專利名稱：從粘質(zhì)沙雷氏菌分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表達(dá)重組菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和酶工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種粘質(zhì)沙雷
氏菌(5"err^ia歷arcMce/7s)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)及其編碼基因， 以及表達(dá)metK酶的重組菌株。
背景技術(shù)：
群體感應(yīng)(Quorum sensing)這個(gè)術(shù)語，是由Fuqua等1994年首先提出的。 其定義是當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到一定的密度(quorum)時(shí)才能發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象 (sensing)。當(dāng)一個(gè)特定的環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量急劇增加時(shí)，由細(xì)菌所分泌的信 息分子的濃度也會(huì)相應(yīng)的升高。通過擴(kuò)散性信號(hào)小分子(又稱為自誘導(dǎo)物)與轉(zhuǎn) 錄活化蛋白的相互作用而打開與細(xì)胞群體密度有關(guān)的基因表達(dá)。這些信號(hào)分子 從細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)散到環(huán)境中， 一旦達(dá)到一個(gè)臨界濃度(或者說達(dá)到某一特定的群 體密度)，這些信號(hào)分子就可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)一系列目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而在菌群范 圍內(nèi)控制其行為。群體感應(yīng)在細(xì)菌中廣泛存在，胞間交流可發(fā)生在細(xì)菌種內(nèi)和
種間，細(xì)菌和其真核宿主間。在革蘭氏陰性菌中，自誘導(dǎo)物通常是f?；呓z 氨酸內(nèi)酯(AHLs)，它可調(diào)節(jié)的功能包括抗生素合成、毒性因子產(chǎn)生、胞外多 糖合成、細(xì)菌叢集、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移、生物膜形成、接合、孢子形成、生物發(fā)光 和穩(wěn)定期進(jìn)入等。
粘質(zhì)沙雷氏菌能產(chǎn)生多種具工業(yè)應(yīng)用潛力的物質(zhì)，如殼質(zhì)酶、蛋白酶、脂 酶、核酸酶、抗生素、表面活性劑等；并可發(fā)酵產(chǎn)生大量內(nèi)消旋2,3-丁二醇， 靈菌紅素；可利用碳源廣，如單糖、蔗糖、甘油、纖維二糖等；是丙酮酸、琥 珀酸等有潛力的高產(chǎn)菌種；是兼性厭氧菌，在厭氧條件下，作為發(fā)酵工業(yè)菌株 具有節(jié)能優(yōu)勢。Rob Van Houdt等人利用粘質(zhì)沙雷氏菌MGl QS突變株，通過檢 測2，3-丁二醇的前體-乙偶姻，論證了 QS在2，3-丁二醇代謝合成中的生理作 用。結(jié)果表明，在邵71突變株中，2，3-丁二醇以及前體聯(lián)乙醯和乙偶姻產(chǎn)量 都會(huì)大大降低。當(dāng)添加C4-HSL和3-oxo-C6-HSL時(shí)，突變株中三種化合物的產(chǎn)量水平能夠恢復(fù)到與野生型菌株一樣。突變株的發(fā)酵結(jié)果和突變株
比較一致。QS系統(tǒng)的失活導(dǎo)致了在指數(shù)生長末期和穩(wěn)定期酸性化合物的不斷產(chǎn) 生，并且在利用糖發(fā)酵時(shí)，會(huì)引起早期生長停滯。Rice等人建立的在基本培養(yǎng) 基中添加葡萄糖和酪素考察生物膜變化的模型也說明了 QS系統(tǒng)對(duì)沙雷氏菌的 代謝調(diào)節(jié)功能。盡管QS系統(tǒng)調(diào)控2，3-丁二醇合成的精確機(jī)制還不清楚，但是 QS系統(tǒng)方面的工作對(duì)于研究細(xì)菌代謝將會(huì)有很重要的意義。
群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的次級(jí)代謝也具有重要的調(diào)控作用。很多沙 雷氏菌菌株產(chǎn)生靈菌紅素，靈菌紅素是一種次級(jí)代謝的紅色抗生素，它的生物 合成是由一個(gè)涉及高絲氨酸內(nèi)酯群體感應(yīng)系統(tǒng)和p&基因簇的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控， 同時(shí)，這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至少有兩個(gè)單獨(dú)的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和大量的其它調(diào)節(jié) 因子。Sarah等人將5)^274的/7/g基因簇導(dǎo)入不產(chǎn)色素的粘質(zhì)沙雷氏菌12 (5"歷a 12)中，結(jié)果5fej 12產(chǎn)生了紅色素，并且是受自身aHSL-QS和7i/; S系統(tǒng)的調(diào) 節(jié)。反過來將aHSL-QS調(diào)節(jié)基因座從5"歷a 12導(dǎo)入5"歷a 274發(fā)現(xiàn)，6)z/a 274表現(xiàn) 出由aHSL控制的一系列生理行為，包括紅色素的產(chǎn)生。QS調(diào)控系統(tǒng)、復(fù)合調(diào) 節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及環(huán)境信號(hào)對(duì)靈菌紅素合成的影響被廣泛的研究。
在沙雷氏菌S 39006中，靈菌紅素和碳(雜)青霉烯是由以BHL和冊L為信 號(hào)分子的S/^I/R型的QS系統(tǒng)調(diào)控的，在沙雷氏菌SS-1中，靈菌紅素的合成、 核酸酶的分泌以及游動(dòng)性是由^p/7lR型的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)的。在不產(chǎn)生色素的MG1 菌株中，游動(dòng)性、蛋白酶的分泌和生物膜的形成受aHSL-QS控制。5"歷aluxS突 變株表現(xiàn)出了靈菌紅素產(chǎn)量減少、溶血和致病性降低，這都是由代謝缺陷引起 的，由此說明Zd/W在激活甲基循環(huán)中具有代謝功能。在S/ra 12 突變體 中，甲殼酶的分泌、細(xì)菌素的生成以及溶血活性都是由QS控制的。在S歷a 12 的調(diào)控體系中，S歷3R的作用有待進(jìn)一步確認(rèn)。 一些學(xué)者認(rèn)為，5歷aR結(jié)合所有 它調(diào)節(jié)的基因的啟動(dòng)子； 一些人則認(rèn)為5歷aR依賴阻抑和aHSL型脫阻抑有關(guān)的 保守調(diào)節(jié)子發(fā)揮作用。這種調(diào)節(jié)蛋白具有保守的啟動(dòng)子元件，在aHSL存在時(shí)， 5"歷sR能結(jié)合它，阻止轉(zhuǎn)錄。還有一些理論認(rèn)為在QS系統(tǒng)控制下的多效調(diào)節(jié)子 調(diào)控靈菌紅素和碳(雜)青霉烯的合成，例如在菌株S 39006中，Rap受QS控制， 從而影響代謝。
盡管目前本領(lǐng)域?qū)τ谡迟|(zhì)沙雷氏菌在工業(yè)上的用途有所了解，然而還需要 進(jìn)一步清楚地研究其生理或代謝功能，找到一些對(duì)于調(diào)節(jié)生理或代謝有用的基 因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自于粘質(zhì)沙雷氏菌的s-腺苷甲硫氨酸合成
酶(MetK)及其編碼基因，含有所述編碼基因的載體以及含有所述載體的重組菌 株。
本發(fā)明的目的還在于提供一種從粘質(zhì)沙雷氏菌的基因組中分離S-腺苷甲 硫氨酸合成酶編碼基因的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，該多
肽選自下組
(a) 具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b) 將SEQ ID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或
添加而形成的，且具有合成s-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子量為41850道爾頓。 在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶來源于粘質(zhì)沙雷氏菌。 在另一優(yōu)選例中，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列， 該核苷酸序列選自下組
(a) 編碼所述多肽的多核苷酸；
(b) 與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸具有SEQ ID NO: l所示的序列。 在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。 在本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體。
在本發(fā)明的第五方面，提供所述的多肽的制備方法，該方法包含 (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種從粘質(zhì)沙雷氏菌基因組中分離s-腺苷甲硫
氨酸合成酶的編碼基因的方法，所述的方法包括
(1) 用限制性內(nèi)切酶HindIII消化粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA，從消化產(chǎn)物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環(huán)化連接，形成自身環(huán)化分子；
(2) 以步驟(l)獲得的自身環(huán)化分子為模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集分子量約1155士50bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)對(duì)步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得含有完整閱讀框的
基因，即為s-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，自身環(huán)化連接的溫度是12'C。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了利用簡并引物擴(kuò)增的Met基因的部分片段，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
圖2顯示了鵬"基因的反向PCR擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳，其中泳道 CK為陰性對(duì)照；泳道M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 23. 13， 9.416， 6.557， 4.361， 2.322， 2.027， 0.564， 0.125。
圖3顯示了歷etvf基因的Southern Blot鑒定。
圖4顯示了歷e"結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳；泳道M為標(biāo)準(zhǔn)DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。 圖5顯示了重組質(zhì)粒pETmetK的圖譜。
圖6顯示了重組質(zhì)粒pETmetK雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳；M為標(biāo)準(zhǔn)DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
圖7顯示了 ￡ co// BL21(DE3)/pETmetK誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌體SDS-PAGE電 泳圖；泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，自上向下的條帶分別為(kDa): 94.0， 66.2， 45.0， 35.0， 24.0， 20.0， 14.4。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，首次從粘質(zhì)沙雷氏菌中分離獲得 一種S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK)基因，經(jīng)鑒定MetK是粘質(zhì)沙雷氏菌QS系統(tǒng) 關(guān)鍵酶。該MetK酶的獲得通過設(shè)計(jì)特殊的引物，通過對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌基因組 DNA進(jìn)行特殊的處理，以及通過常規(guī)PCR和反向PCR相結(jié)合的方法而克隆獲得。 在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
更具體的，本發(fā)明的提供了一種從粘質(zhì)沙雷氏菌中分離的MetK酶及其結(jié) 構(gòu)基因、重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化重組菌體。同時(shí)本發(fā)明提供了一種方法，即通過分子 生物學(xué)手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到其他受體菌，由其他菌株或在其他 培養(yǎng)條件下產(chǎn)生本發(fā)明涉及的MetK酶。
本發(fā)明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因是從粘質(zhì)沙雷氏菌中分離獲 得的，分離方法如下
(1) 用限制性內(nèi)切酶HindIII消化粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA，從消化產(chǎn)物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環(huán)化連接，形成自身環(huán)化分子；
(2) 以步驟(l)獲得的自身環(huán)化分子為模板，以SEQIDN0: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集分子量約1155土50bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)對(duì)步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得含有完整閱讀框的 基因，即為S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
在上述方法中，限制性內(nèi)切酶的選擇是重要的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，選擇 HindIII酶以外的其它限制性內(nèi)切酶消化粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA無法獲得量 較多的3-5kb的DNA片段，獲得從酶切產(chǎn)物中無法良好地?cái)U(kuò)增獲得S-腺苷甲硫 氨酸合成酶。
并且，在酶切后，將自身環(huán)化連接的溫度設(shè)置為12°C，該溫度可獲得連接 較好的自身環(huán)化分子，用于后續(xù)作為PCR擴(kuò)增的模板。而采用常規(guī)的連接溫度 如16"C，自身環(huán)化連接的效果不夠理想。
上述方法中，采用SEQIDNO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增為反向PCR擴(kuò)增。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人利用PCR技術(shù)(反向PCR和普通PCR)和分 子雜交相結(jié)合的方法成功克隆了粘質(zhì)沙雷氏菌QS系統(tǒng)關(guān)鍵酶基因i/etf，同時(shí)
8利用pET28a")表達(dá)載體，表達(dá)分析了這一個(gè)基因，蛋白分子量的大小與預(yù)測的 分子量基本一致。^e"關(guān)鍵酶基因的克隆為深入研究QS調(diào)控系統(tǒng)遺傳特點(diǎn)以 及研究QS系統(tǒng)在代謝中的功能奠定了基礎(chǔ)。
如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然 的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸 和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在 的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，"分離的s-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽"是指s-腺苷甲
硫氨酸合成酶多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物
質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化s-腺苷甲硫氮酸合成酶
蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。s-腺苷 甲硫氨酸合成酶多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本 發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從 原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。 根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
在本發(fā)明中，"S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守性變異多肽"指與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多3個(gè)，較佳地至多2個(gè)，更佳地至多l(xiāng)個(gè)氨基酸被性 質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編 碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO: l所示的編碼區(qū)序列相同 或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具 有SEQ ID NO: 2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO: l所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸 序列。
編碼SEQ ID NO: 2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序 列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選 的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以 是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā) 生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、 缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替 換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改 變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至
少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本
發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(1)
在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2XSSC， 0. 1%SDS， 60°C;或 (2)雜交時(shí)加有變性劑，如50呢(v/v)甲酰胺,0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll， 42 。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā) 生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO: 2所示的成熟多肽 有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段" 的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸， 最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定
和/或分離編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR 擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公 開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫 或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān) 序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增 出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通 常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中 分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。 通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，己經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或 其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA
分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序 列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki， et al. Science 1985; 230: 1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的 cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根
據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常 規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或S-腺 苷甲硫氨酸合成酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生 本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science, 1984; 224: 1431)，可利用本發(fā)明的 多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。 一般來說有 以下步驟
(1) .用本發(fā)明的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的多核苷酸，或用含有該多核 苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
(2) .在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3) .從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體 中。術(shù)語"重組表達(dá)載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植 物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明 中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56: 125);在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521, 1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿 狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以 用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯 控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼
11DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA 技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook， et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。 所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。 這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；入噬菌體PL啟動(dòng)子； 真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟 動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其 病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終 止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗 性，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于 轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞； 或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。原核細(xì)胞的代表性例子如大腸桿菌。
作為本發(fā)明的最優(yōu)選方式，提供了一種轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌BL21/pETmetK， 該重組大腸桿菌含重組質(zhì)粒pETmetK，插入的該質(zhì)粒DNA片段的大小為6. 4kb， 該質(zhì)粒pETmetK中含有序列表中SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。利用該重組
大腸桿菌可良好地表達(dá)s-腺苷甲硫氨酸合成酶。
重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主 為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲， 用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCh。如 果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的函A 轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝 等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根 據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主 細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的 方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離 和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包 括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透 破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、 高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從粘質(zhì)沙雷氏菌中分離出 的。其序列如SEQIDNO: 1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1155個(gè)堿基， 編碼全長為384個(gè)氨基酸的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SEQ ID N0: 2)，該重組酶 的分子量為41850道爾頓。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例l粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA的提取
按照生產(chǎn)商提供的使用說明書，用Genomic DNA Purification Kit (Biodev， 北京)抽提處于對(duì)數(shù)生長期的粘質(zhì)沙雷氏菌H30(購自ATCC)的基因組DNA，并 用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)獲得的細(xì)菌基因組進(jìn)行檢測。
實(shí)施例2 MetK酶基因的克隆和重組菌構(gòu)建
1、簡并引物擴(kuò)增
根據(jù)已報(bào)道其它種類的細(xì)菌///e"基因的序列，運(yùn)用Genefisher軟件設(shè)計(jì) 簡并弓l物/z;et/i7禾口歷"￡ ，引物序列為(其中，N=A/T/G/C， Y=C/T， D=A/G/T， R=A/G):
歷etA7: 5， 一AACAAAATCCATGGCATCGAYRCNGTNGT—3， (SEQ ID NO: 3);禾口歷eZ^么5' -TGCCGCCATAGGTATCCACDATDATYT丁-3'(SEQ ID NO: 4); 以實(shí)施例1獲得的粘質(zhì)沙雷氏菌的基因組DNA為模板，擴(kuò)增沙雷氏菌基因 片段。
PCR擴(kuò)增體系為基因組DNA2u 1，引物歷e^7和歷ez^ 各2u 1，dNTP2u 1， 10X7"ag緩沖液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min， 94°C變性30s， 59°C退火30s， 72°C延伸30s，循環(huán)30次，72。C延伸lOmin。
將擴(kuò)增條帶切膠后用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接于 TaKaRa公司pMD-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 。通過在氨芐青霉素LB平板 上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選結(jié)合菌落PCR擴(kuò)增，鑒定出陽性克隆，并在上海英駿生物技 術(shù)公司進(jìn)行序列測定。測序之后，設(shè)計(jì)反向PCR所需特異引物metK3和metK4: 5， —CAGCGAGATGTCTTCTGAGTGC-3，(SEQ ID NO: 5);禾口
歷"昆5， -TGGCTGACGGCGGGCACCAAAT-3，(SEQ ID NO: 6)。
2、 粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA的酶切
取10 u L基因組DNA用限制性內(nèi)切酶#i/7d III消化12h后，用0. 8%瓊脂 糖凝膠對(duì)消化后細(xì)菌基因組進(jìn)行電泳分離，用割膠回收試劑盒回收大小在3-5 kb的片段，溶解于無菌水中。
3、 酶切片段的自身環(huán)化
取8"L回收的基因組DNA片段，用TaKaRa自身環(huán)化連接試劑盒進(jìn)行自身 環(huán)化連接反應(yīng)。連接酶切片段時(shí)，注意反應(yīng)條件要有利于形成自身環(huán)化分子。 反應(yīng)體系為8uLDNA片段，lwL連接緩沖液，1PL連接酶；在12。C條件下 連接過夜，低于常規(guī)的連接溫度16"C。
4、 反向PCR擴(kuò)增
用博大泰克公司DNA清潔試劑盒對(duì)連接反應(yīng)液進(jìn)行清潔處理，并將DNA洗 脫到20n L無菌的去離子水中，然后利用引物metK3和metK4進(jìn)行反向PCR。
反向PCR擴(kuò)增體系為基因組DNA2ul，弓|物歷etvf/和歷efy^各2u 1， dNTP 2ul， 10X7i^緩沖液5ul， TAKARA Tag聚合酶ddH20 38 ul。
反向PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min， 94°C變性30s, 58°C退火30s，72°C延伸5min，循環(huán)30次，72°C延伸10min。
5、 反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Southern雜交鑒定
為了確保反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有核心區(qū)，在測序之前對(duì)反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的特異性先進(jìn)行鑒定，將反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8y。瓊脂糖凝膠上電泳。隨后參 照Amersham Pharmacia的《分子克隆》第二版(科學(xué)出版社出版時(shí)間 1999. 10.01)進(jìn)行凝膠的變性、中和、轉(zhuǎn)膜及雜交鑒定。
6、 反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序
再次電泳分離反向PCR產(chǎn)物后，根據(jù)Southern雜交鑒定成陽性的條帶的 大小，切膠后，用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接于TaKaRa公 司pMD-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 。通過在氨芐青霉素LB平板上進(jìn)行藍(lán)白 斑篩選結(jié)合菌落PCR擴(kuò)增，鑒定出陽性克隆，并在上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行 序列測定。將測得全長序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，并借助NCBI的ORF Finder程序(http:〃爾.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)確定其中的完 整閱讀框，同時(shí)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)基因引物FpEXmetKl和RpEXmetK2:
FpEXmetKh 5， -GGAATTCCATATGATGGCTAAACACCTCTTCACG-3， (SEQIDN0: 7);和
RpEXmetK2: 5, -CCCAAGCTTTCGGGGCTTATTTCAGGC-3，(SEQ ID NO: 8)。
7、 /z/e"基因的表達(dá)
利用pET28a(+)質(zhì)粒(Novagen)，構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)目的基因，進(jìn)一步確 認(rèn)克隆基因的正確性。
7. "結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增
根據(jù)反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列的拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)FpEXmetKl和RpEXmetK2表 達(dá)引物。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增出歷e"的完整結(jié)構(gòu)基因。
PCR擴(kuò)增體系為基因組DNA 2u 1,引物FpEXmetKl和RpEXmetK2各1， dNTP 2ixl， 10X7ag緩沖液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min， 94°C變性30s， 57°C退火30s， 72°C延伸75s，循環(huán)30次，72°C延伸lOmin。
15并用DNA清潔試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔處理。 7.2限制性酶切反應(yīng)，純化及連接反應(yīng)
經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物，用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物序列中酶切位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行 酶切反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，所用的酶是A^el和氾/7d III。酶切體系為PCR產(chǎn)物或 質(zhì)粒溶液20 ul， Wellul，歷'77dlIIlul， IOX緩沖液3ul， ddH20 5 ul， 總體積30 u 1。
由于所選用的兩個(gè)酶切位點(diǎn)在pET28a(+'空質(zhì)粒上相距很近(約30bp)，因 此，酶切之后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體只需經(jīng)過PCR清潔試劑盒即可達(dá)到純化的 目的。
經(jīng)酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體，可以用于連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系 為酶切純化的PCR產(chǎn)物lOu 1，酶切純化的質(zhì)粒3til，T4連接酶lul，10X 連接酶緩沖液2ul， ddH20 4 "1。連接后獲得重組質(zhì)粒pETmetK，其主要結(jié) 構(gòu)如圖5所示。
7. 3質(zhì)粒制備與轉(zhuǎn)化
質(zhì)粒抽提采用質(zhì)粒提取試劑盒制備，參照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行操作。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞使用氯化鈣法。具體操作如下
7.3.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1) 從新鮮的大腸桿菌培養(yǎng)平板上接種一單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基， 37X培養(yǎng)過夜。
(2) 按0. 5-1%的比例轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基，37T培養(yǎng)2-4個(gè)小時(shí)， 當(dāng)菌液0D,約為0.3。
(3) 將菌液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30分鐘，4000rpm離心 10分鐘。
(4) 去上清，沉淀懸浮于5ml預(yù)冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴15分鐘， 4000rpm離心10分鐘。
(5) 去上清，沉淀懸浮于2ml預(yù)冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴10分鐘， 4000rpm離心10分鐘。
(6) 去上清，沉淀懸浮于lml預(yù)冷的0. 1M的CaCl2溶液中，加入高壓滅菌的甘油至終濃度15%。
(7)取200 u 1分裝于1.5ml tip管中，于-70。C保存，備用。
7. 3. 2重組質(zhì)粒pETmetK的轉(zhuǎn)化
(1) 取0. 1-1 g重組質(zhì)粒pETmetK DNA于200u 1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴 30分鐘。
(2) 42°C水浴熱激90秒，快速置于冰上1-3分鐘。
(3) 加入新鮮LB液體培養(yǎng)基800u 1,于37。C振蕩培養(yǎng)45分鐘。
(4) 取200y 1菌液涂布于選擇性LB固體培養(yǎng)基表面。37°C培養(yǎng)12-16 個(gè)小時(shí)至單菌落出現(xiàn)。
7.3.3重組子的鑒定
將陽性菌落接種于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并 提取質(zhì)粒，按照"7.2限制性酶切反應(yīng)，純化及連接反應(yīng)"中的酶切體系和條 件用Ndel和氾/^ III重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，結(jié)果見圖6，說明獲得的重組質(zhì)粒是正確的。
經(jīng)電泳結(jié)果證實(shí)，該陽性克隆菌落有DNA片段插入質(zhì)粒pETmetK，含此重 組質(zhì)粒pETmetK的重組大腸桿菌，即為轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21/pETmetK。測 序結(jié)果顯示插入片段含有一個(gè)長H55bp的開放閱讀框架。
本發(fā)明的重組大腸桿菌BL21/pETmetK可用于研究MetK基因的功能，以及 對(duì)QS系統(tǒng)合成信號(hào)分子的調(diào)控作用。同時(shí)也是研究QS系統(tǒng)調(diào)控微生物代謝的 重要工程菌。
實(shí)施例3 MetK酶的誘導(dǎo)表達(dá)
本發(fā)明的重組大腸桿菌BL21/pETmetK表達(dá)的條件為37°C培養(yǎng)，IPTG誘 導(dǎo)；獲得的重組菌￡ cWiBL21(DE3)/pETmetK的菌體懸于磷酸緩沖液(pH7)中， 利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為可溶性目標(biāo)蛋白。
將重組大腸桿菌BL21/pETmetK接種于添加適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中 (LB培養(yǎng)基組成為酵母粉O. 5%、胰蛋白胨1%、 NaCl 1%， pH7. 0) ， 37'C搖床 培養(yǎng)過夜；再以5%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30mLLB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37°C 搖床培養(yǎng)4小時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度lmM)，然后繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，離心收集菌體。將收集的菌體進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖7所示，表明基 因工程菌表達(dá)出了 MetK，圖中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量(自上向下的條帶分別 為97.4, 66.2， 43， 31， 20.1， 14. 4 kDa)。在43kD左右出現(xiàn)了一條明顯的蛋 白條帶，酶已成功表達(dá)。
經(jīng)驗(yàn)證，所獲得的MetK酶具有良好的合成S-腺苷甲硫氨酸的功能，酶活 性很高。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表
<110〉 華東理工大學(xué)
<120>從粘質(zhì)沙雷氏菌分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表達(dá)重組菌株
<130〉 076397
<160〉 8
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 1155
<212〉 隨
<213〉 Serratia maxcescens
<400〉 1
atggcta犯cacctcttcacgtccgaatccgtctccgaaggacatcccgataaaatcgcc60
gatcagatctccgatgccgtcctcgacgctatcctggaacggcgcgcgtc120
gcctgcg3犯cctacgtgaaaaccggcatggtcctggtcggcggtgaaatC3CC3CC3gC180
gcctgggtcgatatcgaagagatcacccgcaagaccgtgcgcg,tcggctacgttcat240
tcggacatgggctttgacgccaactcctgtgcagtattgagcgctatcggcaagcaatcc300
ccggat3tca3tcagggcgttgatcgtaccgatcctctcg agcaaggcgccggcgatcag360
ggcttgatgtttggctacgcC3CC犯Cg肌accgacgtgctgatgcctgcgcctgtcacc420
tacgcgcaccgcctggtgcagcgccagtccgaagtgcgtaaaaacggcaccctgccgtgg480
ctgcgcccggatgcg犯gagccaggtgaccttccagtacgacgacggcaaaatcgtcggc540
atcgacgccgtggtgctgtccacccagcactctgaagacatctcgctgaa a_gatctgcaa600
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ggcgccttctccggtaaggatccgtccaaggttgaccgttccgcggcttacgcggcgcgc840
tacgtggcgaaa犯catcgtcgccgccggcctggccgatcgctgcg卿ttcaggtgtct900
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<210〉 2 <211〉 384 <212〉 PRT
<213〉 Serratia marcescens <400〉 2
Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro 15 10 15
Asp Lys lie Ala Asp Gin lie Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala lie Leu 20 25 30
19<formula>formula see original document page 20</formula><220〉
〈221> misc—feature
<223〉 引物
<220〉
<221〉 misc—feature
<222〉 (22).. (22)
<223〉 r是a'或g
<220〉
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<220〉
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<223〉 n是a, c, g,或t
<400〉 3
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<210〉 4
<211〉 28
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
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<223> 引物
<220〉
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〈220〉
<221〉 misc一feature
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<400〉 4
tgccgccata ggtatccacd atdatytt 28<210〉 5
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<212> DNA <213>人工序列
<220〉
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<212〉 DNA <213〉人工序列
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<400〉 6
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<210> 7
<211〉 34
<212〉 腿
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400〉 7
ggaattccat atgatggcta aacacctctt cacg
34
<210> 8
<211> 27
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物
<400〉 8
cccaagcttt cggggcttat ttcaggc 2權(quán)利要求
1. 一種分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
2. 如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所 示氨基酸序列的多肽。
3. —種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸 序列選自下組(a) 編碼如權(quán)利要求l所述多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID N0: 2所示氨基酸序列的多肽。
5. 如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQIDNO: l所示的序列。
6. —種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7. —種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8. 權(quán)利要求l所述的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a) 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b) 從培養(yǎng)物中分離出s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
9. 一種從粘質(zhì)沙雷氏菌基因組中分離S-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因 的方法，其特征在于，所述的方法包括(1) 用限制性內(nèi)切酶HindIII消化粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA,從消化產(chǎn)物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環(huán)化連接，形成自身環(huán)化分子；(2) 以步驟(l)獲得的自身環(huán)化分子為模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集分子量約1155土50bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)對(duì)步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得含有完整閱讀框的基因，即為s-腺苷甲硫氨酸合成酶的編碼基因。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，自身環(huán)化連 接的溫度是12'C。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和酶工程領(lǐng)域，公開了一種從粘質(zhì)沙雷氏菌分離的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或?qū)EQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。本發(fā)明還公開了所述酶的編碼基因，含有所述編碼基因的載體，以及含有所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開了從粘質(zhì)沙雷氏菌中分離S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因的方法。
文檔編號(hào)C12N9/00GK101429498SQ20071004801
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者周文瑜, 孫建安, 張燎原, 虎 朱, 楊云龍, 沈亞領(lǐng), 昱 邱, 魏東芝 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)