e水溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于-80°C保存。使用Nanodrop ND-1000檢測提取的總RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值為2.08，表明RNA純度較好。提取的總RNA的平均濃度為9.37ug/ul，總RNA的提取量為187.4ug。電泳檢測RNA完整性見圖2，清楚看到二條條帶包括28SrRNA和18SrRNA，初步判定RNA完整性較好。
[0039]實施例2
[0040]斑馬魚卵母細(xì)胞總RNA提取實驗
[0041]I)斑馬魚卵母細(xì)胞樣品超聲波破碎
[0042]①取于-80°C保存在無RNA酶EP管(1.5mL)中的斑馬魚卵黃生成后期的卵母細(xì)胞，約30粒，迅速將EP管安放于用液氮預(yù)冷的EP管盒中，加入Iml RNAiso Plus。
[0043]②超聲波處理器用之前將變幅桿特別是超聲破碎頭用DEPC水浸泡24h，然后高壓滅菌，消除RNA酶污染。
[0044]③將盛有斑馬魚卵母細(xì)胞的無RNA酶EP管轉(zhuǎn)移至冰水混合的EP管盒中，超聲波處理器變幅桿浸入RNAiso Plus深度為1.0cm左右，探頭要居中，不要貼壁。
[0045]④連接電源，設(shè)定處理器超聲模式，Pattern鍵是選擇超聲波模式鍵，按Pattern鍵可設(shè)定8s脈沖超聲和8s間隔，超聲三次;然后設(shè)定Is超聲和Is間隔，超聲六次；總用時為60秒。確保門關(guān)閉后，ON啟動超聲操作。用完后，OFF關(guān)閉儀器。
[0046]⑤將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶EP管中，室溫靜置lOmin。以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心5min，小心吸取上清液(約700ul)，移入新的無RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。
[0047]2)總RNA的提取
[0048]①在上述離心管中加入RNAiso Plusl/5體積的氯仿(約200ul)，劇烈振蕩15s，小心管蓋突然彈開。待溶液充分乳化后，再室溫靜置5min。以12，OOOg轉(zhuǎn)速，4°C離心15min。從離心機中小心取出EP管，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液(300uI左右)轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶EP管中，切勿吸出白色中間層。
[0049]②向上清液中加入等體積(約300ul)預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒EP管充分混勻后，在20-30°C下靜置lOmin。以12，000g轉(zhuǎn)速，4°C離心lOmin。一般離心后，管底會出現(xiàn)沉淀。
[0050]3) RNA沉淀清洗
[0051 ]小心棄去上清，緩慢地沿EP管壁加入lml75 %的乙醇，輕輕上下顛倒洗滌EP管的管壁，12，000g 4°C離心5min后小心棄去乙醇，盡量除凈乙醇。
[0052]4)RNA溶解與檢測
[0053]室溫干燥沉淀2_5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。使用Nanodrop ND-1OOO檢測提取的總RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值為2.10，表明RNA純度較好。提取的總RNA的平均濃度為8.24ug/ul，總RNA的提取量為164.8ug。電泳檢測RNA完整性見圖2，清楚看到二條條帶包括28SrRNA和18SrRNA，初步判定RNA完整性較好。
[0054]實施例3
[0055]半滑舌鰨卵母細(xì)胞總RNA提取實驗一普通研磨方法:
[0056]I)半滑舌鰨卵母細(xì)胞樣品研磨和勻漿
[0057]①取于-80°c凍存在無RNA酶EP管(1.5mL)中的半滑舌鰨成熟卵母細(xì)胞約60粒，迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨卵粒，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀；
[0058]②將研磨成粉末狀的樣品用無RNA酶的小鐵勺，從研缽壁上全部刮取下來，然后移入到含有ImL RNAiso Plus的玻璃勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中進(jìn)行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。
[0059]③將勻漿化樣品移到新無RNA酶EP管，室溫靜置5min;然后以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心5min。
[0060]④吸取上清液約500ul，移入新的無RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。
[0061 ] 2)總RNA的提取
[0062]①在上述離心管中加入RNAiSO?11181/5體積的氯仿(約200111)，樣品劇烈振蕩lmin，溶液無分相現(xiàn)象后，再室溫靜置lOmin。以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心15min。從離心機取出離心管，此時樣品分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相；吸取上清液(約220ul)，轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶EP管中，切勿吸入中間蛋白層。
[0063]②加入等體積(約220ul)預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫靜置1min。以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心1min，管底出現(xiàn)沉淀。
[0064]3)RNA沉淀清洗
[0065]小心棄去上清，緩慢地沿EP管壁加入lml75%的乙醇，輕輕上下顛倒洗滌EP管管壁，以12，OOOg轉(zhuǎn)速，4 °C離心5min后小心棄去乙醇，盡量除凈乙醇。
[0066]4)RNA溶解與檢測
[0067]室溫干燥沉淀2_5min，加入20ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于-80°C保存。使用Nanodrop ND-1000檢測提取的總RNA吸光度260nm/280nm比值的平均值為1.83，表明提取RNA中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染比較明顯。提取的總RNA的平均濃度為5.15ug/ul，總RNA的提取量為103ug。電泳檢測RNA完整性見圖3，第一、三、四加樣孔有亮帶初步判定提取的RNA樣品可能有雜質(zhì)，第二個泳道提取RNA樣品有降解。
【主權(quán)項】
1.一種魚類卵母細(xì)胞總RNA的提取方法，其特征在于它包括以下步驟: 1)魚卵母細(xì)胞樣品超聲波破碎 取出-80°C保存卵母細(xì)胞，迅速放于用液氮預(yù)冷的無RNA酶EP管中，加入ImL RNAisoPlus，所述的EP管放置于冰水混合物中，提前將超聲破碎頭部分用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高壓滅菌，消除RNA酶污染，超聲波處理器變幅桿浸入RNAiso Plus深度為0.8-1.2cm,依據(jù)實驗樣品發(fā)育階段，進(jìn)行超聲波模式設(shè)定，超聲處理后，將裂解勻漿液轉(zhuǎn)移至無RNA酶EP管中，室溫靜置1min，以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心5min，吸取上清液，移入新的無RNA酶EP管中; 2)總RNA的提取 向上述裂解勻漿液中加入RNAiso Plus的1/5體積氯仿，樣品劇烈振蕩至溶液無分相現(xiàn)象后，再室溫靜置4-7min，以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心20min從離心機取出離心管，此時樣品分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相;取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶EP管中；加入等體積預(yù)冷的異丙醇，使用渦旋混勻器充分混勻，15-30°C靜置，以12000g轉(zhuǎn)速4°C離心15min，管底出現(xiàn)沉淀； 3)RNA沉淀清洗 小心棄去步驟2)最后一次離心的上清液，緩慢地沿管壁加入75%乙醇Iml洗滌沉淀，以12000g轉(zhuǎn)速4 °C離心5min，除去乙醇，得到RNA沉淀； 4)RNA溶解 室溫干燥步驟3)得到的RNA沉淀，加入RNase-f ree水，60 °C水浴5min后放置在碎冰上，待RNA沉淀完全溶解后于-80 °C保存。
【專利摘要】一種魚類卵母細(xì)胞總RNA的提取方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，所述方法利用化學(xué)法和超聲波破碎物理學(xué)方法相結(jié)合獲得卵母細(xì)胞中含有的總RNA，并保證RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表達(dá)和高通量測序等研究。本發(fā)明在微量卵母細(xì)胞中加入1ml？RNAiso？Plus，可有效去除卵母細(xì)胞中核糖體等成分；分別在加入氯仿和異丙醇后，離心時間均延長了5min，有利于去除蛋白質(zhì)等，并提高所獲的RNA純度與質(zhì)量。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105602944
【申請?zhí)枴緾N201610202508
【發(fā)明人】史寶, 柳學(xué)周, 徐永江, 王濱, 徐濤, 孫中之
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年4月1日