度，并由低的收率和生產(chǎn)率引起。
[0023]作為除此之外的其他生物催化羥基化反應(yīng)有酪氨酸酶的應(yīng)用。酪氨酸酶的活性部位主要存在于蛋白質(zhì)表面，在多種兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)中，優(yōu)點(diǎn)為對單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的酪氨酸酶的基質(zhì)特異性廣。并且，酪氨酸酶的單酚結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化反應(yīng)相對快(作為參考，來源于蘑菇類的酪氨酸酶的kcat/Km值為大致lOOOmM—工)，不伴隨用于輔酶的電子傳遞反應(yīng)的雙酶。但在酪氨酸酶的情況下，將多種單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)用作基質(zhì)，從而具有與所提及的上述兩種情況相比，可更快地轉(zhuǎn)換為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，但同時還快速使兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化，從而形成醌形態(tài)。生成的醌型物質(zhì)容易形成自由基，來形成黑色素等的高分子物質(zhì)，或使周邊物質(zhì)氧化。
[0024]為了有效地積累作為中間體的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，需要研究基于醌型物質(zhì)的還原的兒茶酚型物質(zhì)的積累、已積累的兒茶酚型物質(zhì)的氧化防止、隨著兒茶酚型物質(zhì)積累而失活的酪氨酸酶的重新激活。
[0025]本發(fā)明的目的在于，通過如上所述的三種研究，提供利用酪氨酸酶以高的生產(chǎn)率和收率生產(chǎn)功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)方法。
[0026]解決問題的手段
[0027]為了抑制酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)，并有效地生產(chǎn)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，本技術(shù)的戰(zhàn)略大致分為三個部分，即，基于醌型物質(zhì)的還原的兒茶酚型物質(zhì)的積累、已積累的兒茶酚型物質(zhì)的氧化防止、失活的酪氨酸酶的重新激活。
[0028]具體地，第一，本發(fā)明提供如下方法，即，使通過酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)生產(chǎn)的醌型物質(zhì)有效地重新還原為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
[0029]第二，本發(fā)明提供如下方法，S卩，針對通過酪氨酸酶的第一次羥基化反應(yīng)生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，誘導(dǎo)與其他元素的配位鍵，來從酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)中得到保護(hù)。
[0030]第三，本發(fā)明提供有效調(diào)節(jié)酪氨酸酶的三種活性形態(tài)來將酶活性最優(yōu)化的技術(shù)。當(dāng)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)未氧化時，不容易去除甲硫氨酸-酪氨酸酶的一個氧原子，因而酪氨酸酶處于失活狀態(tài)。像這樣處于失活狀態(tài)的酪氨酸酶可借助還原力來重新激活。
[0031]具體地，本發(fā)明提供如下。
[0032](I)利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法的特征在于，其包括以下步驟(a)至步驟(C)中的一個步驟，步驟(a)，導(dǎo)入還原力來使通過酪氨酸酶的過氧化反應(yīng)生成的醌型結(jié)構(gòu)物質(zhì)還原為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì);步驟(b)，利用過渡金屬離子或硼離子使生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)形成配位鍵；以及步驟(C)，導(dǎo)入還原力來使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。
[0033](2)根據(jù)(I)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，在步驟(a)或步驟(C)中使用的還原力從選自由電化學(xué)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、抗壞血酸、半胱氨酸、對香豆酸、羥胺、兒茶酚、鄰苯三酚及咖啡酸組成的組中的物質(zhì)提供。
[0034](3)根據(jù)(I)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜蘆醇、大豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、對香豆酸、對硝基苯酚、對甲酚、對乙烯基苯酚及鄰氨基苯酚組成的組中。
[0035](4)根據(jù)(I)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)選自由木犀草素、3-羥基根皮素、3’-鄰羥基大豆甙元、二羥四氫黃酮、白皮杉醇、羥基酪醇、多巴(dopa)、咖啡酸、3，4-二羥基硝基苯、3，4_二羥基甲苯及3，4_ 二羥基苯乙烯組成的組中。
[0036](5)根據(jù)(I)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，還包括分離純化兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的步驟(d)，在上述步驟(d)中，在有機(jī)溶劑中溶解包含兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生成物來取得水層，降低取得的水層的PH之后，還在有機(jī)溶劑中溶解來取得有機(jī)層，并使有機(jī)層蒸發(fā)來取得j L茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
[0037](6)根據(jù)(I)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，其特征在于，單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)為高分子上的酪氨酸殘基。
[0038](7)高分子交聯(lián)反應(yīng)方法的特征在于，利用通過(6)所述的利用酪氨酸酶從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)制備兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法來制備的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
[0039]發(fā)明效果
[0040]本發(fā)明涉及利用酪氨酸酶的功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的制備及其應(yīng)用，可適用于多種來源的酪氨酸酶。這是根據(jù)酪氨酸酶基質(zhì)特異性概括在多種單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)中向功能性兒茶酚型物質(zhì)的羥基化反應(yīng)的，可實現(xiàn)現(xiàn)有的難提取或難以進(jìn)行有機(jī)化學(xué)合成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)，從而可貢獻(xiàn)于其生理學(xué)功效實驗。最近，有很多對黃酮/異黃酮系列的氫氧化物的抗癌性相關(guān)研究。但是，難以實現(xiàn)位置特異性的有機(jī)合成法，并且在提取自然極少存在的羥基黃酮/異黃酮方面也存在局限。通過本研究，可使功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的生產(chǎn)變得容易，且可進(jìn)行更多的與此相關(guān)的生理學(xué)研究及新材料/功能性原料開發(fā)。
[0041]并且，利用酪氨酸酶可使作為蛋白質(zhì)上的單酚型氨基酸殘基的酪氨酸(tyrosine)羥基化為多巴，這可改良性質(zhì)成為可摹仿貽貝蛋白質(zhì)的粘結(jié)功能的蛋白質(zhì)。像這樣，改良性質(zhì)的蛋白質(zhì)可發(fā)展為組織工程的支架(scaffolds)，進(jìn)一步可開發(fā)為功能性蛋白質(zhì)給藥系統(tǒng)(drug delivery system)(Annu Rev Mater Res.2011 I；41:99-132；B1fouling,2012,28:8,865-877；Current Opin1n in B1technology2013，24:1-7)。
【附圖說明】
[0042]圖1為用于由酪氨酸酶生成有效的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的示意圖，圖1的a為單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，圖1的b為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，圖1的c為醌型結(jié)構(gòu)物質(zhì)，圖1的d為與兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的其他元素形成配位鍵的結(jié)構(gòu)體。并且，圖1的I為酪氨酸酶的第一次羥基化反應(yīng)，圖1的2為酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)，圖1的3為脫氧-酪氨酸酶將一個氧分子放入存在于活性部位內(nèi)的兩個銅之間，并成為氧化-酪氨酸酶的反應(yīng)，圖1的4為借助使甲硫氨酸-酪氨酸酶的一個氧原子還原的還原劑的反應(yīng)，圖1的5為羥基化的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)形成配位鍵的反應(yīng)，圖1的6為使醌型結(jié)構(gòu)物質(zhì)還原來重新積累為兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的反應(yīng)，圖1的7為過氧化的醌型物質(zhì)高分子化為黑色素的反應(yīng)。
[0043]圖2作為羅列在酪氨酸酶全細(xì)胞反應(yīng)中添加的還原劑的表，在添加各個還原劑(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、L-抗壞血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、羥基醌、1-萘酚、對香豆酸、姜黃素、兒茶酚、鄰苯三酚或阿魏酸)的情況下，在白藜蘆醇(trans-resveratrol)中呈現(xiàn)羥基化的白皮杉醇(piceatannol)的相對生產(chǎn)量。
[0044]圖3為有關(guān)三種不同來源的酪氨酸酶(BMT_tyr:巨大芽孢桿菌酪氨酸酶、ABS_tys:雙孢蘑燕酪氨酸酶、SAV_tyr:除蟲鏈霉菌酪氨酸酶)的酪氨酸氨基酸(L-tyrosine)和多巴(L-dopa)的單加氧酶反應(yīng)速度和雙加氧酶反應(yīng)速度的比較表。
[0045]圖4為表示從單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)通過酪氨酸酶的羥基化反應(yīng)生成的多個兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的反應(yīng)式。
[0046]圖5為通過pH調(diào)節(jié)確認(rèn)羥基化的3鄰羥基大豆甙元(3 ’ -ODI，3 ’ -orthohydorxydaidzein)是否形成配位鍵的高性能-液相層析的定量分析。
[0047 ] 圖6為通過pH調(diào)節(jié)確認(rèn)輕基化的二輕四氫黃酮(orobo I)和木犀草素(luteo Iin)是否形成配位鍵的高性能-液相層析的定量分析。
[0048]圖7a為以時間為單位觀察pH9的硼酸緩沖液中包含ImM的大豆甙元及10nM的酪氨酸酶的5mL體外(in vitro)反應(yīng)中的3’ -鄰輕基大豆式元的生產(chǎn)率的曲線圖。
[0049]圖7b為以時間為單位觀察pH9的三(羥甲基)氨基甲烷(tris-HCl)中包含300μΜ的大豆甙元及10nM的酪氨酸酶的5mL體外反應(yīng)中的3鄰羥基大豆甙元的生產(chǎn)率的曲線圖。
[0050]圖8為以時間為單位觀察添加了羥胺或抗壞血酸的ImM的染料木素的羥基化反應(yīng)的曲線圖。
[0051]圖9為以時間為單位觀察添加了羥胺或抗壞血酸的ImM的白藜蘆醇的羥基化反應(yīng)的曲線圖。
[0052]圖10為用于分離/純化生成的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的技術(shù)的示意圖，在實施例5中詳細(xì)且明確地示出了其方法。
[0053]圖1la表示利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)分析從大豆甙元(daidz