022] 優(yōu)選地，上述草酸脫簇酶的重組表達(dá)方法中，所述的分子伴侶為pG-UE8、pGro7、 地巧7、pGTf2和pTfl6中的任意一種或者幾種。運(yùn)些分子伴侶均為化kara公司商品化大腸桿 菌分子伴侶，能夠幫助大腸桿菌表達(dá)的外源草酸脫簇酶蛋白進(jìn)行正確折疊，提高表達(dá)效率。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述的草酸脫簇酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1~11任一所示。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0025] 本發(fā)明的草酸脫簇酶為低pH穩(wěn)定的酶，能夠完全適應(yīng)胃內(nèi)的低pH環(huán)境，具有較強(qiáng) 的抗胃蛋白酶降解功能，酶活高，能夠迅速分解食源性草酸，降低草酸的胃腸道吸收，從而 預(yù)防和治療高草酸尿癥。
[0026] 本發(fā)明的重組表達(dá)方法，將低pH穩(wěn)定的OXDC基因成功通過原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表 達(dá)，提高了表達(dá)效率，簡化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0027] 圖1是OXDC基因克隆及表達(dá)載體祀T-22b線性化電泳圖；
[0028] 圖2是金針茹草酸脫簇酶重組表達(dá)電泳結(jié)果，其中，上：菌體破碎上清液，全:菌體 破碎全液，未:未誘導(dǎo)菌體破碎全液;A圖為18°C誘導(dǎo)，B圖為28°C誘導(dǎo)，C圖為37°C誘導(dǎo)；
[00巧]圖3是有助溶標(biāo)簽的祀T-22b-12E-0XDC與不含助溶標(biāo)簽的祀T-22b-0XDC質(zhì)粒表達(dá) 結(jié)果，其中A圖為含助溶標(biāo)簽的草酸脫簇酶;B圖為不含助溶標(biāo)簽的草酸脫簇酶；
[0030] 圖4是CbOl的OXD邱華解食品中草酸效果；
[0031] 圖5是重組表達(dá)的不同來源的OXD邱華解食物中草酸治療高草酸尿癥效果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，W使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W更好地 理解本發(fā)明并能予W實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0033] 實(shí)施例1:草酸脫簇酶的篩選與活力范圍測試
[0034] 本發(fā)明人先后篩選了百余種物種，其中包含茶樹茹(Agrocybe aegirit)，金福茹 (TricholomaLobayensc Heim)，楊樹茹（Agrocybe 切Iin化acea)，枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)，云芝（Coriolus versicolor)，褐腐菌（Postiaplacenta)，藍(lán)藻 (切anobacteria)等物種，篩選到一系列在胃腸道pH環(huán)境(pHl. 5~7.5)中有高效活力的草 酸脫簇酶。
[0035] 篩選方法如下：
[0036] 接種并搖瓶培養(yǎng)菌體，用憐酸調(diào)節(jié)抑至2.5~3.0進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)OXDC，收集菌體，稱 取濕菌體各2g，加入pH 3.0的PBS混勻后用高速勻漿機(jī)9500rpm打碎18s，將離屯、菌體或勻漿 上清加入不同抑的草酸反應(yīng)液(pH1.5~7.5)，37°C，1000rpm反應(yīng)30min;100化2.5mol/L 出S化終止反應(yīng)。12000rpm離屯、，取上清過濾后用高效液相色譜儀化PLC)分析酶活。
[0037] 高效液相色譜條件:流動相為2.5mM此S〇4;分析柱為化rbomix H-NP10(5%)有機(jī) 酸柱;柱溫55 °C ;進(jìn)樣量20化;流速0.6mL/min。
[0038] 1個酶活力單位(IU)是指在特定條件(37°C，pH 3.0)下，在1分鐘內(nèi)能降解1微摩爾 草酸的酶量，或生成1微摩爾甲酸的酶量。
[0039] 表1.不同種屬來源的草酸脫簇酶活力抑范圍及最適抑
[0040]
[0041 ]注:表中最適pH是指待篩選產(chǎn)酶菌的粗酶液在該pH值下活力最大。
[0042] 實(shí)施例2:草酸脫簇酶基因克隆及重組表達(dá)
[0043] 將上述篩選到的性能優(yōu)良的產(chǎn)草酸脫簇酶物種，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并進(jìn)行產(chǎn)酶誘導(dǎo)， 在產(chǎn)酶中期收集菌體提取其總RM并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為CDM，設(shè)計(jì)兼并引物，用RACE (RapidAmplif i cat ion of cDNAElnds) PCR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，操作嚴(yán)格按照Clontech公司的 SMARTer? race cDNAAmplification Kit操作手冊執(zhí)行，其中用到的5'及3'通用引物及基 因定位引物(OXDC GSP primer)如表2所示。擴(kuò)增得到的基因經(jīng)測序篩選得到基因序列，翻 譯后的蛋白序列如表3所示。
[0044] 表2.兼并引物序列
[0045]
[0046] 表3篩選出的低pH穩(wěn)定的草酸脫簇酶 LUU4。」 大刀化'|月〇 : 四里女J=L我
[0049]本發(fā)明人對篩選克隆到的低pH穩(wěn)定的OXDC (包括已經(jīng)報(bào)道過的金針茹OXDC)進(jìn)行 大腸桿菌系統(tǒng)的重組表達(dá)。金針茹OXDC基因已有相關(guān)報(bào)道10余年，參見文獻(xiàn)（Meenu Kesarwani，et.al Oxalate Decarboxylase from Collybia velutipes,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,2000)，金針茹OXDC基因至今尚未成功在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功重 組表達(dá)。鑒于此，本實(shí)施例W金針茹OXDC為例進(jìn)行OXDC大腸桿菌重組表達(dá)方法的闡述。
[(K)加](1)基因克隆
[0051]根據(jù)表達(dá)載體及金針茹OXDC基因序列設(shè)計(jì)克隆引物(表4)，引物設(shè)計(jì)時需要將信 號膚部分的編碼序列去除，直接擴(kuò)增OXDC蛋白的DNA序列，W實(shí)施例2中克隆到的金針茹基 因(VI)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系(表5)及擴(kuò)增條件如下文所述，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。 將表達(dá)載體祀T-22b用PCR方法進(jìn)行線性化(擴(kuò)增含助溶標(biāo)簽的祀T-22b-l沈及不含助溶標(biāo) 簽的祀T-22b兩種序列），引物(表6、表7)，PCR體系（表8)及反應(yīng)條件如下文所示。將載體線 性化產(chǎn)物進(jìn)行化n I酶消化處理，最后進(jìn)行膠回收。將基因產(chǎn)物及線性化載體產(chǎn)物按照摩爾 比為3:1至9:1進(jìn)行無縫連接反應(yīng)，構(gòu)建表達(dá)載體。將無縫連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊a菌種，通過PCR 及測序驗(yàn)證篩選載體構(gòu)建成功的菌株，搖瓶培養(yǎng)抽取表達(dá)質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化含分子伴侶pGro7 的表達(dá)菌株化21(DE3)。
[0化2] 表4. OXDC基因克隆引物 「0化31
[0化6] PCR條件：
[0057] 94。(：預(yù)變性2111111;98。(：變性1036(3;60。(：退火3036(3,68。(：延伸4536(3，循環(huán)30次，68 °C延伸5min，12°C停止反應(yīng)。
[005引（2)載體線性化
[0059]表6.不含助溶標(biāo)簽的載體線性化引物
[0061] ~表7.融合助溶標(biāo)簽(12E)的載體線性化引物
[0062]
[0063]表 8. PCR 體系（50 化）
[00化」PCR條件：
[0066] 94°C 預(yù)變性 2min;98°C 變性 10sec;55°C 退火 30sec，68°C 延伸 3min，循環(huán) 30 次，68°C 延伸5min，12°C停止反應(yīng)。
[0067] 將PCR載體線性化后的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后進(jìn)行化n I的酶切處理，反應(yīng)體系如 表9所示。
[006引 親9_Drm Tl^脈化累化OuT,)
[0069]
[0070]
[OOW Dpn I處理反應(yīng)條件：37°C解育化。
[0072] 將OXDC的PCR產(chǎn)物及化n I處理后線性化載體(含助溶標(biāo)簽及不含助溶標(biāo)簽兩種） 樣品分別經(jīng)膠回收試劑盒進(jìn)行回收，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
[0073] (3)目的基因與線性化載體的無縫連接(WyL)
[0074] 親1 O手:縫祐掠房庶化器
[0075]
[0076] 注：目的基因與載體之間的摩爾比為3:1至9:1。
[0077] 將管中各成分充分混勻后，置于PCR儀中按如下反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：25°C酶切 30min;6(TC連接15min;4°C停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品立即置于冰上。得到重組質(zhì)粒(含 助溶標(biāo)簽的祀T-22b-l沈-OXDC和不含助溶標(biāo)簽祀T-22b-0XDC的兩種）。
[0078] (4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a
[00巧]將無縫連接完的重組質(zhì)粒祀T-22b-0XDC和祀T-22b-12E-0XDC轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a 高效感受態(tài)，37°C過夜培養(yǎng)至長出單克隆，挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測序驗(yàn)證，測序正確 的菌種進(jìn)行保種，并且培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒。
[0080] (5)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株化21 (DE3)
[0081 ]將祀T-22b-0XDC質(zhì)粒(不含助溶標(biāo)簽)轉(zhuǎn)化含有pGro7分子伴侶的化2UDE3)菌種， 分別在不同溫