專利名稱：一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到利用重金屬抗性微生物強(qiáng)化蕈菌富集土壌金屬的方法。
背景技術(shù)：
由于エ業(yè)“三廢”、機(jī)動(dòng)車尾氣的排放、污水的灌溉和農(nóng)藥、除草剤、化肥等的使用以及礦產(chǎn)的開發(fā)，重金屬排放量與日俱增，嚴(yán)重污染了人類賴以生存的土壌、水體和空氣。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年釋放到各種環(huán)境中的重金屬高達(dá)數(shù)百萬噸，其中鉛為34. 6萬噸，銅為14. 7萬噸，鎘為3. 9萬噸,鎳為34. 6萬噸,鋅為27. 6萬噸,砷為12. 5萬噸,萊為I. 2萬噸[1]。僅以我國土壤為例，全國受重金屬污染的耕地面積約2500萬公頃，毎年被重金屬污染的糧食高達(dá)1200萬噸，直接經(jīng)濟(jì)損失超過100億元[2]。當(dāng)然，重金屬污染水體及土壌后，除了影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)外，還可能影響水陸生動(dòng)植物生長，進(jìn)而影響到生態(tài)系統(tǒng)。更加令人擔(dān)憂 的是，由于重金屬不能被生物降解，在食物鏈的層層富集放大作用下，最終可能以較高濃度進(jìn)入人體，對(duì)人體造成傷害。著名的日本富山縣的“骨痛病”就是因?yàn)槭秤帽缓k廢水澆灌的土壤生產(chǎn)的“鎘米”所致；
土壤重金屬的修復(fù)方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。與物理化學(xué)方法相比，生物修復(fù)法具有成本低廉、來源廣泛、不產(chǎn)生次級(jí)污染等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于低濃度重金屬的去除。根據(jù)其所利用的生物種類，生物修復(fù)可大體分為微生物修復(fù)、植物修復(fù)和動(dòng)物修復(fù)三類。其中，微生物輔助植物修復(fù)以其特殊的優(yōu)勢(shì)引起了人們的研究興趣。許多微生物通過產(chǎn)有機(jī)酸，生物表面活性劑等，提高土壌有效態(tài)重金屬含量，進(jìn)而促進(jìn)植物富集土壌中相應(yīng)重金屬。但是，植物修復(fù)土壌重金屬污染存在生長周期長，修復(fù)時(shí)間久，后處理困難，長期種植降低土壌肥力等植物共有缺點(diǎn)；
針對(duì)上述植物修復(fù)的不足，我們研究團(tuán)隊(duì)提出了利用重金屬抗性微生物強(qiáng)化蕈菌富集土壌金屬的方法。蕈菌是ー種大型真菌，其具有重金屬富集能力強(qiáng)，生長周期短，生物量大，易于后處理(沼氣減量)等優(yōu)點(diǎn)。再加上特異性重金屬抗性微生物的輔助，使該方法應(yīng)用于重金屬污染土壌的治理具有更重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)未能有效地拔出土壤中重金屬的不足，通過“蕈菌-微生物”聯(lián)合定向修復(fù)重金屬污染土壌的方法，提高生物修復(fù)去除土壌重金屬的效率，為重金屬污染土壤的實(shí)地修復(fù)提供ー種周期短、易于實(shí)施并充分利用土壤資源的“蕈菌-微生物”聯(lián)合定向修復(fù)技術(shù)；
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的；
本發(fā)明的一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壌重金屬的技術(shù)是在污染土壤上種植生物量大的蕈菌，在蕈菌覆土后噴灑適量的抗性微生物(可一次性噴灑完或者分批次噴灑定量的抗性微生物)，再經(jīng)過一段時(shí)間的生長，采集蕈菌的子實(shí)體，而后將采集的蕈菌投入沼氣池進(jìn)行沼氣池厭氧微生物發(fā)酵減量處理，最終使蕈菌生物量的減量率達(dá)70-90%，從土壤中拔出的重金屬全部濃縮于沼渣與沼液中，沼液采用化學(xué)沉淀或螯合沉淀(特指鈍化螯合齊IJ)析出重金屬(減量后沼液中重金屬離子得到濃縮，濃度提高，會(huì)大大降低化學(xué)沉淀劑的成本)，沉淀后的沼液經(jīng)檢測達(dá)標(biāo)后排放，重金屬沉淀采用可控制的集中填埋。對(duì)于沼渣相對(duì)于減量前大大減少，可采用可控制的集中填埋(沼渣最大可焚燒制磚，因減量了 80%，比直接焚燒修復(fù)植物環(huán)境友好得多)；
上述方案中所述蕈菌為雙孢鬼(Agari CU s bisporus')、金福資(JricholomaLobynsi 51)、雞腿燕(Coprinus coma tus )、長根燕(Oudemansi ella radi cat a )等生物量大、人工栽培技術(shù)成熟的蕈菌；
上述方案中所述重金屬為環(huán)境污染方面所指的重金屬，主要指生物毒性顯著的鎘、鉛、鉻，還包括具有毒性的重金屬鋅、銅、鈷、鎳、錫等污染物；
上述方案中，采收的蕈菌投入沼氣池進(jìn)行沼氣池厭氧微生物發(fā)酵減量化處理，最終使蕈菌生物量減量率達(dá)70-90% ；
上述方案中，減量后富含重金屬離子的蕈菌沼液經(jīng)濃縮或不經(jīng)濃縮后，再采用化學(xué)沉淀法或螯合沉淀(特指鈍化螯合剤)方法將蕈菌沼液中的重金屬離子去除；
上述方案中，化學(xué)沉淀法是指利用特定的化學(xué)試劑與重金屬反應(yīng)生成沉淀，然后得到重金屬離子化合物沉淀；
上述方案中，螯合劑沉淀方法是指蕈菌沼液經(jīng)酸化后，加鈍化螯合劑進(jìn)行螯合反應(yīng)，再加沉淀劑或絮凝劑得到重金屬離子化合物沉淀；
上述方案中，抗性微生物的施用是在蕈菌覆土后進(jìn)行的，抗性微生物的施用濃度依照不同的土壤性質(zhì)，蕈菌種類，重金屬污染狀況而有所不同；
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)了要從土壤快速、徹底拔除重金屬，可以結(jié)合蕈菌的生物修復(fù)和微生物的生物強(qiáng)化來實(shí)現(xiàn)。在蕈菌生長的過程中施用適量的具有較強(qiáng)活化土壌重金屬功能的微生物，使得重金屬離子從土壤顆粒上解離，形成易被蕈菌菌絲吸收的有效態(tài)，從而使蕈菌在生長過程中能快速、超量吸收積累土壌中的重金屬。吸收重金屬的蕈菌采收后經(jīng)過沼氣池的生物減量化處理，蕈菌生物量減量率達(dá)70-90%。形成的沼液和沼渣分別經(jīng)過恰當(dāng)?shù)奶幚?如前所述)，從而達(dá)到從環(huán)境中高效、快速、徹底拔除重金屬；
本發(fā)明的微生物強(qiáng)化蕈菌修復(fù)重金屬污染土壌的技術(shù)，以生物量大、生長周期短的蕈菌為主要生物富集器，充分利用蕈菌耐受重金屬離子能力強(qiáng)、可以吸附多種重金屬、生長周期短(3-5月)、田間栽培蕈菌技術(shù)成熟的特點(diǎn)，配合使用添加微生物的生物措施強(qiáng)化蕈菌吸收重金屬的速度和能力，使其在較短的生命周期內(nèi)吸附積累更多的重金屬，從而更好更快地拔除土壌的重金屬污染。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一
本例是在含鎘(Cd)、鉛(Pb)、銅(Cu)的污染土壤上種植雙孢燕(Agaricus bisporus),同時(shí)聯(lián)合抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)來強(qiáng)化原位富集土壤中鎘(Cd)、鉛(Pb)、銅(Cu)三種
重金屬離子；修復(fù)エ藝過程雙孢菇培養(yǎng)基料配制一基料發(fā)酵一雙孢菇菌種制備一發(fā)酵基料在土壌中鋪底一雙孢菇菌種播種于污染土壌一雙孢菇覆土一在雙孢菇菌絲生長的土壌上施用抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)一雙孢菇生長并富集重金屬一出菇采收一雙孢菇菌體投入沼氣池進(jìn)行厭氧沼氣池減量化處理一形成富集了重金屬的沼液和沼渣一沼液采用化學(xué)沉淀或螯合沉淀(特指鈍化螯合剤)析出重金屬一沉淀后的沼液經(jīng)檢測達(dá)標(biāo)后可排放，重金屬沉淀和沼液采用可控制的集中填埋；
1、培養(yǎng)料配制、發(fā)酵與菌種制備
(1)配方(按IOOm2計(jì)算)
糞草培養(yǎng)料干稻麥草2000kg,干牛(豬)糞700kg,尿素30kg,菜餅100kg,磷肥50kg,石膏25kg,石灰30kg ；
無糞合成料干稻麥草2500kg,尿素30kg,復(fù)合肥20kg,菜餅200kg,石膏75kg,石灰30_50kg ；
(2)堆制發(fā)酵 堆制過程培養(yǎng)料預(yù)濕一建堆一翻堆一后發(fā)酵
后發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)料有香味無氨味，有弾性，不粘手，含水量62% (用手緊捏有水滲出而不滴為宜);
(3)囷種制備
發(fā)酵后基料，裝袋，滅菌，接入試管菌種，待菌袋長滿白色菌絲；
2、播種及發(fā)酵管理
(O播種將培養(yǎng)料充分抖松抖勻后平鋪于菇床上，料厚20-25cm，播種菌種量1500-1850ml/m2,先將2/3的菌種播于料面，用五個(gè)手指將菌種耙入1/3料層深，再把1/3菌種播在料面，拍平料面；
(2)發(fā)酵管理播種后控溫20-25°C，關(guān)閉門窗4天，第5天后開始適度通氣，相対濕度70%左右，播后16-20天即可覆土 ；
3、原位覆土修復(fù)
將發(fā)好的菌，播散于重金屬污染土壌中，覆土總厚度3-3. 5cm，保持土壌含水量18-20%。并用石灰水調(diào)節(jié)pH至中性；
4、施用抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)
雙孢菇覆土后，在土壤表層噴灑微生物菌劑；
5、后續(xù)處理
約2-3個(gè)月后，雙孢菇成熟。按平均畝產(chǎn)鮮菇3500kg，采收雙孢菇，將采收的菌體投入沼氣池，進(jìn)行沼氣厭氧微生物減量化處理。減量后剩下的沼液和沼渣，總質(zhì)量較減量前減少7 70-90% ；
沼液采用化學(xué)沉淀或螯合沉淀(特指鈍化螯合剤)析出重金屬，沉淀后的沼液經(jīng)檢測達(dá)標(biāo)后可排放，重金屬沉淀采用可控制的集中填埋；
剰余少量的沼渣則進(jìn)行集中可控制的填埋，大大降低了對(duì)環(huán)境的危害；
本例中，在含Cd、Pb、Cu的污染土壌中生長的雙孢菇，對(duì)其生物量和重金屬含量進(jìn)行測量發(fā)現(xiàn)，其生物量和重金屬含量與對(duì)照組相比均有提高。其中生物量平均増加了 40%，對(duì)Cd的平均富集量比對(duì)照提高了 70%，對(duì)Pb的平均富集量比對(duì)照提高了 40%，對(duì)Cu的平均富集量比對(duì)照提高了 50% ；
本例中,應(yīng)根據(jù)雙孢菇生長條件來安排季節(jié)和修復(fù)地點(diǎn)。適合我國中部、南部、東部大部分地區(qū)，一般在8月中旬開始堆料，9月上旬播種，9月底覆土，10月上中旬開始采收秋菇，第三年3-4月還可采收春菇，5月中旬收菇結(jié)束，秋春兩季出菇期歷時(shí)約100天。由于本實(shí)施例為自然條件，一年栽培一次；
實(shí)施例ニ
本例是在含鎘(Cd)、鋅(Zn)的污染土壤上種植金福燕(Tricholoma Lobynsis),并且聯(lián)合抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)來強(qiáng)化富集污染土壌重金屬Cd和Zn。按一般條件栽培，可達(dá)到畝產(chǎn)鮮菇3200kg ；
本例金福菇栽培エ藝配制培養(yǎng)料(稻草生料)一浸草預(yù)堆一建堆發(fā)酵一裝袋滅菌一接種養(yǎng)菌一脫袋覆土一施用抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)一25-30天后出菇，采收。金福菇屬高溫菇，一般選在3-5月份播種，5-10月份出菇；
本例中，后續(xù)處理同實(shí)施例一；
本例中，噴灑抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)后，金福菇的生物量平均増加了 35%，其對(duì)Cd的平均富集量比對(duì)照提高了 200%，對(duì)Zn的平均富集量比對(duì)照提高了 150% ；
實(shí)施例三
本例是在含鉛(Pb)鎘(Cd)、銅(Cu)的污染土壤上種植雞腿燕(Coprinus comatus),并且聯(lián)合抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)來強(qiáng)化富集污染土壌重金屬鉛(Pb)、鎘(Cd)和銅(Cu)，種植2-3個(gè)月后,雞腿燕成熟,按一般條件栽培，可達(dá)到畝產(chǎn)鮮燕8000kg。米收雞腿燕,投入沼氣池進(jìn)行厭氧減量化發(fā)酵處理；
本例中，后續(xù)處理同實(shí)施例一；
本例中，雞腿菇的生物量平均増加了 31%，其對(duì)Pb的平均富集量比對(duì)照提高了 38%，對(duì)Cd的平均富集量比對(duì)照提高了 28%，對(duì)Cu的平均富集量比對(duì)照提高了 47% ；
實(shí)施例四
本例是在含鎘(Cd)、銅(Cu)、萊(Hg)的污染土壤上種植長根燕(Oudemansiellaradicata)，同時(shí)聯(lián)合抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)來強(qiáng)化富集污染土壌中的重金屬鎘(Cd)、銅(Cu)、汞(Hg)，種植2-3個(gè)月后長根菇成熟，按一般條件栽培，畝產(chǎn)鮮菇2500kg。采收長根菇，投入沼氣池進(jìn)行厭氧微生物減量發(fā)酵處理；
本例長根菇栽培エ藝配制培養(yǎng)料(木腐質(zhì)基質(zhì))一裝袋、滅菌和接種一脫袋覆土一施用抗性微生物(粘質(zhì)沙雷氏菌)一出菇，采收。長根菇屬中高溫型菌類，一般選擇在6-9月播種，出菇；
本例中，后續(xù)處理同實(shí)施例一；
本例中，長根菇的生物量平均増加了 32%，其對(duì)Cd的平均富集量比對(duì)照提高了 50%，對(duì)Cu的平均富集量比對(duì)照提高了 60%，對(duì)Hg的平均富集量比對(duì)照提高了 50%。權(quán)利要求
1.一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法，其特征在于 (一)篩選特異性重金屬抗性菌粘質(zhì)沙雷氏菌 針對(duì)受損土壤的污染物為重金屬，其抗性菌的篩選過程包括采樣、馴化、平板分離與純化； (1)采樣 取受重金屬污染嚴(yán)重地區(qū)的土樣，存放于4°c冰箱中； (2)馴化取10 g 土樣加入100 mL滅菌水中，于30 °C >150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)； Ih后，分別取50 mL培養(yǎng)液分裝到含有重金屬的100 mL SLP培養(yǎng)基中，于30 °C>150r/min搖床振蕩培養(yǎng)； 一周后，再分別取50 mL培養(yǎng)液分裝到含重金屬的100 mL SLP培養(yǎng)基中，再于30 °〇和150 r / min搖床振蕩培養(yǎng)一周； (3)平板分離與純化 各取10 μ L馴化好的菌液加入含有190 μ L SLP培養(yǎng)基的離心管中，搖勻； 從中各取100 μ L分別涂布到含相同濃度重金屬的SLP平板上，放入30 °C恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d ;觀察微生物的生長情況，并從中挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行平板劃線純化，分離純菌株； 在篩選的起始階段培養(yǎng)基中添加的重金屬較低，為50 mg/L，馴化階段逐漸增加重金屬濃度；在平板分離過程中，選取長勢(shì)較快并且回試仍有較強(qiáng)重金屬抗性的菌株； 以上其中SLP 培養(yǎng)基蔗糖 1%; (NH4)2SO4 O. 1%; K2HPO4 O. 05%; MgSO4 O. 05%; NaCl O. 01%;酵母膏 O. 05%; pH 7. 2 (二)蕈菌一特異性重金屬抗性菌聯(lián)合修復(fù)污染土壤 在重金屬污染土壤上栽種蕈菌，覆土后噴灑適量的抗性微生物菌劑，即可達(dá)到修復(fù)污染土壤。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法，其特征在于所述重金屬為環(huán)境污染方面所指的重金屬，指生物毒性顯著的鎘、鉛、鉻、鋅或銅。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法，其特征在于所述蕈菌為雙孢燕(.Agaricus b i sporus、i cho I oma)、雞腿燕{Coprinus comatus、寵iiOudemansiella radicata)等生物量大、人工栽培技術(shù)成熟的蕈菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法，其特征在于所述的蕈菌采收后，投入沼氣池進(jìn)行減量化處理，最終使蕈菌生物量減量率達(dá)70-90%，減量后得到沼液和沼渣。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的方法，其特征在于所述沼氣減量后得到的沼液采用化學(xué)沉淀或螯合沉淀(特指鈍化螯合劑)析出重金屬，沉淀后的沼液經(jīng)檢測達(dá)標(biāo)后排放，重金屬沉淀和沼渣采用可控制的集中填埋。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域中的一種抗性微生物強(qiáng)化蕈菌修復(fù)重金屬污染土壤的技術(shù)，是在污染土壤上種植蕈菌，在其覆土后施用粘質(zhì)沙雷氏菌強(qiáng)化蕈菌對(duì)土壤重金屬的吸附速度和能力。采收成熟的重金屬蕈菌，將其投入沼氣池進(jìn)行減量處理，減量后沼液采用化學(xué)沉淀析出重金屬，沼液經(jīng)檢測后達(dá)標(biāo)排放，重金屬沉淀和沼渣采用可控制的集中填埋。本發(fā)明以蕈菌為生物富集器，充分利用蕈菌富集重金屬離子能力強(qiáng)、生長周期短的特點(diǎn)，結(jié)合粘質(zhì)沙雷氏菌所具有活化重金屬的能力，以達(dá)到更高效的聯(lián)合修復(fù)結(jié)果。重金屬污染土樣中種植蕈菌并聯(lián)合噴灑粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)土壤修復(fù)功效要大于單純種植蕈菌修復(fù)效果，重金屬去除率可達(dá)90%。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102728610SQ201210203070
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者徐恒, 曹艷茹, 陳正鎖 申請(qǐng)人:四川大學(xué)