一種酶法再生atp的方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法再生ATP的方法包括以下步驟：(1)制備并獲得ATP再生酶；(2)反應(yīng)液中ATP的再生；(3)分離產(chǎn)物和ATP再生酶。根據(jù)本發(fā)明的再生ATP的方法，其具有如下有益效果：(1)采用新型Ppk、Adk、Pap三種ATP再生酶，酶促反應(yīng)中消耗的ATP可被循環(huán)再生，大大降低ATP使用量，再生過程簡單高效，反應(yīng)容易控制，穩(wěn)定性高。(2)反應(yīng)需添加的底物多聚磷酸或其鹽價格低廉，污染小。(3)酶促反應(yīng)不需要添加高價的ATP起始反應(yīng)，添加ADP或者廉價的AMP。(4)建立了ATP再生酶回收體系，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】
-種酶法再生ATP的方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種酶法再生ATP的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] S憐酸腺巧(ATP)由一個腺巧(A)和S個憐酸基團(tuán)(Pi)組成，分子量為507,分子式 Cl出16化化3P3。它是生物能量的轉(zhuǎn)換器和膽存器，在設(shè)及能量的酶促反應(yīng)中，起著不可替代的 重要作用。ATP分子呈A-Pi~Pi~Pi結(jié)構(gòu)，遠(yuǎn)離腺巧的兩個憐酸鍵由~表示，為高能憐酸鍵。 在反應(yīng)過程中，ATP分子的高能憐酸鍵可斷裂釋放大量能量:當(dāng)一個高能憐酸鍵斷裂時，ATP 分子轉(zhuǎn)化為二憐酸腺巧(ADP)，釋放能量30.5kJ/mol;當(dāng)?shù)诙€高能憐酸鍵斷裂時，ADP分子 轉(zhuǎn)化為腺巧酸(AMP)，可再釋放能量27.6kJ/mol。在大部分酶促反應(yīng)中，ATP通過水解為ADP 供能，但在實際生產(chǎn)中，反應(yīng)體系中的ADP會繼續(xù)水解產(chǎn)生AMP。
[0003] 由于目前ATP成本偏高，在工業(yè)生產(chǎn)中直接使用ATP進(jìn)行酶促反應(yīng)收益甚微。另外， ATP的大量添加導(dǎo)致反應(yīng)過程出現(xiàn)沉淀物，同時增加了后期產(chǎn)物的純化難度。因此，能夠在 反應(yīng)生產(chǎn)中投入的少量ATP，通過建立穩(wěn)定、有效的ATP再生體系，使ATP在反應(yīng)過程中循環(huán) 利用是目前利用ATP進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的研究方向。
[0004] ATP在生物體內(nèi)主要通過的底物水平憐酸化、氧化憐酸化和光合憐酸化等方法再 生，進(jìn)行催化作用的酶系通常比較復(fù)雜，需要在含有活性酶系的活性細(xì)胞或者活性細(xì)胞器 內(nèi)進(jìn)行。工業(yè)上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途徑，進(jìn)行底物水平憐酸化方式 再生ATP。此方法雖然再生效果良好，但是經(jīng)酵母細(xì)胞酶系催化再生ATP的反應(yīng)過程復(fù)雜，參 與催化反應(yīng)的酶眾多，反應(yīng)過程不易控制，產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異較大。同時酵母酶系質(zhì)量常 因供應(yīng)的廠家不同、批次不同、甚至季節(jié)不同而有很大差異。另外反應(yīng)過程需要加入大量的 酵母細(xì)胞酶液，引入了許多蛋白、色素等雜質(zhì)給后期純化帶來一定困難。近年來，ATP再生的 研究重點轉(zhuǎn)向使用單一酶或較簡單的酶系，獲得高效穩(wěn)定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨 激酶、丙酬酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，運些酶所利用的底物價值昂貴，如丙酬酸激 酶所利用的憐酸締醇式丙酬酸，且生成的副產(chǎn)物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激 酶、氨激酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物為分別為乙酸和氨氣，因此較難在工業(yè)生產(chǎn)中大量使用。
[0005] 有研究表明，在某些細(xì)菌體內(nèi)存在利用多聚憐酸或其鹽再生ATP的酶系。該酶系包 括多聚憐酸激酶化C 2.7.4.1，Ppk)、腺巧酸激酶化C 2.7.4.3，Adk)和多聚憐酸-腺巧酸憐 酸轉(zhuǎn)移酶化C 2.7.4. -，Pap)，本發(fā)明統(tǒng)稱S種酶為"ATP再生酶"。其中，Ppk催化ADP與多聚 憐酸或其鹽反應(yīng)生成ATP ,Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap則催化AMP與多 聚憐酸或其鹽反應(yīng)生成ADP，S種酶的合理組合均可用于合成ATP(參見圖1)。另外，Ppk酶有 巧kl和化k2兩種不同形式，Ppkl在多聚憐酸或其鹽聚合度較高時有ATP再生作用，而巧k2可 利用低聚合度的多聚憐酸或其鹽再生ATP，兩種巧k酶均可用于ATP再生。使用巧k、Adk和化P 酶組合的方式再生反應(yīng)中的ATP，反應(yīng)底物價格低廉，產(chǎn)物污染相對較小，且對反應(yīng)用酶的 影響較小，因此，可W開發(fā)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種酶法再生ATP的方法及其應(yīng)用，其通過使用化k、A化和PapS種 "ATP再生酶"再生ATP，克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[000引一種酶法再生ATP的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)制備ATP再生酶：
[0010] 通過基因工程改造、發(fā)酵、純化獲得ATP再生酶，或W自然提取等其它方式獲得ATP 再生酶。ATP再生酶可W游離酶的形式制成酶液或者干粉;也可進(jìn)一步固定于固定化載體 上，制得固定化ATP再生酶。
[0011] (2)反應(yīng)液中ATP的再生：
[0012] 在酶促反應(yīng)體系中，按需求添加 ATP、ADP或AMP中的一種、任意兩種或S種組合，進(jìn) 行酶促反應(yīng)。同時，按比例添加 S種ATP再生酶的一種、任意兩種或S種組合，并添加多聚憐 酸或其鹽為憐酸供體，進(jìn)行ATP再生反應(yīng)。反應(yīng)體系中還包含儀離子和/或儘離子，鐘離子、 鋼離子、錠離子中的一種或幾種，Tris或憐酸根離子。本發(fā)明添加的底物、酶及各類鹽可一 次性加入反應(yīng)體系，也可按照工業(yè)生產(chǎn)工藝流程分批次流加補(bǔ)入。
[OOU] (3)分離產(chǎn)物和ATP再生酶：
[0014]固定化的ATP再生酶在反應(yīng)罐中直接分離。上述分離可通過濾袋分離，也可在反 應(yīng)柱中直接分離。或
[001引游離的ATP再生酶通過濾器中超濾膜分離。其中，過濾器具有進(jìn)料口、出料口和回 流口，內(nèi)設(shè)截留的超濾膜。經(jīng)過濾器的截留液為回收的酶液，濾出液為分離出酶之后含產(chǎn)物 的反應(yīng)液。
[0016] 回收的ATP再生酶可重復(fù)利用于步驟(2)。
[0017] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟（1)所述的ATP再生酶選自于多聚憐酸激酶化C 2.7.4.1，化k，包括化kl酶和化k2酶）、腺巧酸激酶化C 2.7.4.3，A化）、多聚憐酸-腺巧酸憐 酸轉(zhuǎn)移酶化C 2.7.4.-，化P)中的一種、任意兩種或S種組合，即單獨使用化k、A化或化P，或 使用化k和Adk組合、A化和化P組合或化k和化P組合，或化k、Adk和化pS種的組合。更優(yōu)選 的，選自上述S種ATP再生酶中的任意兩種或S種組合，即使用化k和Mk組合、A化和Pap組 合或巧k和化P組合W及巧k、A化和化pS種的組合。
[001引其中，當(dāng)選用P地與Mk兩種酶組合時，P地與Mk活性比例為（10-0.1) :1;
[0019] 其中，當(dāng)選用Ppk與Pap兩種酶組合時，Ppk與Pap的活性比例為（10-0.1): 1;
[0020] 其中，當(dāng)選用Pap與Mk兩種酶組合時，Pap與Mk活性比例為（10-0.1) :1;
[0021] 其中，當(dāng)選用Ppk、Pap與AdkS種酶組合時，Ppk、Pap與Adk活性比例為（10-0.1): (10-0.1):1。
[0022] 上述的化k、Adk、化P可W來源于任何生物、或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功 能的酶。Ppk可W是巧kl酶和/或巧k2酶。
[0023] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(1)所述固定化載體選自于高分子載體、無機(jī)載體、 磁性高分子微球載體中的一種或多種。其中，高分子載體選自于纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂 糖、聚丙締酷胺、多聚氨基酸、聚苯乙締、聚丙締酸、海藻酸鋼、殼聚糖、淀粉、聚乙締醇、明 膠、卡拉膠、尼龍或合成高聚物等;無機(jī)載體選自于多孔玻璃、氧化娃、硅膠、活性炭或娃藻 ±等。
[0024] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述的固定化ATP再生酶通過下列方式固定于固定化載 體:吸附、包埋、共價、結(jié)合、交聯(lián)或其組合。其中，Pap、A化、PpkS種酶可分別固定或按比例 混合后一起固定。
[0025] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(2)ATP再生反應(yīng)條件如下：
[00%] 反應(yīng)溫度為25-60°C，優(yōu)選溫度為30-50°C ;
[0027] 反應(yīng)抑為5-10,優(yōu)選抑為6-9。
[002引酶促反應(yīng)體系包括:ATP、ADP和AMP中的一種、任意兩種或立種組合，S種物質(zhì)根據(jù) 酶促反應(yīng)需求量，按照任意比例添加；
[0029] 再生反應(yīng)體系包括:多聚憐酸或其鹽，包括儀離子、儘離子中的一種或兩種，錠離 子、鐘離子、鋼離子的一種或幾種，Tris或憐酸根離子。
[0030] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，本發(fā)明添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應(yīng)體 系，也可按照工業(yè)生產(chǎn)工藝流程分批次流加補(bǔ)入。
[0031] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，本發(fā)明添加的多聚憐酸或其鹽的摩爾濃度為反應(yīng)添加 的ATP、ADP和AMP摩爾濃度總和的0.01-40倍;儀離子濃度為0.0 l-0.2M;儘離子濃度為0.01-0.15M;鐘離子濃度為0.01 -0.5M;鋼離子濃度為0.01-0.5M;錠離子濃度為0.005-0.2M; Tr i S 濃度為0.0 l-0.1M、憐酸鹽濃度為0.0 l-0.1M。
[0032] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，多聚憐酸或其鹽選自于多聚憐酸鋼、多聚憐酸鐘、多聚 憐酸錠、六偏憐酸(鋼）、四聚憐酸(鋼)和=聚憐酸(鋼）中的一種或多種;儀離子選自于氯化 儀、硫酸儀、亞硫酸儀和硝酸儀中的一種或多種;儘離子選自于氯化儘和硫酸儘中的一種或 多種;鐘離子選自于氯化鐘、硫酸鐘、硝酸鐘、氨氧化鐘、亞硫酸鐘、碳酸鐘、碳酸氨鐘、醋酸 鐘、憐酸氨二鐘、憐酸二氨鐘和巧樣酸鐘中的一種或多種;鋼離子選自于氯化鋼、硫酸鋼、硝 酸鋼、氨氧化鋼、亞硫酸鋼、碳酸鋼、碳酸氨鋼、醋酸鋼、憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼和巧樣酸鋼 中的一種或多種;錠離子選自于氯化錠、硫酸錠、硝酸錠、氨水、碳酸錠、碳酸氨錠、憐酸氨二 錠、憐酸二氨錠和醋酸錠中的一種或多種。
[0033] 本發(fā)明方法步驟(3)中采用的超濾膜選自于醋酸纖維素膜、聚諷膜、聚丙締臘膜、 聚氯乙締膜、聚偏氣乙締膜、聚酷胺膜或陶瓷膜。
[0034] -種酶法再生ATP的方法的應(yīng)用，所述方法用于多種依賴ATP的酶促反應(yīng)，用于合 成物質(zhì)W及無細(xì)胞蛋白表達(dá)。
[0035] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述依賴ATP的酶促反應(yīng)為轉(zhuǎn)移憐酸根基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶所 參與的酶促反應(yīng)，W及部分連接酶所參與的酶促反應(yīng)。
[0036] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)移憐酸根基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶所參與的酶促反應(yīng)為酶 法合成憐酸肌酸、憐酸精氨酸、6-憐酸己糖、1,6-二憐酸果糖、3-憐酸甘油、氧化型輔酶II、 AMP、CT (D) P、GT (D) P、UT (D) P的反應(yīng);所述部分連接酶所參與的酶促反應(yīng)為酶法合成乙酷輔 酶A、肌膚、腸桿菌素、谷氨酷胺及心茶氨酸的反應(yīng)。
[0037] 本發(fā)明上述技術(shù)方案，具有如下有益效果：
[003引（1)采用新型化k、A化、化pS種ATP再生酶，酶促反應(yīng)中消耗的ATP可被循環(huán)再生， 從而大大降低ATP的使用量。且再生過程簡單高效，反應(yīng)容易控制，穩(wěn)定性高。
[0039] (2)反應(yīng)需添加的底物多聚憐酸或其鹽價格低廉，污染小，且對反應(yīng)用酶的影響較 小。
[0040] (3)酶促反應(yīng)不需要添加高價的ATP起始反應(yīng)，添加 ADP或者廉價的AMP，W及S種 物質(zhì)的任意兩種或=種組合均可W正常進(jìn)行催化反應(yīng)。
[0041] (4)建立了 ATP再生酶回收體系，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0042] 此外，本發(fā)明中所描述的ATP再生體系可應(yīng)用于多種依賴ATP的酶促反應(yīng)，尤其是 轉(zhuǎn)移憐酸根基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶化C 2.7)所參與的酶促反應(yīng)，例如:憐酸肌酸、憐酸精氨酸、6-憐 酸己糖、1,6-憐酸果糖、3-憐酸甘油、氧化型輔酶11、41?、圳(0化、61'(0沖、1]1'(0化等物質(zhì)的 合成反應(yīng)，W及部分連接酶巧C 6)所參與的酶促反應(yīng)，例如：乙酷輔酶A、肌膚、腸菌素、谷氨 酷氨和k茶氨酸等物質(zhì)的合成反應(yīng)。上述酶促合成反應(yīng)所需的催化用酶及底物見下表1。表 1所列催化用酶可W來源于任何生物、或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功能的酶，可商購 獲得。
[0043] 最后，本發(fā)明中所描述的ATP再生體系還可應(yīng)用于無細(xì)胞蛋白表達(dá)等消耗生物能 量的新技術(shù)中。
[0044] 表1.本發(fā)明所設(shè)及的酶促反應(yīng)催化用酶及底物 [00451
[00461

【附圖說明】
[0047] 圖1為本發(fā)明P地、A化、PapS種酶再生ATP的原理圖。
[004引圖2為本發(fā)明所表達(dá)的巧k、A化、化P酶的SDS-PAGE圖。
[0049] 圖3為本發(fā)明使用游離的ATP再生酶的反應(yīng)工藝流程圖。
[0050] 圖4為本發(fā)明使用固定化ATP再生酶的反應(yīng)工藝流程圖。
[0051 ]圖5為本發(fā)明應(yīng)用于憐酸肌酸生產(chǎn)的肌酸和憐酸肌酸的濃度變化圖。
[0化2] 圖6為本發(fā)明應(yīng)用于無細(xì)胞表達(dá)A化酶的SDS-PAGE圖。
【具體實施方式】
[0053]下面對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)描述，W便于進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0化4] 實施例1P地、A化和化P酶的制備
[0055]本發(fā)明方法中的化k(包括化Id和化k2)、A化和化P酶可W商購獲得，或者是經(jīng)過人 工改造具有同樣催化功能的酶。
[0化6] P地1、巧k2、A化和Pap酶的制備過程如下：
[0057]根據(jù)四種酶基因的序列，設(shè)計四對擴(kuò)增引物，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成， 引物序列如下：
[0化引 卵41正義引物：5'-0：41416661'〔46644446口'414〔41'〔6-3'；
[0059] 卵41反義引物：5'-〔66410：7^7^4661767^6461641'1'-3'；
[0060] 卵k2正義引物：5 ' -TACATATGGCCAGCCCGGCGCAGAAG-3 ' ；
[0061 ]卵k2反義引物：5 ' -TGAATTCAGGCCGGGATATCCAGGTTC-3 ' ；
[0062] a化正義引物：5 ' -CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3 ' ；
[0063] a化反義引物：5 ' -CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3 ' ；
[0064] pap正義引物：5 ' -GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3 ' ；和 [00化]pap反義引物：5 ' -CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3 ' ；
[0066] 提取大腸桿菌化schericMa COli化12菌株(購于天根生化科技有限公司）DM, W 其為模板，通過PCR擴(kuò)增出PPkl與adk基因片段，并將其分別連接至pET 22b載體（購于 Novagene公司）；提取銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)菌株（CICC 10419)DNA，W 其為模板，通過PCR擴(kuò)增出ppk2基因片段，并將其連接至祀T2化載體(購于Novagene公司）； 提取約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii)菌株（CGMCC 1.8030)DNA，W其為模板，通 過PCR擴(kuò)增出pap基因片段，并將其連接至祀T2化載體(購于Novagene公司）。4段連接序列經(jīng) 測序正確后，分別轉(zhuǎn)入E.coli BL2UDE3)菌株(購于天根生化科技有限公司）。
[0067] 將轉(zhuǎn)化后的E.coli BL2UDE3)單克隆接入LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期后，加入ImM異 丙基-0-D-硫代化喃半乳糖巧(IPTG)誘導(dǎo)5小時后，收集菌體，十二烷基橫酸鋼-聚丙締酷胺 凝膠電泳(SDS-PAGE)篩選高表達(dá)菌株。
[0068] 將篩選出的高表達(dá)菌株在無菌條件下接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后接入 含化發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后接入含50L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng) 5小時后加入ImM IPTG誘導(dǎo)5小時后，離屯、收集菌體約1 kg。
[0069] 其中LB培養(yǎng)基成分為：1 %蛋白腺、0.5 %酵母粉和1 %化Cl;種子培養(yǎng)基成分為： 1%蛋白腺、0.5%酵母粉和1%氯化鋼;發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：1%蛋白腺、0.5%酵母粉、1%氯 化鋼、5 %憐酸氨二鋼、1 %憐酸二氨鋼、0.0 l %硫酸儀和1 %甘油。
[0070] 收獲的菌體分別經(jīng)超聲或高壓勻漿破菌后，離屯、收集上清。然后加40-60%飽和的 硫酸錠，離屯、收集沉淀。經(jīng)Tris緩沖液抑8.0溶解后，使用G25柱(購于通用電氣醫(yī)療生物科 學(xué)有限公司）脫鹽，再經(jīng)CM-或DEAE-Sepharose FF(購于通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司） 層析可得到初步純化的游離酶。
[0071] 圖2為所制備酶的SDS-PAGE圖，如圖所示：泳道1為蛋白標(biāo)志物14.4-116kDa(購于 北京中科瑞泰生物技術(shù)有限公司）；泳道2為化kl酶，約60kDa;泳道3為化k2酶，約45kDa;泳 道4為Mk酶，約25kDa;泳道5為化P酶，約55kDa。
[0072] 使用現(xiàn)有技術(shù)記載的公知的測定酶活性的方法，檢測到Img/ml化kl、化k2、A化 和Pap酶液活性分別約為100U、500U、1000U和800U，其中將IiiM底物在1分鐘內(nèi)完全轉(zhuǎn)化定義 為1個活性單位化)。
[0073] 實施例2酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸偶聯(lián)ATP再生體系
[0074] 圖3為本發(fā)明方法使用游離酶進(jìn)行酶促反應(yīng)并偶聯(lián)ATP再生體系的工藝流程圖。參 見圖3,酶法制備憐酸肌酸同時偶聯(lián)游離的ATP再生體系的操作步驟如下：
[0075] (1)在反應(yīng)罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反應(yīng)：
[0076] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.5kg肌酸，W及1.0kg ATP、 0.5kg憐酸氨二鋼、0.38kg氯化鐘、0.3kg氯化鋼、0.2kg硫酸錠、1. Okg六水氯化儀和2. Okg四 聚憐酸鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至約7.5,在反應(yīng)體系中添加 500U/L肌酸激酶及500U/L巧k2酶、500U/L A化酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.5，溫度 為 35°C。
[0077] 圖5為每隔1小時高效液相色譜化PLC)檢測肌酸的剩余量及憐酸肌酸的生成量。反 應(yīng)5小時后，憐酸肌酸生成量約為22g/L，約50% W上ATP轉(zhuǎn)化為ADP、AMPdHPLC檢測條件為： Kromasil C18色譜柱（購于AKZO NOB化公司）（150 X 4.6mm)，檢測波長210nm，檢測溫度25 °C，檢測流速Iml/min，流動相為含有20mM憐酸二氨鐘、0.1 %TFA和5%乙臘的水溶液。
[0078] (2)在過濾器中分離肌酸激酶和ATP再生酶：
[0079] 通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離肌酸激酶和 ATP再生酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量8W)a)，濾出液為分離出酶之后的 反應(yīng)液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0080] 檢測到回收的肌酸激酶、P地2酶和Adk酶的活性較反應(yīng)前減少5 % -20 %不等，可添 加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0081] 實施例3酶促法生產(chǎn)1,6-二憐酸果糖偶聯(lián)ATP再生體系（固定化酶）
[0082] 圖4為本發(fā)明方法使用固定酶進(jìn)行酶促反應(yīng)生產(chǎn)并偶聯(lián)ATP再生體系的工藝流程 圖。參見圖4,固定酶法制備1,6-二憐酸果糖同時偶聯(lián)ATP再生體系的操作步驟如下：
[0083] (1)催化用酶與ATP再生酶的固定：
[0084] 催化用酶果糖激酶(FK)和憐酸果糖激酶(PFK)通過商購獲得，同實施例1中初步純 化的ATP再生酶巧k2酶和化P酶一同W商業(yè)化的環(huán)氧基固定化載體LX1000EP固定。
[0085] 將FK、PFKJpk2和Pap酶按照活性比1:1:1:1混合配成混合酶液10L，酶液中各酶 活性均約為200U。在恒溫攬拌罐中加入LX1000EP濕載體3kg與上述酶液混合，在20°C條件 下，ISOrpm攬拌12小時。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0憐酸鐘緩沖液清洗2遍，即得固定化 混合酶。FK、PFK、Ppk2和Pap酶固定化后，活性降低至原活性的30-40%。
[0086] (2)在反應(yīng)柱中生成1，6-二憐酸果糖：
[0087] 配制反應(yīng)液，每50L含有底物0.9kg果糖，W及0.3kgATP、0.2kgAMP、0.1 化g Tri S、 0.1kg氯化錠、0.6kg硫酸儀和1.化g六偏憐酸鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào) 節(jié)抑值至約7.0，溫度升為35-40°C。
[0088] 將上述步驟（1)中的混合固定酶約3kg裝入反應(yīng)柱，排盡氣泡后制得酶反應(yīng)柱。使 用恒流累將反應(yīng)液W15LA流速由下而上緩慢累入通過酶反應(yīng)柱，反應(yīng)期間控制溫度為37 °C。循環(huán)反應(yīng)約6小時后，收集反應(yīng)液，檢測1,6-二憐酸果糖的生成量約為30g/L，70% W上 ATP 轉(zhuǎn)化為 ADP、AMP。
[0089] 固定化酶循環(huán)反應(yīng)20次W上或者-4°C儲存時間一月W上，酶活性降低約10-15%， 需按比例補(bǔ)加或更換部分新酶。
[0090] 實施例4酶促法生產(chǎn)肌膚偶聯(lián)ATP再生體系
[0091] 參見圖3,酶法制備肌膚同時偶聯(lián)游離的ATP再生酶再生ATP的操作步驟如下：
[0092] (1)在反應(yīng)罐中合成肌膚和再生ATP的反應(yīng)：
[0093] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物心組氨酸1.8kg、e-丙氨酸1.0kg， W及2. OkgAMP、0.6kg憐酸氨二鋼、0.38kg氯化鐘、0.3kg氯化鋼、1. Okg六水氯化儀和5. Okg 四聚憐酸鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)抑值至約7.0,在反應(yīng)體系中添加 800U/L肌膚合成酶及600U/L Adk酶、600U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制抑值為7.0，溫 度為37°C。
[0094] 反應(yīng)6小時后，肌膚生成量約為20g/L，約80%^上41?轉(zhuǎn)化為40?、41?。冊以：檢測條 件為：Kromasi 1 C18色譜柱（購于AKZO NOB化公司）（150 X 4.6mm)，檢測波長2IOnm，檢測溫 度25 °C，檢測流速0.8ml/min，流動相為含有SOmM憐酸鹽緩沖液和15 %甲醇的水溶液。
[00M] (2)在過濾器中分離肌膚合成酶和ATP再生酶：
[0096]通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離肌膚合成酶 和ATP再生酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量8W)a)，濾出液為分離出酶之后 的反應(yīng)液，含有肌膚、ATP、ADP、AMP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0097] 檢測到回收的肌膚合成酶、A化酶和化P酶的活性較反應(yīng)前減少10%-20%不等， 可添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0098] 實施例5酶促法生產(chǎn)茶氨酸偶聯(lián)ATP再生體系
[0099] 參見圖3,酶法制備茶氨酸同時偶聯(lián)游離的ATP再生體系的操作步驟如下：
[0100] (1)在反應(yīng)罐中合成茶氨酸和再生ATP的反應(yīng)：
[0101] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.化g谷氨酸鋼、0.7kg鹽酸乙胺， W及1. Okg ATP、0.5kg憐酸氨二鋼、1. Okg六水氯化儀、0.5kg-水氯化儘和2. Okg四聚憐酸 鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)抑值至約7.0,在反應(yīng)體系中添加500U/L茶 氨酸合成酶及600U/L A化酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.0，溫度為30°C。
[0102] 反應(yīng)5小時后，茶氨酸生成量約為14g/L，約95%^上4了?轉(zhuǎn)化為41?。冊1(：檢測條件 為:Kromasi 1 C18色譜柱（購于AKZO NO肥L公司）（150 X 4.6mm)，檢測波長203皿，檢測溫度 30°C，檢測流速Iml/min，流動相為含有0.05%TFA和5%乙臘的水溶液。
[0103] (2)在過濾器中分離茶氨酸和ATP再生酶：
[0104] 通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離茶氨酸合成 酶和Adk酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量8W)a)，濾出液為分離出酶之后的 反應(yīng)液，含有茶氨酸、AMP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0105] 檢測到回收的茶氨酸合成酶和Adk酶的活性較反應(yīng)前減少5%-10%不等，可添加 相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0106] 實施例6酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸偶聯(lián)ATP再生體系
[0107] 參見圖3,酶法制備憐酸肌酸同時偶聯(lián)游離的ATP再生酶再生ATP的操作步驟如下：
[0108] (1)在反應(yīng)罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反應(yīng)：
[0109] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物0.5kg肌酸，W及0.26kgATP、 0.4kgADP、0.化gAMP、0.14kg憐酸氨二鋼、0.0化g氯化鐘、0.03kg氯化錠、0.1 f5kg-水氯化車孟 和2.Okg多聚憐酸錠(按平均聚合度500計算）的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié) 抑值至約10.0,在反應(yīng)體系中添加100U/L肌酸激酶及100U/L化kl酶、1000U/L Pap酶開始 反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為10.0，溫度為60°C。
[0110] 反應(yīng)6小時后，憐酸肌酸生成量約為3g/L，約30%^上41?轉(zhuǎn)化為40?、41?。冊1(：檢 測條件同實施例2步驟(1)。
[0111] (2)在過濾器中分離肌酸激酶和ATP再生酶：
[0112] 通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離肌酸激酶和 ATP再生酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的 反應(yīng)液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0113] 檢測到回收的肌酸激酶、Ppk 1酶和化P酶的活性較反應(yīng)前減少30%-50%不等，可 添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0114] 實施例7酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸偶聯(lián)ATP再生體系
[0115] 參見圖3,酶法制備憐酸肌酸同時偶聯(lián)游離的ATP再生酶再生ATP的操作步驟如下：
[0116] (1)在反應(yīng)罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反應(yīng)：
[0117] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物2. Okg肌酸，W及0.30kg AMP、 I.化g Tris、2.92kg氯化鋼、1.33kg硫酸錠、4. Ikg六水氯化儀和21 .Okg六偏憐酸鋼的溶液， 配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至約5.0,在反應(yīng)體系中添加800U/L肌酸激酶及 1000U/L巧k2酶、100U/L A化酶、800U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制抑值為5.0,溫度為 25 °C。
[011引反應(yīng)10小時后，憐酸肌酸生成量約為19g/L，約20%^上41?轉(zhuǎn)化為40?、41?。冊1〔 檢測條件同實施例2步驟(1)。
[0119] (2)在過濾器中分離肌酸激酶和ATP再生酶：
[0120] 通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離肌酸激酶和 ATP再生酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量8W)a)，濾出液為分離出酶之后的 反應(yīng)液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP、AMP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0121] 檢測到回收的肌酸激酶、Ppk2酶、A化酶和化P酶的活性較反應(yīng)前減少15 % -40 %不 等，可添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0122] 實施例8酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸偶聯(lián)ATP再生體系
[0123] 參見圖3,酶法制備憐酸肌酸同時偶聯(lián)游離的ATP再生酶再生ATP的操作步驟如下：
[0124] (1)在反應(yīng)罐中合成憐酸肌酸和再生ATP的反應(yīng)：
[0125] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.8kg肌酸，W及4. Okg ATP、 0.6kg TriS、1.05kg氯化錠、2. Okg六水氯化儀和0.4kg多聚憐酸鋼(按平均聚合度50計算） 的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)抑值至約6.5,在反應(yīng)體系中添加100U/L肌酸 激酶及300U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為6.5，溫度為37°(：。
[01%] 反應(yīng)7小時后，憐酸肌酸生成量約為21g/L，約90%^上4了?轉(zhuǎn)化為40?。冊1(：檢測條 件同實施例2步驟(1)。
[0127] (2)在過濾器中分離肌酸激酶和ATP再生酶：
[0128] 通過超濾方法，將步驟（1)的反應(yīng)體系的反應(yīng)液經(jīng)過過濾器過濾分離肌酸激酶和 ATP再生酶，過濾器內(nèi)裝膜包(購于化11公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的 反應(yīng)液，含有憐酸肌酸、ATP、ADP及鹽等物質(zhì)，可通過離子交換層析等方式進(jìn)一步純化。
[0129] 檢測到回收的肌酸激酶和化P酶的活性較反應(yīng)前減少10 % -20 %不等，可添加相應(yīng) 新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。
[0130] 實施例9酶促法生產(chǎn)1，6-二憐酸果糖偶聯(lián)ATP再生體系（固定化酶）
[0131] 參見圖4,固定酶法制備1,6-二憐酸果糖同時偶聯(lián)ATP再生體系的操作步驟如下：
[0132] (1)催化用酶與ATP再生酶的固定：
[0133] 催化用酶果糖激酶(FK)和憐酸果糖激酶(PFK)通過商購獲得，同實施例1中初步純 化的ATP再生酶Mk酶和化P酶分別W商業(yè)化的環(huán)氧基固定化載體LX1000EP或含氨基合成高 聚物載體LXl OOOHA固定。
[0134] 分別將FK、PFK、A化和化P酶制成酶液，各化，4種酶液活性均為200-400U。
[01巧]在恒溫攬拌罐中加入LX1000EP濕載體化g與FK酶液化混合，在20°C條件下，ISOrpm 攬拌12小時。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0憐酸鐘緩沖液清洗2遍，即得固定化F邱每。A化 酶W相同方法固定。
[0136] 在恒溫攬拌罐中加入LX1000HA濕載體Ikg與PFK酶液3L混合，在20°C條件下， 150巧m攬拌12小時。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0憐酸鐘緩沖液清洗2遍，即得固定化PFK 酶。Pap酶W相同方法固定。
[0137] (2)在反應(yīng)柱中生成1，6-二憐酸果糖：
[0138] 配制反應(yīng)液，每50L含有底物1.1kg果糖，W及0.75kgATP、0.25kg憐酸二氨鐘、 0.2kg氯化鐘、0.6kg硫酸儀和1.25kg四聚憐酸鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào) 節(jié)抑值至約8.0，溫度升為40-45°C。
[0139] 將上述步驟（1)中的固定酶混合裝入反應(yīng)柱，共約4kg，排盡氣泡后制得酶反應(yīng)柱。 使用恒流累將反應(yīng)液WlOLA流速由下而上緩慢累入通過酶反應(yīng)柱，反應(yīng)期間控制溫度為 42°C。循環(huán)反應(yīng)約6小時后，收集反應(yīng)液，檢測1,6-二憐酸果糖的生成量約為36g/L，50%W 上ATP轉(zhuǎn)化為ADP、AMP。
[0140] 固定化酶循環(huán)反應(yīng)20次W上或者-4°C儲存時間一月W上，酶活性降低約10-15%， 需按比例補(bǔ)加或更換部分新酶。
[0141] 實施例10無細(xì)胞蛋白表達(dá)A化酶偶聯(lián)ATP再生體系
[0142] 無細(xì)胞蛋白表達(dá)A化酶同時偶聯(lián)ATP再生體系的操作步驟如下：
[0143] (1)表達(dá)載體PIVEX2.4d-a化的構(gòu)建：
[0144] 根據(jù)adk基因的序列，設(shè)計一對擴(kuò)增引物，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成，引 物序列如下：
[0145] a化正義引物：5 ' -TCCATGGGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3 ' ；和
[0146] a化反義引物：5 ' -CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3 ' ；
[0147] 參照實施例1所描述方法，PCR擴(kuò)增a化基因片段，使用化O I和BamH I雙酶切后，連 接至PIVEX2.4d載體(購于Roche公司），構(gòu)建成PIVEX2.4d-adk載體，經(jīng)測序正確。
[0148] (2)大腸桿菌無細(xì)胞抽提物制備：
[0149] 將E.COli A19(缺失核酸酶I基因，不降解外源基因）單克隆接入LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至 對數(shù)生長期后接入含化發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至ODsoo達(dá)到3時離屯、收集菌體。LB培養(yǎng) 基及發(fā)酵培養(yǎng)基成分參見實施例1。
[0150] 用S30緩沖液重懸菌體，4°C離屯、洗涂3次，收集菌體，保存于-80°CdS30緩沖液成分 為：14mM醋酸儀、60mM醋酸鐘、ImM二硫蘇糖醇(DTT)及1 OmM TriS (pH值8.1)。
[01引]稱量菌體重量，每10克菌體加入100mL S30緩沖液重溶，同時加入ImM DTT。在 7化化壓力下高壓均質(zhì)破碎菌體，再加入ImM DTT，4°C離屯、收集上清。在恒溫?fù)u床中l(wèi)(K)rpm、 37°C解育30分鐘，制得大腸桿菌無細(xì)胞抽提物。
[0152] (3)使用無細(xì)胞抽提物表達(dá)蛋白偶聯(lián)ATP再生體系
[0153] 在I(K)山蛋白表達(dá)體系中，加入20山步驟(2)所述大腸桿菌無細(xì)胞抽提物，加入15ii g/ml步驟（1)所述表達(dá)載體piVEX2.4d-a化，加入15mM醋酸儀、50mM醋酸錠、50mM肥陽S-氨 氧化鐘（抑值7.5)、2%口668000、2111]\101'1'、0.33111]\1魁擴(kuò)、0.27111]\1輔酶4、4111]\1草酸、11]/41了7 RNA聚合酶、IOmM ATPUmM GTP、ImM CTP、ImM UTP W及20種氨基酸各2mM，同時加入IUAU A化酶、IUAU Pap酶W及IOmM四聚憐酸鹽用作ATP再生。在恒溫?fù)u床中2(K)巧m、30°C反應(yīng)6小 時。
[0154] 圖6為所表達(dá)Adk酶的SDS-PAGE圖，如圖所示:泳道1為蛋白標(biāo)志物14.4-116kDa(購 于北京中科瑞泰生物技術(shù)有限公司）；泳道2為無細(xì)胞表達(dá)的Adk酶，約25kDa。
[01巧]對比例1酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸
[0156] 酶法制備憐酸肌酸的操作步驟如下：
[0157] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.5kg肌酸，W及6. Okg ATP、 0.5kg憐酸氨二鋼、0.38kg氯化鐘、0.3kg氯化鋼、0.2kg硫酸錠和1. Okg六水氯化儀的溶液， 配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至約7.5,在反應(yīng)體系中添加500U/L肌酸激酶開始 反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.5,溫度為35 °C。
[015引反應(yīng)5小時后，憐酸肌酸生成量約為15g/L，約90%W上ATP轉(zhuǎn)化為ADP、AMP。HPLC檢 測條件同實施例2步驟(1)。
[0159] 對比實施例2可W看出：沒有偶聯(lián)適合酶法生產(chǎn)的ATP再生系統(tǒng)，反應(yīng)體系需要的 ATP量大大增加，且反應(yīng)生成的產(chǎn)物量明顯減少，從而加大了生產(chǎn)成本。
[0160] 對比例2酶促法生產(chǎn)憐酸肌酸偶聯(lián)單一 ATP再生酶體系
[0161 ]酶法制備憐酸肌酸并偶聯(lián)單一ATP再生酶體系的操作步驟如下：
[0162] 在反應(yīng)罐中，IOOL無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.5kg肌酸，W及1.0kg ATP、 0.5kg憐酸氨二鋼、0.38kg氯化鐘、0.3kg氯化鋼、0.2kg硫酸錠、1. Okg六水氯化儀和2. Okg四 聚憐酸鋼的溶液，配制時均勻攬拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至約7.5,在反應(yīng)體系中添加 500U/L肌酸激酶及2500U/L巧k2酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.5，溫度為35°C。
[0163] 反應(yīng)6小時后，憐酸肌酸生成量約為20g/L，約90%W上ATP轉(zhuǎn)化為ADP、AMP。HPLC檢 測條件同實施例2步驟(1)。
[0164] 對比實施例2及對比例1可W看出：偶聯(lián)一種ATP再生酶的體系的再生效果沒有偶 聯(lián)兩種或者S種ATP再生酶組合體系的效果好:反應(yīng)總體需要的酶量需要增加，且生成產(chǎn)物 量有所減少，反應(yīng)時間增長。但是此方法的優(yōu)點在于可W降低ATP的使用量，使反應(yīng)中的ATP 部分得到再生，從而降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明采用新型巧k、Adk、化pS種ATP再生酶，酶促反應(yīng) 中消耗的ATP可被循環(huán)再生，從而大大降低ATP用量，且再生過程簡單高效，反應(yīng)容易控制， 穩(wěn)定性高;其次，反應(yīng)需添加的底物多聚憐酸或其鹽價格低廉，污染小，且對反應(yīng)用酶的影 響較小;再次，酶促反應(yīng)不需要添加高價的ATP起始反應(yīng)，添加 ADP或者廉價的AMP，從及立種 物質(zhì)的任意兩種或S種組合均可W正常進(jìn)行催化反應(yīng);最后，建立了 ATP再生酶回收體系， 適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[01化]本發(fā)明中所描述的ATP再生體系還可應(yīng)用于多種依賴ATP的酶促反應(yīng)。還還可應(yīng)用 于無細(xì)胞蛋白合成等消耗生物能量的新技術(shù)中。
[0166]雖然本發(fā)明已W實施例公開如上，然其并非用于限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，均可作各種不同的選擇和修改，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
【主權(quán)項】
1. 一種酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 制備并獲得ATP再生酶： 通過基因工程改造、發(fā)酵、純化或自然提取來獲得ATP再生酶;該ATP再生酶是以游離酶 的形式制成酶液或干粉，或是以固定化酶形式固定于固定化載體上； (2) 反應(yīng)液中ATP的再生： 添加 ATP、ADP和AMP的一種或多種組合，進(jìn)行酶促反應(yīng)； 添加 ATP再生酶； 添加多聚磷酸或其鹽為磷酸供體，進(jìn)行ATP再生反應(yīng)； (3) 分離產(chǎn)物和ATP再生酶： 固定化的ATP再生酶在反應(yīng)罐中直接分離;或 游離的ATP再生酶通過濾器中超濾膜分離;經(jīng)過濾器的截留液為回收的ATP再生酶，濾 出液為分離出酶之后含產(chǎn)物的反應(yīng)液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟： (4) 回收的ATP再生酶重復(fù)利用于步驟(2)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述ATP再生酶選自于多聚 磷酸激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶(Pap)的一種或多種組 合。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，當(dāng)選用Ppk和Adk兩種酶組 合時，Ppk與Adk活性比例為（10-0.1): 1;當(dāng)選用Ppk和Pap兩種酶組合時，Ppk與Pap的活性比 例為（10-0.1): 1;當(dāng)選用Pap和Adk兩種酶組合時，Pap與Adk活性比例為（10-0.1): 1;當(dāng)選用 Ppk、Pap和Adk三種酶組合時，Ppk、Pap與Adk活性比例為（10-0 · 1): (10-0 · 1): 1。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述固定化ATP再生酶通過 吸附、包埋、共價、結(jié)合和交聯(lián)的一種或多種方式固定于固定化載體;三種ATP再生酶可分別 固定或按比例混合后一起固定。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，所述步驟（2)中ATP再生反 應(yīng)條件如下： 反應(yīng)溫度為25-60 °C; 反應(yīng)pH為5-10; 酶促反應(yīng)體系包括:ATP、ADP和AMP中的一種或多種組合，三種物質(zhì)根據(jù)需求按任意比 例添加； 再生反應(yīng)體系包括:多聚磷酸或其鹽，鎂離子和/或錳離子，銨離子、鉀離子和鈉離子的 一種或多種，Tris或磷酸根離子。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶法再生ATP的方法，其特征在于，多聚磷酸或其鹽的摩爾濃 度為反應(yīng)添加的ATP、ADP和AMP的一種或多種的摩爾濃度總和的0.01-40倍;鎂離子濃度為 0.01 -0.2M;錳離子濃度為0.01 -0.15M;鉀離子濃度為0.01-0.5M;鈉離子濃度為0.01 -0.5M; 銨離子濃度為〇. 005-0.2M; Tris濃度為0.01-0.1M、磷酸鹽濃度為0.01-0.1M。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的酶法再生ATP的方法的應(yīng)用，其特征在于，所 述方法用于多種依賴ATP的酶促反應(yīng)，用于合成物質(zhì)以及無細(xì)胞表達(dá)蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶法再生ATP的方法的應(yīng)用，其特征在于，所述依賴ATP的酶促 反應(yīng)為轉(zhuǎn)移磷酸根基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶所參與的酶促反應(yīng)，以及部分連接酶所參與的酶促反應(yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的酶法再生ATP的方法的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移磷酸根基 團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶所參與的酶促反應(yīng)為酶法合成磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1，6_二磷酸 果糖、3-磷酸甘油、氧化型輔酶11^10\(：1'(0)?、61'(0汗及1]1'(0汗的反應(yīng) ;所述部分連接酶所 參與的酶促反應(yīng)為酶法合成乙酰輔酶A、肌肽、腸桿菌素、谷氨酰胺及L-茶氨酸的反應(yīng)。
【文檔編號】C12P21/02GK105861598SQ201610268246
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】劉珊珊, 于鐵妹, 秦永發(fā)
【申請人】深圳市古特新生生物科技有限公司