胺或抗壞血酸進(jìn)行激活。此時(shí)，相對(duì)于基質(zhì)，添加的羥胺或抗壞血酸的濃度為I至100倍，更優(yōu)選為3倍至50倍，尤其優(yōu)選為10倍至20倍。通過這種組成，根據(jù)反應(yīng)法I，使ImM的大豆甙元進(jìn)行反應(yīng)，并按時(shí)間利用4倍的乙酸乙酯(ethy Iacetate，EA)或非極性溶劑來提取10uL的反應(yīng)物之后，利用高性能-液相層析進(jìn)行定量分析。根據(jù)定量分析結(jié)果，在反應(yīng)6小時(shí)時(shí)，以100 %收率生產(chǎn)了 ImM的3 ’ -鄰羥基大豆甙元，并將其示于圖7a中。
[0?05]以相同的方法，誘導(dǎo)了染料木素(genistein)及白藜蘆醇(resveratrol)的位置特異性羥基化反應(yīng)，如上所述的單酚型物質(zhì)可通過酪氨酸酶的第一次羥基化反應(yīng)生物轉(zhuǎn)化為功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。染料木素在反應(yīng)I小時(shí)時(shí)，生物轉(zhuǎn)化為95%的二羥四氫黃酮(orobol)，白藜蘆醇在反應(yīng)I小時(shí)時(shí)，生物轉(zhuǎn)化為100%的白皮杉醇(piceatannol)。將其示于圖8及圖9中。
[0106]實(shí)施例5
[0107]生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的分離純化法
[0108]為了分離在實(shí)施例4中生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，利用生成物和反應(yīng)物的溶解度。在堿性緩沖液中，進(jìn)行反應(yīng)而生成的兒茶酚型物質(zhì)形成配位鍵，從而提高親水性(圖10的I部分)。不形成配位鍵體的單酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)在反應(yīng)體積4倍數(shù)的乙酸乙酯(ethyIacetate，EA)中被提取，如圖10的2部分所示，有機(jī)溶劑和水層因比重差異而區(qū)分層。利用滴定管對(duì)上述有機(jī)溶劑和水層進(jìn)行分離，來分離圖10的3-1(水層)和3-2(有機(jī)層)，并使分離的有機(jī)層蒸發(fā)，來使殘留在其內(nèi)的單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)可重新使用于反應(yīng)中。水層利用IM的HCl來降低pH，并利用4倍數(shù)的乙酸乙酯(ethylacetate，EA)來重新提取了兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(圖10的4部分)。提取之后，利用滴定管分離了酸性反應(yīng)液層。就乙酸乙酯(ethylacetate，EA)層而言，利用真空蒸發(fā)器(vacuum evaporator)去除乙酸乙酯(ethylacetate，EA)，且可取得純化的粉形態(tài)的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
[0109]實(shí)施例6
[0110]利用酪氨酸酶的羥基化反應(yīng)生成物的質(zhì)量分析
[0111]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)在實(shí)施例5中生成的多個(gè)功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，其結(jié)果明確示于圖11中。
[0112]具體地，圖1la表示利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)分析從大豆甙元(daidzein)生成的3’-鄰輕基大豆式元(3’-ODI)的結(jié)果，由I表示的保留時(shí)間(retent1ntime )18.18分為通過氣相色譜法(GC)分離的3’-鄰輕基大豆式元，由a表示的486.48、m/z為分子量(TMS)的m/z，由b表示的471.50、m/z為分子量(TMS)_15的m/z，由c表示的383.39、m/z為分子量(TMS)_103的m/z，上述結(jié)果可參照現(xiàn)有論文(Hydroxylat1n of daidzein byCYP107Hlfrom Bacillus subtiIisl68,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,Vol 59,issue 4,August 2009,Pages 248-253)確認(rèn)為3’-鄰輕基大豆式元。
[0113]圖1Ib表示利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析從白藜蘆醇(trans-resveratrol)生成的白皮杉醇(piceatannol)的結(jié)果，由I表示的保留時(shí)間(retent1n time) 14.82分為通過氣相色譜法分離的白皮杉醇，由a表示的532.53、m/z為分子量(TMS)的m/z，由b表示的517.45、m/z為分子量(TMS)_15的m/z，上述結(jié)果可參照現(xiàn)有論文(The cancerpreventative agent resveratrol is converted to the anticancer agentpiceatannol by the cytochrome P450enzyme CYPlBl,British Journal of Cancer(2002) 86，774-778)確認(rèn)為白皮杉醇。
[0114]實(shí)施例7
[0115]高分子上單酚型物質(zhì)向JL茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化:向貽貝蛋白質(zhì)的摹仿
[0116]為了將高分子上的酪氨酸殘基有效地生物轉(zhuǎn)化為多巴殘基，利用除蟲鏈霉菌酪氨酸酶。具有(VPGYG)12(VPGVG)24的共180個(gè)氨基酸序列的彈性蛋白樣多肽(ELP，elastinlike-polypeptide)將以下彈性蛋白樣多肽Y以0.5重量百分比在300uL的pH9的50mM的三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中溶解之后，放入2mM的FeCl3和抗壞血酸、500nM的除蟲鏈霉菌酪氨酸酶，并反應(yīng)兩小時(shí)之后，利用IM的NaOH和IM的HCl來改變pH。在pH5中溶解的彈性蛋白樣多肽_￥在?!17中，以粉的形式沉淀。確認(rèn)到在將pH調(diào)節(jié)為11的情況下，彈性蛋白樣多肽_￥進(jìn)行凝膠化(gelat1n)。確認(rèn)到在重新降低pH的情況下，形成的水凝膠(hydrogel)溶解，從而是具有可逆性的反應(yīng)。這是與摹仿貽貝蛋白質(zhì)的功能的以前的論文相一致的結(jié)果(ProcNatl Acad Sci USA.2011 15,108(7),2651-2655)0
[0117]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0118]本發(fā)明可利用酶反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的批量生產(chǎn)，且可適用于新材料/功能性原料及醫(yī)療用產(chǎn)品的生產(chǎn)。具體地，本發(fā)明根據(jù)酪氨酸酶基質(zhì)特異性，概括從多種單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)向功能性兒茶酚型物質(zhì)的羥基化反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有的難以提取或難以進(jìn)行有機(jī)化學(xué)合成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)，從而可貢獻(xiàn)于其生理學(xué)功效實(shí)驗(yàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)至步驟(C)中的一個(gè)步驟， 步驟(a)，導(dǎo)入還原力來使通過酪氨酸酶的過氧化反應(yīng)生成的醌型結(jié)構(gòu)物質(zhì)還原為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)； 步驟(b)，利用過渡金屬離子或硼離子使生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)形成配位鍵； 步驟(C)，導(dǎo)入還原力來使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟(a)或步驟(C)中使用的還原力從選自由電化學(xué)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、抗壞血酸、半胱氨酸、對(duì)香豆酸、羥胺、兒茶酚、鄰苯三酚及咖啡酸組成的組中的物質(zhì)提供。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜蘆醇、大豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、對(duì)香豆酸、對(duì)硝基苯酚、對(duì)甲酚、對(duì)乙烯基苯酚及鄰氨基苯酚組成的組中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自由木犀草素、3-羥基根皮素、3’-鄰羥基大豆甙元、二羥四氫黃酮、白皮杉醇、羥基酪醇、多巴、咖啡酸、3，4-二羥基硝基苯、3，4-二羥基甲苯及3，4_ 二羥基苯乙烯組成的組中。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，還包括分離純化兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的步驟(d)，在上述步驟(d)中，在有機(jī)溶劑中溶解包含兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生成物來取得水層，降低取得的水層的PH之后，還在有機(jī)溶劑中溶解來取得有機(jī)層，并使有機(jī)層蒸發(fā)來取得j L茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)為高分子上的酪氨酸殘基。7.—種高分子交聯(lián)反應(yīng)方法，其特征在于，利用通過權(quán)利要求6所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法來制備的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明為與利用酪氨酸酶的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生物合成反應(yīng)相關(guān)的技術(shù)，是有效地抑制酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)來選擇性地僅將單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的第一次羥基化反應(yīng)進(jìn)行催化的技術(shù)。本發(fā)明提供以高的生產(chǎn)率和收率生產(chǎn)利用酪氨酸酶的多種功能性兒茶酚型物質(zhì)的技術(shù)。
【IPC分類】A61P35/00, C12P7/22, A61K31/353, C07D311/32
【公開號(hào)】CN105555776
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380077815
【發(fā)明人】金秉祺, 李相赫, 白基憲
【申請(qǐng)人】首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2013年12月17日
【公告號(hào)】WO2014208847A1