利用酪氨酸酶制備的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)、其制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用具有廣的基質(zhì)特異性的酪氨酸酶(tyrosianse)以高的生產(chǎn)率和收率篩選性地從多種單酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(monophenolic compounds)僅生成兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法。由此，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)利用酶反應(yīng)的功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的批量生產(chǎn)，且可適用于原料化及醫(yī)療用產(chǎn)品生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報(bào)告，很多兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(catechol derivatives)在抗氧化、抗癌、抗炎癥或抗病毒等效果中呈現(xiàn)好的生理活性，與單酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(monophenolic compounds)相比，其效果更高。尤其，兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)作為酪氨酸酶(tyrosinase)的抑制劑利用，并具有減少基于酪氨酸酶的黑色素(melanin)的生產(chǎn)的效果。并且，眾所周知，在大豆甙元((^1(^6；[11，來(lái)源于大豆的異黃酮)中，特異性地實(shí)現(xiàn)鄰輕基化(ortho-hydroxyIat1n)的3 ’ -鄰輕基大豆式元(3 ’ -ODI，3 ’ -orthohydorxydaidzein)的一部分存在于熟成的大醬中，預(yù)防由紫外線引起的皮膚癌，并抑制與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的活性(見(:，2010^01.285挪.21458;JBC,2011 ,vo1.286，pp.14246)。作為來(lái)源于序菜素(apigenin)的兒茶酸型物質(zhì)，輕基化的木犀草素(luteol in)在抗氧化性好的洋薊(ari choke)中可提取極少量，據(jù)最新報(bào)告，可在乳腺癌治療中使用(Food Chemistry，2013，"Luteolin sensitises drug-resistanthuman breast cancer cells to tamoxifen via the inhibit1n of eye I inE2express1n〃)。除此之外，眾所周知，橄欖油中的輕基酪醇(hydroxytyrosol)、葡萄酒中的白皮杉醇(piceatannol)等的兒茶酸型物質(zhì)還用作強(qiáng)力的抗氧化劑。高分子物質(zhì)上的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)可摹仿貽貝蛋白質(zhì)的功能，其應(yīng)用領(lǐng)域從醫(yī)療物質(zhì)至表面改性納米工程正廣泛地進(jìn)行研究(Annu Rev Mater Res.2011 I 41:99-132B1fouling 2012,28:8,865-877) ο
[0003]在利用以往的生物催化劑來(lái)生產(chǎn)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的情況下，利用包括P450酶在內(nèi)的多種單加氧酶(mono-oxigenase)。但是，在大部分的單加氧酶的情況下，需要輔酶，并需要用于電子傳遞的雙還原酶(reductase)。這會(huì)影響基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度，并由低的收率和生產(chǎn)率引起。相反，酪氨酸酶的單酚結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化反應(yīng)相對(duì)快(作為參考，來(lái)源于蘑燕類的酪氨酸酶的kcat/Km值為大致lOOOmM—h-1)，不伴隨用于輔酶的電子傳遞反應(yīng)的雙酶。
[0004]但是，酪氨酸酶的問(wèn)題如下:使單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)羥基化，來(lái)在生產(chǎn)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的第一次輕基化反應(yīng)(monophenolase activity)之后，在單酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)中生物轉(zhuǎn)化的兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)借助酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)(dipehnolase activity)生物轉(zhuǎn)化為醌型物質(zhì)(quinonic compounds)。通常，醌型物質(zhì)形成自由基(radical)來(lái)快速形成黑色素(melanin)，生成的黑色素以穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)體具有阻隔紫外線區(qū)域的光的功能。
[0005]酪氨酸酶由活性部位周邊6個(gè)組氨酸(Hi stidine)固定兩個(gè)銅離子，上述兩個(gè)銅離子之間的距離在包括銅的兒茶酚氧化酶(catechol oxidase)和其他酪氨酸酶組中規(guī)定地保持。根據(jù)氧的存在與否，并根據(jù)在兩個(gè)銅之間結(jié)合的氧原子的數(shù)量，酪氨酸酶區(qū)分為三種形態(tài)，即，脫氧形態(tài)(脫氧-酪氨酸酶((16017-171'0 8；[1^86))、氧形態(tài)(氧-酪氨酸酶((《7-tyrosinase))及甲硫氨酸形態(tài)(甲硫氨酸-酪氨酸酶(met_tyrosinase))。
[0006]脫氧形態(tài)(脫氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))為兩個(gè)銅離子之間不包含氧的形態(tài)，若不供給氧，則成為無(wú)法進(jìn)行羥基化及氧化反應(yīng)的非活性體。
[0007]若在空氣中，氧在溶劑中解離或供給過(guò)氧化氫，則在脫氧形態(tài)的兩個(gè)銅離子之間固定一個(gè)氧(02)分子，并將這種形態(tài)稱為氧形態(tài)(氧-酪氨酸酶(oxy-tyrosinase))。在這種氧形態(tài)中，若單酚的氧原子與一個(gè)銅離子相結(jié)合，則開始酪氨酸酶的第一次羥基化反應(yīng)。
[0008]作為上述第一次輕基化反應(yīng)(monophenolase activity)，氧分子鍵斷裂，一個(gè)氧原子與鄰位碳相結(jié)合，插入羥基，在酪氨酸酶的兩個(gè)銅之間僅殘留有一個(gè)氧原子。將這種形態(tài)稱為甲硫氨酸形態(tài)(甲硫氨酸-酪氨酸酶(met-tyrosinase))。此時(shí)，兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)和甲硫氨酸-酪氨酸酶分離，兩個(gè)銅之間的一個(gè)氧原子重新排列已形成的角度，并準(zhǔn)備第二次氧化反應(yīng)(diphenolase activity)。
[0009]甲硫氨酸形態(tài)可使兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化，但不參與單酚型的羥基化反應(yīng)。在第一次羥基化反應(yīng)之后，從芳香環(huán)上的兩個(gè)羥基的殘基中去除氫離子，從而連續(xù)發(fā)生與殘留的一個(gè)氧原子相結(jié)合來(lái)生成水的氧化反應(yīng)。若使用完結(jié)合的兩個(gè)氧原子，則兩個(gè)銅離子之間被空出，并重新回到脫氧形態(tài)。在單酚型初始基質(zhì)中，通過(guò)兩次生物轉(zhuǎn)化(羥基化反應(yīng)及氧化反應(yīng))生成的產(chǎn)物為鄰-苯醌形態(tài)的結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
[0010]在第二次氧化反應(yīng)(diphenolase activity)中，可從兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的兩個(gè)輕基中去除氫，來(lái)與兩個(gè)銅相結(jié)合，一個(gè)氧原子從兒茶酚型物質(zhì)中接收兩個(gè)電子來(lái)還原為水(diphenolase activity)。如上所述，甲硫氨酸形態(tài)可使兒茶酸型結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化，但不參與單酚型的羥基化反應(yīng)。因而，在氧-酪氨酸酶的單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的氧化反應(yīng)之后，生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)無(wú)法由甲硫氨酸-酪氨酸酶氧化的情況下，甲硫氨酸-酪氨酸酶因無(wú)法轉(zhuǎn)換為脫氧-酪氨酸酶而積累，酪氨酸酶被失活。
[00??] 與第一次輕基化反應(yīng)(monophenolase activity)的反應(yīng)速度常數(shù)(kl)相比，第二次氧化反應(yīng)(diphenolase activity)的速度常數(shù)(k2)大大致10倍左右，因而在積累作為中間生成物的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)方面存在困難。酪氨酸酶的研究焦點(diǎn)主要集中在黑色素的形成反應(yīng)和其抑制劑的作用，因而在應(yīng)用其的多種兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)形成反應(yīng)最優(yōu)化技術(shù)中，本研究可視為最初技術(shù)。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0013]專利文獻(xiàn)
[0014]專利文獻(xiàn)1:韓國(guó)特許公開10-2012-0114072
[0015]專利文獻(xiàn)2:韓國(guó)特許登錄10-0878394
[0016]非專利文獻(xiàn)
[0017]非專利文獻(xiàn)1:L-抗壞血酸對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性產(chǎn)生的影響，B1chemJ.19930ctober l；295(Pt 1):309-312
[0018]非專利文獻(xiàn)2:用于單酚酶/雙酚酶激活比率的酪氨酸酶的方向進(jìn)化，Enzyme andMicrobial Technology，Volume 47，Issue 7，8December 2010，Pages 372-376

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]技術(shù)問(wèn)題
[0020]適用生物學(xué)方法的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的代表性生產(chǎn)方法可分為兩種情況，S卩，兒茶酚和其他結(jié)構(gòu)的結(jié)合方法和單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的羥基化反應(yīng)。
[0021 ] 相當(dāng)于第一種情況的代表性反應(yīng)為日本味之素(Aj inomoto)公司多巴(DOPA)生產(chǎn)方法。利用酪氨酸-苯酸裂解酶(tyrosin-phenol Iiase)使兒茶酸、乙酸及氨生物轉(zhuǎn)化為多巴(DOPA)，并最高可生產(chǎn)100g/L左右。為了利用裂解酶生產(chǎn)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，需要篩選與兒茶酚可形成碳-碳鍵的特異性基質(zhì)和相應(yīng)的裂解酶。由此，在多種兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)上存在局限。
[0022]相當(dāng)于第二種情況的苯類結(jié)構(gòu)物質(zhì)或單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的羥基化反應(yīng)有利用單加氧酶(monooxygenase)的方法。單加氧酶作為氧化還原酶的一種，需要借助電子傳遞系統(tǒng)的電子的供給。代表性的單加氧酶反應(yīng)酶為細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)，從位于酶的中心的血紅素(heme)結(jié)構(gòu)的鐵離子的氧化還原作用誘導(dǎo)反應(yīng)。使細(xì)胞色素P450的基質(zhì)特異性轉(zhuǎn)換，從而適用于多種結(jié)構(gòu)的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)。但是，在大部分的單加氧酶的情況下，需要輔酶，并需要用于電子傳遞的雙還原酶(reductase)。這會(huì)影響基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速