一種糞便菌群體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于糞菌移植技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糞便菌群體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基pH為6.0?8.0,其主要成分為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖、半胱氨酸、膽鹽、纖維二糖、果糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素K、硫酸亞鐵、血紅素、1M CaCl2溶液、蒸餾水；該培養(yǎng)基的組成及各組分的含量決定了其培養(yǎng)獲得的菌群中益生菌的含量、桿菌球菌的比例、革蘭氏陽性菌陰性菌的比例等與原始菌群一致，采用本發(fā)明組分及配比的培養(yǎng)基，能很好的培養(yǎng)出與新鮮糞便菌群比例基本保持一致的菌群。本發(fā)明所采用的糞便菌群體外培養(yǎng)方法簡單、操作條件可精確控制，使用該方法制備的糞便菌群比例穩(wěn)定、重復(fù)性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
_種異便菌群體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于糞菌移植技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糞便菌群體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]人的胃腸道內(nèi)寄居著約1000至1050種微生物，數(shù)量達(dá)10萬億個(gè)，這些微生物稱為腸道菌群。人體正常的腸道微生物能合成多種人體生長發(fā)育必需的維生素，參與腸上皮的生長分化和有毒有害物質(zhì)的分解，形成防御屏障參與免疫過程。飲食結(jié)構(gòu)、壓力和抗生素使用等改變?nèi)梭w內(nèi)環(huán)境的因素都會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而引起多種疾病的發(fā)生，包括多種胃腸道疾病和以糖尿病為代表的慢性代謝類疾病。
[0003]糞菌移植(FMT)，也稱為糞菌治療，是將健康人群糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內(nèi)，重建具有正常功能的腸道菌群，實(shí)現(xiàn)腸道及腸道外疾病的治療。目前，糞菌移植已經(jīng)被視為一種特殊的治療手段，用于難辨梭狀芽孢桿菌感染，炎癥性腸病，腸易激綜合癥、自體免疫性腸病，腸道食物過敏等疾病，但是由于糞便供體篩選極其嚴(yán)格，糞便需要現(xiàn)取現(xiàn)用，極大的限制了該技術(shù)的應(yīng)用。申請?zhí)枮?01510619640.5的中國發(fā)明專利公開了一種人工培養(yǎng)糞便菌群移植在腸道疾病治療中的應(yīng)用，該發(fā)明分離得到單一腸道菌群，通過糞菌移植，實(shí)現(xiàn)了調(diào)節(jié)和恢復(fù)人體腸道內(nèi)環(huán)境和菌群組成的目的，但是該菌群只實(shí)現(xiàn)了對(duì)單一菌群的分離和培養(yǎng)，對(duì)糞便中其他對(duì)人體有益菌群沒有研究；申請?zhí)枮?00810048065.8的中國發(fā)明專利公開了一種人腸道菌群連續(xù)培養(yǎng)的系統(tǒng)及方法，該發(fā)明著重介紹了培養(yǎng)前后優(yōu)勢菌群和代謝產(chǎn)物(主要是短鏈脂肪酸)的變化，但從公開的說明書和權(quán)利要求書來看，其工藝還比較粗糙、操作復(fù)雜、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件只適合幾種特定的優(yōu)勢菌生長。盡管其也對(duì)發(fā)酵前后的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)方法的限制，
【發(fā)明人】只是采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法對(duì)腸道中有限的幾種可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌進(jìn)行了比較，而腸道中大于80%的菌到目前為止還是不能在體外進(jìn)行純培養(yǎng)，這在一定程度上影響了其結(jié)果的可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠滿足糞便菌群生長需要的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基基本上滿足糞便中所有的菌群富集生長。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種糞便菌群體外培養(yǎng)方法，該方法操作簡單，條件控制精確，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種糞便菌群體外培養(yǎng)基，PH為6.0-8.0;每1000毫升中含有蛋白胨2-3克，酵母粉1_2克，牛肉膏2-4克，葡萄糖0.5-1克，半胱氨酸0.5-1克，膽鹽0.5-2克，纖維二糖1-2克，果糖1-2克，硫酸鎂0.02-0.04克，磷酸二氫鉀2-3克，維生素K 0.002-0.004克，硫酸亞鐵0.001-
0.002克，血紅素0.003-0.005克，IM CaCl2溶液0.3-0.5毫升，余量為蒸餾水。
[0007]上述培養(yǎng)基，優(yōu)選的，pH為7.0;每1000毫升中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，膽鹽1.2克，纖維二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸鎂0.03克，磷酸二氫鉀2.5克，維生素K 0.003克，硫酸亞鐵0.001克，血紅素0.004克，IM CaCl2溶液0.4毫升，余量為蒸餾水。
[0008]一種采用上述培養(yǎng)基的糞便菌群體外培養(yǎng)方法，采用以下步驟:
(1)原始糞便菌群制備:
a.生理鹽水中加入0.05-0.1^%的除氧劑，完全溶解，通過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液；
b.采集健康人群的新鮮糞便，加入步驟a所述洗脫液，充分懸浮后，過濾得濾液;洗脫液的加入量為每克新鮮糞便中加入2-1 Oml ；
c.將步驟b中所得濾液依次通過2mm濾網(wǎng)和0.5mm濾網(wǎng)，所得濾液8000-10000rpm離心1-5min，得沉淀物；
d.在步驟c得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液重懸，即得原始糞便菌群;磷酸鹽緩沖液的pH為6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量為每克新鮮糞便中加入2_5ml ；
(2)原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng)
a.在無菌、厭氧條件下，取步驟(I)得到的原始糞便菌群，以5-10v%接種至所述的培養(yǎng)基中，在溫度37 ± 1° C、厭氧條件下培養(yǎng)36-72h，得液體發(fā)酵液；
b.步驟a得到的液體發(fā)酵液8000-10000rpm離心l-5min，得沉淀物；
c.在步驟b得到的沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液重懸，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液的pH為6.5-7.5，含有15-20￥%甘油，加入量為每克新鮮糞便中加入2-51111。
[0009]優(yōu)選地，糞便菌群體外培養(yǎng)方法步驟(I)所述的除氧劑為半胱氨酸或保險(xiǎn)粉。
[0010]優(yōu)選地，糞便菌群體外培養(yǎng)方法步驟(I)所述的濾液通過0.5mm濾網(wǎng)2次。
[0011]糞便菌群體外培養(yǎng)方法步驟(I)所述的健康人群的篩選條件為:(I)常規(guī)血液檢查正常；(2)近3-6個(gè)月內(nèi)沒有發(fā)生腹瀉且沒有使用過抗生素；(3)無傳染性疾?。?4)無糖尿病及惡性腫瘤病史；(5)沒有胃腸道疾病；(6)沒有胃腸道手術(shù)史；(7)沒有系統(tǒng)自身免疫疾病及過敏性疾病;(8)沒有代謝疾病。
[0012]糞便菌群體外培養(yǎng)方法步驟(I)所述的新鮮糞便為排出體外2h以內(nèi)的糞便。糞便菌群體外培養(yǎng)方法步驟(2)所述的厭氧條件培養(yǎng)時(shí)間為50-56h。
[0013]本發(fā)明的培養(yǎng)基呈液態(tài)，其組成及各組分的含量決定了其培養(yǎng)獲得的菌群中益生菌的含量、桿菌球菌的比例、革蘭氏陽性菌陰性菌的比例等與原始菌群一致，采用本發(fā)明組分及配比的培養(yǎng)基，能很好的培養(yǎng)出與新鮮糞便菌群比例基本保持一致的菌群。除此之外，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)糞便菌群時(shí)，36小時(shí)就可達(dá)到生長指數(shù)期，并能最大程度的復(fù)制糞便菌群。
[0014]有益效果
(I)本發(fā)明首次公開了一種基本上滿足糞便中所有菌群富集生長的培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)糞便菌群時(shí)，菌群繁殖速度快;所培養(yǎng)出的菌群與健康人群新鮮糞便菌群比例基本保持一致。
[0015](2)本發(fā)明所采用的糞便菌群體外培養(yǎng)方法簡單、操作條件可精確控制，使用該方法制備的糞便菌群比例穩(wěn)定、重復(fù)性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例培養(yǎng)前后菌群結(jié)構(gòu)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]結(jié)合實(shí)施例和對(duì)比例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0018]實(shí)施例1
本實(shí)施例的體外培養(yǎng)基中，每1000毫升培養(yǎng)基中含有蛋白胨2克，酵母粉I克，牛肉膏2克，葡萄糖0.5克，半胱氨酸0.5克，膽鹽0.5克，纖維二糖I克，果糖I克，硫酸鎂0.02克，磷酸二氫鉀2克，維生素K0.002克，硫酸亞鐵0.001克，血紅素0.003克，IM CaCl2溶液0.3毫升，余量為蒸餾水;用6M氫氧化鈉溶液或者鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6。
[0019]本具體實(shí)施例的體外培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1.原始糞便菌群制備:
(1)稱取10g生理鹽水，加入0.05g半胱氨酸，半胱氨酸完全溶解后，過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液；
(2)稱取健康人群新鮮糞便10g，加入20ml洗脫液，使用勻漿機(jī)充分懸浮后，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，得到的濾液依次過2mm濾網(wǎng)I次和0.5mm濾網(wǎng)I次，所得濾液8000rpm離心5min，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液20ml重懸，即為原始糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液pH為6.5，含有3ml甘油。
[0020]2.原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng)
(1)在無菌、厭氧條件下，將原始糞便菌群5ml接種至含10ml培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)瓶中，在溫度36°C、厭氧條件下培養(yǎng)36h，得液體發(fā)酵液；
(2)得到的液體發(fā)酵液8000rpm離心5min，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液20ml重懸，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液pH為6.5，含有3ml甘油。
[0021 ]本實(shí)施例中，健康人群為健康人員I和健康人員2，取兩健康人員的新鮮糞便，分別經(jīng)過上述處理后得體外培養(yǎng)糞便菌群I和體外糞便菌群2，利用16SrDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后得到的2份糞便菌群與原始菌群在結(jié)構(gòu)上無顯著差異，如圖1中I和2樣本。
[0022]實(shí)施例2
本實(shí)施例的體外培養(yǎng)基中，每1000毫升培養(yǎng)基中含有蛋白胨3克，酵母粉2克，牛肉膏4克，葡萄糖I克，半胱氨酸I克，膽鹽2克，纖維二糖2克，果糖2克，硫酸鎂0.04克，磷酸二氫鉀3克，維生素K0.004克，硫酸亞鐵0.002克，血紅素0.005克，IM CaCl2溶液0.5毫升，余量為水；用6M氫氧化鈉溶液或者鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為8。
[0023]本具體實(shí)施例的體外培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1.原始糞便菌群制備:
(1)稱取10g生理鹽水，加入0.1g保險(xiǎn)粉，保險(xiǎn)粉完全溶解后，過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液；
(2)稱取1g健康人群的新鮮糞便，加入10ml洗脫液，使用勻漿機(jī)充分懸浮后，用三層醫(yī)用紗布過濾得濾液，得到的濾液依次過2mm濾網(wǎng)I次和0.5mm濾網(wǎng)2次，所得濾液1000rpm離心Imin，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液50ml重懸，即為原始糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液pH為7.5，含有1ml甘油。
[0024]2.原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng)
(1)在無菌、厭氧條件下，將原始糞便菌群8ml接種至含10ml培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)瓶中，在溫度38°C、厭氧條件下培養(yǎng)72h，得液體發(fā)酵液；
(2)得到的液體發(fā)酵液IOOOOrpm離心Imin，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液50ml重懸后，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液pH為7.5，含有I Oml甘油。
[0025]本實(shí)施例中，健康人群為健康人員3和健康人員4，取兩健康人員的新鮮糞便，分別經(jīng)過上述處理后得體外培養(yǎng)糞便菌群3和體外糞便菌群4，利用16SrDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后得到的2份糞便菌群與原始菌群在結(jié)構(gòu)上無顯著差異，如圖1中3和4樣本。
[0026]實(shí)施例3
本實(shí)施例的體外培養(yǎng)基中，每1000毫升培養(yǎng)基中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，膽鹽1.2克，纖維二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸鎂0.03克，磷酸二氫鉀2.5克，維生素K 0.003克，硫酸亞鐵0.001克，血紅素0.004克，IM CaCl2溶液
0.4毫升，余量為蒸餾水;用6M氫氧化鈉溶液或者鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為8。
[0027]本具體實(shí)施例的體外培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1.原始糞便菌群制備:
(1)稱取10g生理鹽水，加入0.0Sg半胱氨酸，待半胱氨酸完全溶解后，過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液；
(2)稱取1g健康人群的新鮮糞便，加入60ml洗脫液，使用勻漿機(jī)充分懸浮后，用三層醫(yī)用紗布過濾得濾液，得到的濾液依次過2mm濾網(wǎng)I次和0.5mm濾網(wǎng)2次，所得濾液1000rpm離心Imin，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液40ml重懸后，即為原始糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液PH為7，含有7ml甘油。
[0028]2.原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng)
(1)在無菌、厭氧條件下，將原始糞便菌群1ml接種至含10ml培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)瓶中，在溫度37°C、厭氧條件下培養(yǎng)52h，得液體發(fā)酵液；
(2)得到的液體發(fā)酵液IOOOOrpm離心Imin，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液40ml重懸后，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液PH為7.5，含有7ml甘油。
[0029]本實(shí)施例中，健康人群為健康人員5和健康人員6，取兩健康人員的新鮮糞便，分別經(jīng)過上述處理后得體外培養(yǎng)糞便菌群5和體外糞便菌群6，利用16SrDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后得到的2份糞便菌群與原始菌群在結(jié)構(gòu)上無顯著差異，如圖1中5和6樣本。
[0030]對(duì)比例
對(duì)比例所述培養(yǎng)基組分按g/L計(jì)如下:淀粉5.0，牛奶乳酪蛋白3.0，葡萄糖0.8，半胱氨酸0.4，蛋白胨3.0，脂蛋白0.6，果膠0.6，木聚糖0.6，膽固醇0.2，鵝脫氧膽酸0.2，膽酸0.2，氧化鋯鐵血紅素0.02，磷酸二氫鉀2.0，碳酸氫鈉0.2，氯化鈉4.5，MgS04.7H20 0.5,FeSO4.7H20 0.05,CaCL2.2H20 0.4,Tween80 1.5ml，泛酸0.01，維生素H 0.003，維生素K3 0.001和維生素&0.004，補(bǔ)充蒸餾水至IL，pH6.2-6.6。
[0031 ]本對(duì)比例的體外培養(yǎng)方法包括以下步驟:
1.原始糞便菌群制備:
(1)稱取10g生理鹽水，加入0.0Sg半胱氨酸，待半胱氨酸完全溶解后，過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液；
(2)稱取1g健康人群的新鮮糞便，加入60ml洗脫液，使用勻漿機(jī)充分懸浮后，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，得到的濾液依次過2mm濾網(wǎng)I次和0.5mm濾網(wǎng)2次，所得濾液1000rpm離心Imin，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液40ml重懸后，即為原始糞便菌群;磷酸鹽緩沖液PH為7，含有7ml甘油。
[0032]2.原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng)
(1)在無菌、厭氧條件下，將原始糞便菌群1ml接種至含10ml培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)瓶中，在溫度37°C、厭氧條件下培養(yǎng)52h，得液體發(fā)酵液；
(2)得到的液體發(fā)酵液IOOOOrpm離心Imin，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液40ml重懸后，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液PH為7.5，含有7ml甘油。
[0033]本實(shí)施例中，健康人群為健康人員5和健康人員6，取兩健康人員的新鮮糞便，分別經(jīng)過上述處理后得到對(duì)照菌群5和對(duì)照菌群6，利用16SrDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后得到的2份糞便菌群與原始菌群在結(jié)構(gòu)上無顯著差異，如圖1中對(duì)照5和對(duì)照6樣本。
[0034]圖中BC代表培養(yǎng)之前原始糞便菌群，AC代表采用實(shí)施例培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法培養(yǎng)之后的糞便菌群，對(duì)照代表采用對(duì)比例培養(yǎng)基和方法培養(yǎng)之后的糞便菌群。
[0035]從圖1可以看出:同一個(gè)樣本，其培養(yǎng)前原始菌群(BC1-6)分別與培養(yǎng)后所得菌群(AC1-6)在PCA分析中位置接近，部分樣本基本重合，說明采用以上實(shí)施例中培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的糞便菌群與同一樣本的原始糞便菌群結(jié)構(gòu)組成非常相似;而采用對(duì)比例中培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的對(duì)照組樣本5和6與原始菌群結(jié)構(gòu)組成差異較大，說明本發(fā)明提供的糞便菌群體外培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基基本上滿足了糞便中所有菌群的富集生長。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種糞便菌群體外培養(yǎng)基，其特征在于，pH為6.0-8.0；每1000毫升中含有蛋白胨2_3克，酵母粉1-2克，牛肉膏2-4克，葡萄糖0.5-1克，半胱氨酸0.5-1克，膽鹽0.5_2克，纖維二糖1-2克，果糖1-2克，硫酸鎂0.02-0.04克，磷酸二氫鉀2_3克，維生素K 0.002-0.004克，硫酸亞鐵0.001-0.002克，血紅素0.003-0.005克，IM CaCl2溶液0.3-0.5毫升，余量為蒸餾水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糞便菌群體外培養(yǎng)基，其特征在于，pH為7.0;每1000毫升中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，膽鹽1.2克，纖維二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸鎂0.03克，磷酸二氫鉀2.5克，維生素K 0.003克，硫酸亞鐵.0.001克，血紅素0.004克，IM CaCl2溶液0.4毫升，余量為蒸餾水。3.一種糞便菌群體外培養(yǎng)方法，其特征在于，在發(fā)酵過程中采用權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，采用以下步驟: (1)原始糞便菌群制備: a.生理鹽水中加入0.05-0.1^%的除氧劑，完全溶解，通過0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，濾液為洗脫液； b.采集健康人群的新鮮糞便，加入步驟a所述洗脫液，充分懸浮后，過濾得濾液;洗脫液的加入量為每克新鮮糞便中加入2-1 Oml ； c.將步驟b中所得濾液依次通過2mm濾網(wǎng)和0.5mm濾網(wǎng)，所得濾液8000-10000rpm離心l-5min，得沉淀物； d.在步驟c得到沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液重懸，即得原始糞便菌群;磷酸鹽緩沖液的pH為6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量為每克新鮮糞便中加入2_5ml ； (2)原始糞便菌群擴(kuò)增培養(yǎng) a.在無菌、厭氧條件下，取步驟(I)得到的原始糞便菌群，以5-10v%接種至所述的培養(yǎng)基中，在溫度37 ± 1° C、厭氧條件下培養(yǎng)36-72h，得液體發(fā)酵液； b.步驟a得到的液體發(fā)酵液8000-1OOOOrpm離心l_5min，得沉淀物； c.在步驟b得到的沉淀物中加入磷酸鹽緩沖液重懸，即得體外培養(yǎng)糞便菌群;其中磷酸鹽緩沖液的pH為6.5-7.5，含有15-20￥%甘油，加入量為每克新鮮糞便中加入2-51111。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)所述的除氧劑為半胱氨酸或保險(xiǎn)粉。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)所述的濾液通過0.5mm濾網(wǎng)2次。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)所述的健康人群的篩選條件為: (1)常規(guī)血液檢查正常； (2)近3-6個(gè)月內(nèi)沒有發(fā)生腹瀉且沒有使用過抗生素； (3)無傳染性疾??； (4)無糖尿病及惡性腫瘤病史； (5)沒有胃腸道疾?。? (6)沒有胃腸道手術(shù)史； (7)沒有系統(tǒng)自身免疫疾病及過敏性疾??； (8)沒有代謝疾病。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)所述的新鮮糞便為排出體外2h以內(nèi)的糞便。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)所述的厭氧條件培養(yǎng)時(shí)間為 50-56h。
【文檔編號(hào)】C12N1/00GK105820954SQ201610345667
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】張海燕, 李理想, 戴曉宇, 李棟
【申請人】濟(jì)南萬泉生物技術(shù)有限公司