物技術(shù)有限公司提供），2.0μ1上、下引物，4μ1 ddH20，1.5μ1基因組DNA，PCR擴(kuò)增程序為:94°C預(yù)變性3min，94 °C變性45s，55 °C (部分引物56 °C)退火45s，72°C復(fù)性lmin，35個循環(huán)，72°C延伸7min，最后4°C保存，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以150V為恒定電壓，電泳90分鐘，銀染染色，最后獲得16對具有 多態(tài)性的 SSR 分子標(biāo)記（HD24*，HD25，HD26*，HD34*，HD35*，HD37，HD39，HD43*，HD55*，HD62*， HD63*，HD64，HD74，HD80，HD83*，HD88*)，它們的序列信息見表 1;
[0020] 4、16對羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的評估:將篩選獲得16對多態(tài)性SSR標(biāo)記在安徽 金寨和浙江磐安兩個羊躑躅自然居群(每個居群含21個個體）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增與電泳檢測， 參照20bp DNA ladder，根據(jù)分子量大小對擴(kuò)增結(jié)果讀帶，記錄堿基數(shù)，無條帶記為"0"，得 到SSR表型數(shù)據(jù)，利用Genalex 6.1軟件各SSR位點在不同自然居群中的等位基因數(shù)，觀測雜 合度、期望雜合度以及是否符
[0021 ] Hardy-Weinberg定律等遺傳參數(shù)(見表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每對SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)為 4-16個，雜合度（He)范圍為0.489-0.908,其中HD24，HD26，HD34，HD35，HD43，HD55，HD62， HD63，HD83和HD88偏離Hardy-Weinberg定律，其余的7對SSR標(biāo)記至少是在一個自然居群中 不偏離Hardy-Weinberg定律，表明這些SSR分子標(biāo)記可以用于羊擲躅的遺傳多樣分析和羊 躑躅的保護(hù)與利用研究；
[0022] 5、多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用：為了研究羊躑躅的遺傳多樣性、有效地保護(hù)該物 種，從16多態(tài)性SSR分子標(biāo)記中選取擴(kuò)增效果最好，條帶最清晰的12對SSR分子標(biāo)記(見表2) 在8個羊躑躅自然居群(含193個個體)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的評估分析(參照圖1所示）， 開展羊躑躅的保護(hù)遺傳學(xué)的研究與應(yīng)用，PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及 SSR條帶統(tǒng)計的方法 同上述步驟，統(tǒng)帶結(jié)束后，利用Genalex 6.1軟件計算遺傳多樣性指數(shù)，遺傳距離(D)和遺傳 一致度（I);利用P0PGENE計算Nei ' s多樣性指數(shù)(H)，遺傳分化系數(shù)(Fst)，基因流(Nm)等。在 此基礎(chǔ)上利用Genalex 6.1軟件進(jìn)行主成分分析(Principal coordinate analysis，PCA)， 并分析羊躑躅居群間，居群內(nèi)的遺傳分化水平等，另外，采用PowerMarker V3 · 25軟件對各 位點進(jìn)行分析，得多態(tài)信息量(PIC)指數(shù)，并進(jìn)行非加權(quán)算術(shù)平均聚類(Unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊擲躅 Shannon 多樣性指數(shù) （I) 為 1.768,基因多樣性指數(shù)(Η)為0.777,江西省金溪縣居群的遺傳變異最豐富，而福建政和的 遺傳多樣性水平最低(見表2); PCA分析和UPGMA分析都表明8個自然群體被分為兩組，江西 永修居群獨立為一組(圖2)，建議羊躑躅最好以就地保護(hù)為主，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)金溪、永修居群， 同時增加對政和和京山居群的保護(hù)權(quán)重。
[0023] 表1羊躑躅16對多態(tài)性引物序列特征及其在個自然居群中的遺傳特性
[0024]
[0<
[0026] *表示顯著偏離哈德溫伯定律(p〈0.05) ;F:正向引物;R:反向引物;A:等位基因數(shù)； H。:觀測雜合度;He :期望雜合度.
[0027] 表2羊躑躅8個自然居群的遺傳多樣性
[0028]
[0029]以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范 圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種瀕危羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用的方法，其特征在于，（1)羊躑躅SSR 分子標(biāo)記的獲得:利用簡化基因組測序技術(shù)對瀕危羊躑躅(Rhododendron molle G·Don)基 因組進(jìn)行測序，經(jīng)序列數(shù)據(jù)過濾、聚類和組裝等步驟，得到171.534Mb的基因組序列，包含 498,252〇 〇1^丨88，測序質(zhì)量合格，6(：分布正常，采用33財叟索軟件對(3〇1^丨8序列進(jìn)行331?檢測 搜索，最后從11，961微衛(wèi)星位點中開發(fā)得到11，687SSR分子標(biāo)記； (2) SSR分子標(biāo)記的篩選與合成:從11，687SSR分子標(biāo)記中選取94對SSR進(jìn)行遺傳多樣性 的篩選鑒定，SSR分子標(biāo)記初選的條件是2個堿基重復(fù)單元的SSR需要有10~15個拷貝的重 復(fù)，3個堿基重復(fù)單元的SSR需要有6~12個拷貝的重復(fù)，開發(fā)設(shè)計好的SSR分子標(biāo)記引物序 列合成； (3) 羊躑躅多態(tài)性SSR的鑒定:采用不同地理分布的羊躑躅DNA對合成94對SSR引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后從94對SSR引物中獲得16對的多態(tài)性SSR分子標(biāo) 記，見表1; (4) 羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的有效性評估:將篩選獲得16對多態(tài)性SSR標(biāo)記在2個羊 躑躅自然居群，每個居群含21個個體，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評估分析了這16對多態(tài)性SSR標(biāo)記能夠 用于羊躑躅的遺傳多樣性分析和保護(hù)生物學(xué)研究，見表1; (5) 多態(tài)性SSR分子標(biāo)記應(yīng)用:運用本研究獲得的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在8個羊躑躅自然 居群，含193個個體，進(jìn)行了遺傳多樣性分析，獲得了一些保護(hù)羊躑躅的科學(xué)依據(jù)，即羊躑躅 Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.768，基因多樣性指數(shù)Η為0.777，江西省金溪縣居群的遺傳變異 最豐富，而福建政和的遺傳多樣性水平最低，見表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8個自然群 體被分為兩組，江西永修居群獨立為一組，羊躑躅最好以就地保護(hù)為主，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)金溪、 永修居群，同時增加對政和和京山居群的保護(hù)權(quán)重。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種瀕危羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用的方法，利用簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)得到11,687對羊躑躅SSR分子標(biāo)記，從中鑒定獲得了16對多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，它們能夠檢測到羊躑躅基因組的SSR位點信息，其有效等位基因數(shù)范圍為3-15個，雜合度(He)范圍為0.489-0.908。本發(fā)明提供一批可用于群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護(hù)生物學(xué)等研究的SSR引物，應(yīng)用這些多態(tài)性SSR分子標(biāo)記能評估分析瀕危羊躑躅遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為該物種的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)和參考。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105624282
【申請?zhí)枴緾N201510883572
【發(fā)明人】羅向東, 程馬龍, 戴亮芳, 田歡, 謝建坤
【申請人】江西師范大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2015年12月4日