一種魚類卵母細胞總rna的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體地涉及一種魚類卵母細胞總RNA的提取方法。
技術背景
[0002]卵母細胞是一類重要的生殖細胞，其良好的發(fā)育和成熟是雌性動物繁殖能力的重要指征。要想得到更多優(yōu)質的卵母細胞，就要了解雌性動物卵母細胞發(fā)育過程的分子調控機理。純度高、完整性好的卵母細胞總RNA是采用實時熒光定量RT-PCR技術或基于微量RNA的高通量測序技術分析卵母細胞的分子機理的非常重要的前提條件。RNA提取即將細胞破碎裂解，利用相關試劑去除多糖、酚類、蛋白質及DNA等的污染，通過一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終獲得純凈RNA。常用的提取總RNA的方法包括Tr i ZOI試劑快速提取法、RNAi soPlus試劑快速提取法、強變性劑法、熱硼酸鹽法及改良熱硼酸鹽法和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法等。RNAiso Plus是廣譜型總RNA提取試劑，可以迅速破壞細胞結構，使存在于細胞質及核內的RNA釋放出來，并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。RNAi soPlus試劑提取法也是一種較成熟的提取總RNA的方法，但該方法有一定局限性，特別是對于提取魚類卵母細胞的總RNA樣品時，存在提取步驟繁瑣、樣品轉移損失嚴重直接導致提取濃度低、純度差等問題。而且與體細胞相比，在卵母細胞發(fā)生過程中有大量的蛋白質、核糖體和其它細胞成分聚集以支持早期胚胎發(fā)育，這些物質也影響到提取的RNA質量。因此，需要建立一種快速簡便、總RNA純度高、雜質少、得率大，易于操作，便于掌握的微量魚類卵母細胞總RNA提取的方法，以滿足相應的分子生物學實驗。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種魚類卵母細胞總RNA的提取方法，
[0004]以提高母細胞總RNA的提取效率和提取質量，同時增加獲得母細胞總RNA的總量，以滿足分子生物學試驗的需要。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術方案來實現的:
[0006]—種魚類卵母細胞總RNA的提取方法，包括以下步驟:
[0007]I)魚卵母細胞樣品超聲波破碎
[0008]取出-80°C保存卵母細胞，迅速放于用液氮預冷的無RNA酶EP管中，加入ImLRNAiso Plus，所述的EP管放置于冰水混合物中，提前將超聲破碎頭部分用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高壓滅菌，消除RNA酶污染，超聲波處理器變幅桿浸入RNAiso Plus深度為0.8-1.2cm，依據實驗樣品發(fā)育階段，進行超聲波模式設定，超聲處理后，將裂解勻漿液轉移至無RNA酶EP管中，室溫靜置1min，以12000g轉速4°C離心5min，吸取上清液，移入新的無RNA酶EP管中；
[0009]2)總RNA的提取
[0010]向上述裂解勾楽液中加入RNAisoPlus的1/5體積氯仿，樣品劇烈振蕩至溶液無分相現象后，再室溫靜置4_7min，以12000g轉速4°C離心20min從離心機取出離心管，此時樣品分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相;取上清液轉移至另一新的無RNA酶EP管中；加入等體積預冷的異丙醇，使用渦旋混勻器充分混勻，15-30°C靜置，以12000g轉速4 °C離心15min，管底出現沉淀；
[0011]3) RNA沉淀清洗
[0012]小心棄去步驟2)最后一次離心的上清液，緩慢地沿管壁加入75%乙醇Iml洗滌沉淀，以12000g轉速4 °C離心5min，除去乙醇，得到RNA沉淀。
[0013]4) RNA 溶解
[0014]室溫干燥步驟3)得到的RNA沉淀，加入RNase-f ree水，60 V水浴5min后放置在碎冰上，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0015]本發(fā)明的原理是:
[0016]高豐度、高純度、高完整性的卵母細胞RNA提取是在嚴格避免RNA酶污染情況下，利用化學法和超聲波破碎物理學方法相結合獲得卵母細胞中含有的總RNA，并保證RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表達和高通量測序等研究。本發(fā)明在微量卵母細胞(約30粒)中加入Iml RNAiso Plus，可有效去除卵母細胞中核糖體等成分;分別在加入氯仿和異丙醇后，尚心時間均延長了5min，有利于去除蛋白質等，并提尚所獲的RNA純度與質量。
[0017]本發(fā)明優(yōu)點和積極效果如下:
[0018]I)本發(fā)明提取方法，可以提取不同種屬、不同發(fā)育時相的魚類卵母細胞中的總RNA，也可以提取不同發(fā)育時期受精卵的總RNA等，應用范圍廣泛。
[0019]2)用超聲波破碎儀破碎卵母細胞，代替研缽研磨樣品，裂解細胞充分，具有快速簡便，提取的RNA純度高特點;并且在含有RNAiso Plus的離心管內完成細胞破碎，省去以往研缽研磨后樣品干粉末直接暴漏在空氣中并轉移到離心管的步驟，減少了 RNA降解和RNA酶污染，具有RNA損失少等優(yōu)點，提高了獲得的總RNA質量。
【附圖說明】
[0020]圖1為半滑舌觸(Cynoglossus semilaevis)成熟卵母細胞(30粒)提取總RNA的電泳圖譜。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、10bp0
[0021]圖2為斑馬魚(Dan1rer1)卵黃生成后期的卵母細胞(30粒)提取的總RNA的電泳圖譜。M為DNA分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、10bp0
[0022]圖3為半滑舌鰨成熟卵母細胞(60粒)研磨方法提取的總RNA的電泳圖譜1為0嫩分子量標準，大小從上而下依次為2000bp、100bp、750bp、500bp、250bp、10bp。
【具體實施方式】
[0023]下面通過實施例結合附圖來對本發(fā)明的技術方案作進一步解釋，但是本發(fā)明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。
[0024]實施例1
[0025]半滑舌鰨卵母細胞總RNA提取實驗:
[0026]I)半滑舌鰨卵母細胞樣品超聲波破碎
[0027]①取于-80°(:保存在無RNA酶EP管(1.5mL)中的半滑舌鰨成熟卵母細胞，約30粒，迅速將EP管安放于用液氮預冷的EP管盒中，加入Iml RNAiso Plus。
[0028]②超聲波處理器用之前將變幅桿特別是超聲破碎頭用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡24h，然后高壓滅菌，消除RNA酶污染。
[0029]③將盛有半滑舌鰨成熟卵母細胞的無RNA酶EP管轉移至冰水混合的EP管盒中，超聲波處理器變幅桿浸入RNAiso Plus深度為1.0cm左右，探頭要居中，不要貼壁。
[0030]④連接電源，設定處理器超聲模式，Pattern鍵是選擇超聲波模式鍵，按Pattern鍵設定4s超聲和4s間隔，超聲五次;然后設定Is超聲和I s間隔，超聲十次;總用時為60秒。確保門關閉后，ON啟動超聲操作。用完后，OFF關閉儀器。
[0031 ] ⑤將勻漿化樣品移到新無RNA酶EP管，室溫靜置1min，以12000g轉速4 °C離心5min，吸取上清液約700ul，移入新的無RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀。
[0032]2)總RNA的提取
[0033]①在上述離心管中加入RNAiso?11181/5體積的氯仿(約200111)，樣品劇烈振蕩20s，溶液無分相現象后，再室溫靜置1min。以12000g轉速4 °C離心20min。從離心機取出離心管，此時樣品分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相；吸取上清液(約300ul)，轉移至另一新的無RNA酶EP管中；切勿吸入中間蛋白層。
[0034]②加入等體積(約300ul)預冷的異丙醇，使用渦旋混勻器充分混勻，室溫靜置15min。以12000g轉速4°C離心15min，管底出現沉淀。
[0035]3) RNA沉淀清洗
[0036]小心棄去上清，緩慢地沿EP管壁加入lml75%的乙醇，輕輕上下顛倒洗滌EP管的管壁，以12，OOOg轉速，4 °C離心I Omin后除凈乙醇。
[0037]4)RNA溶解與檢測
[0038]室溫干燥沉淀2_5min，加入20ul的RNase-fre