEM觀察：在透射電鏡下觀察粘質(zhì)沙雷氏菌突變菌株RZ 21- C6，其形態(tài)與出發(fā)菌株RZ21相比有顯著變化（圖6)。突變菌的菌體體積明顯變大，細胞比表 面積變大;細胞壁變得非常薄，細胞表面開始變得圓潤通透，通透性增加，這將極有利于胞 內(nèi)次級靈菌紅素分泌到胞外，減少對自身的傷害作用，同時也有利于后期產(chǎn)品的分離純化 過程。
[0040] (2)細胞膜磷脂脂肪酸成分分析：由表1可以看出，突變菌株RZ 21-C6菌體細胞膜 磷脂中的脂肪酸成分發(fā)生了較大的變化:其中飽和脂肪酸(：15:0、(：16:0和(：17 :0含量均呈大 幅減少，降低幅度分別為34.22 %，18.91 %和21.16 %。不飽和脂肪酸16:1、17:1和C18:1的 含量則分別增加了84.20%、19.62%和53.85%。經(jīng)過ARTP誘變，粘質(zhì)沙雷氏菌膜磷脂成分 中不飽和脂肪酸含量顯著增加，飽和脂肪酸含量則大幅減少，以上變化會最終導致細胞膜 流動性的增加，有利于胞內(nèi)物質(zhì)運輸出去和胞外底物運輸進去，從而增強菌株的底物利用 效率并減少次級代謝物對菌體自身的毒害作用。
[0041] (3)細胞膜滲透性分析:采用NPN和0NPG兩種方法分別研究了誘變處理前后粘質(zhì)沙 雷氏菌細胞的內(nèi)外膜通透性的變化。如圖7A所示，原始菌株外膜的熒光值要顯著低于突變 菌株的，類似的結(jié)果也在圖7B中內(nèi)膜的吸光值上表現(xiàn)出了突變菌的滲透性是高于原始菌 的。突變菌株與原始菌株相比，在內(nèi)外膜上滲透性都是顯著升高的。高的膜滲透性有利于胞 外底物的更新和代謝產(chǎn)物的分泌。結(jié)果就導致了突變菌株可以利用大量的胞外底物合成靈 菌紅素。而次級代謝物的有效分泌則會降低胞內(nèi)底物對細胞的脅迫，從而形成靈菌紅素高 效合成的優(yōu)勢循環(huán)。
[0042] (4)生理變化小結(jié):經(jīng)ARTP誘變，粘質(zhì)沙雷氏菌在生理形態(tài)上發(fā)生了顯著的變化。 首先是改變了其細胞的比表面積，使其更利于代謝物和底物的運輸;其次細胞壁明顯變薄， 細胞膜流動性增強，內(nèi)外膜滲透性增大，而據(jù)文獻報道，靈菌紅素合成后通常積累于細胞膜 的周圍，突變菌的這些生理變化對于大量產(chǎn)物排除細胞非常有利，同時也有利于底物更加 方便的進入細胞。因此，上述生理特點將使粘質(zhì)沙雷氏菌的突變菌株更加高效的利用底物 合成更高濃度的靈菌紅素。
[0043]表1原始菌株與突變菌株細胞膜脂肪酸成分分析
[0045 ]注:標準品含量按照100 %來計算。
[0046]實施例3突變菌和原始菌對不同碳源的利用情況比較
[0047] (1)考察誘變菌株RZ 21-C6對4種基礎(chǔ)碳源(蔗糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）的利 用情況如表2所示。與原始菌株相比，突變菌株在含有蔗糖的培養(yǎng)基中靈菌紅素的產(chǎn)量提高 了 2.59倍，生產(chǎn)效率提高了 2.63倍，表明篩選出的菌株不僅色素產(chǎn)量變高，而且生產(chǎn)效率也 提高了，這與實施例2的生理變化得出的結(jié)論一致。在含木糖的培養(yǎng)基中，RZ 21-C6產(chǎn)靈菌 紅素的量比RZ 21提高了 17.21倍，達到3.27g/L。相比于原始菌株的不能利用葡萄糖生產(chǎn)色 素，突變菌株RZ 21-C6能很好的利用葡萄糖產(chǎn)色素，而且色素量最高可達1.44g/L。與其他 糖分不同的是突變菌利用阿拉伯糖合成靈菌紅素的情況變化不大，但卻更有利于菌體的生 長，此時生物量增加了 25.25 %。
[0048] (2)基于上述各種碳源的發(fā)酵結(jié)果，在5L發(fā)酵罐中以一定比例的混和碳源模擬玉 米秸桿水解液的發(fā)酵(總糖20g/L，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖三種單糖分別為1.58、17.54和 0.88g/L)，48h發(fā)酵結(jié)束時靈菌紅素最大濃度為5.29g/L，生產(chǎn)效率達到0.1 lg/L/h(圖8)。在 發(fā)酵過程中，突變菌對葡萄糖和阿拉伯糖的利用較快，在30h內(nèi)即已消耗完畢。以上數(shù)據(jù)表 明以玉米秸桿水解液為代表的水解生物質(zhì)纖維素做碳源發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素在理論上是可 行的。
[0049]表2突變菌和原始菌在不同碳源中發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的比較
[00511注:碳源初始濃度為20g/L，培養(yǎng)時間為64h，ND表示未檢測到。
[0052]實施例4突變菌株利用玉米秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素 [0053] (1)在5L發(fā)酵罐中，考察初始總還原糖濃度為20g/L的靈菌紅素單批次發(fā)酵，所得 結(jié)果如圖9A所示，發(fā)酵48h后，靈菌紅素最高濃度達到4.98g/L，生產(chǎn)效率為0.10g/L/h，菌體 最大〇D_值為1.53 (36h)。值得注意的是，從發(fā)酵曲線中可以看出，突變菌在48h內(nèi)就可以輕 松消耗完所有還原糖，并且靈菌紅素產(chǎn)量變化趨勢仍有進一步提升的空間。為了實現(xiàn)靈菌 紅素的高濃度生產(chǎn)，有必要進一步考察補料策略對玉米秸桿水解液發(fā)酵的作用。
[0054] (2)如圖9B所示，本實施例利用間歇補料方式發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素，在玉米秸桿水解 液中的還原糖消耗至5g/L以下時，單次直接補充濃縮水解液至20g/L，補料4次，總還原糖濃 度為80g/L，至最后一次補料還原糖耗盡共用時132h，此時靈菌紅素最高濃度達16.17g/L， 生產(chǎn)效率達〇. 12g/L/h，總糖轉(zhuǎn)化率為20.21 % (w/w)，可實現(xiàn)靈菌紅素的高濃度生產(chǎn)。
【主權(quán)項】
1. 一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21-C6，保藏編號為CGMCCNo· 12714。2. 權(quán)利要求1所述粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo. 12714在生產(chǎn)靈菌紅素中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，是以木糖或者農(nóng)殘秸桿水解液為碳源。4. 一種利用權(quán)利要求1所述粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo. 12714生產(chǎn)靈菌紅素的方法，其特征 在于包括如下步驟： (1) 粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCCNo. 12714的一級種子培養(yǎng)基為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1 Og/L，pH7 · 0，裝液量 30mL，在 28-32 °C 條件 150-300rpm 搖瓶培養(yǎng) 12-24h 至 0D6qq = 1 · 0; (2) 二級種子培養(yǎng)基為木糖20g/L以內(nèi)，蛋白胨25g/L，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 0.23mM和CaCl2 16 · 68mM，利用CaC03控制pH在6 · 0-8 · 5，裝液量30mL，3 % -5 % 接種量，在28-32 °C條件 150-300rpm避光搖瓶培養(yǎng)24-48h; (3) 接種3 % -5 %的二級種子培養(yǎng)液在5L發(fā)酵罐里發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素，裝液量3L，初始碳 源為木糖或者農(nóng)殘秸桿水解液總還原糖濃度20g/L以內(nèi)，蛋白胨25g/L，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 0.23mM 和CaCl2 16.68mM，培養(yǎng)基中農(nóng)殘秸桿水解液總還原糖初始濃度消耗至5g/L以下時，單次直 接補充濃縮農(nóng)殘秸桿水解液至總還原糖濃度為原初始濃度，補料次數(shù)不限，發(fā)酵溫度為28-32°C，利用HC1和NaOH控制pH在6.0-8.5，溶氧40-60%，轉(zhuǎn)速為300-400rpm，避光發(fā)酵150-200h〇
【文檔編號】C12R1/43GK105969702SQ201610593964
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月26日
【發(fā)明人】陳飛, 戴傳超, 楊晶, 楊啟銀
【申請人】南京師范大學