苜蓿根瘤菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用領(lǐng)域，設(shè)及一株首猜根瘤菌及利用其提高國產(chǎn)紫花首 猜結(jié)瘤率和產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫花首猜(Medicago sativa)是一種多年生豆科草本植物，因其抗逆性強、分布 廣、栽培面積大、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、利用方式多、適口性好、經(jīng)濟價值高，具有其他豆科牧草不 能比擬的許多優(yōu)點。同時它也是世界上栽培最早、分布最廣的一種豆科牧草，堪稱"牧草之 王"。全世界首猜屬植物有65個品種，在我國主要有:野生種、地方品種、育成品種、引進品種 和一年生種。首猜在世界上主要分布在歐洲、亞洲和非洲，在我國廣泛分布在華北、西北、黃 淮海、東北南部地區(qū)。首猜含有多種化學(xué)成分，如:皂巧類、揮發(fā)油、黃酬類等。在我們的日常 生產(chǎn)中，之所W有國產(chǎn)首猜和進口首猜的概念，主要是因為進口首猜與國產(chǎn)首猜的諸多理 化指標上存在著較大的差異。然而，正是運種理化指標差異，最終造成泌乳奶牛干物質(zhì)采食 量的不同，從而影響了牛奶產(chǎn)量。國產(chǎn)首猜相對進口首猜而言單產(chǎn)較低、質(zhì)量不高、商品率 不足。但是進口首猜卻有著返青率低，抗逆性差的特點。因此發(fā)展首猜產(chǎn)業(yè)的出發(fā)點應(yīng)從提 高進口首猜返青率和提高國產(chǎn)首猜產(chǎn)量上入手。
[0003] 紫花首猜葉蛋白有很高的應(yīng)用價值，而氮是首猜正常生長所必需的大量營養(yǎng)元素 之一，也是構(gòu)成蛋白質(zhì)的重要組成部分，所W如何滿足紫花首猜氮的需求成為其工業(yè)化大 規(guī)模生產(chǎn)的一個關(guān)鍵問題。根瘤菌促進紫花首猜固氮對首猜的生長、發(fā)育乃至產(chǎn)量、品質(zhì)都 有重要的影響。紫花首猜與根瘤菌可W形成共生固氮體系進行生物固氮，減少施用氮肥對 環(huán)境造成的污染，因此在紫花首猜種植中一般不提倡大量使用化學(xué)氮肥。但紫花首猜自然 結(jié)瘤不好，因此接種根瘤菌是提高國產(chǎn)紫花首猜結(jié)瘤率和產(chǎn)量的一個重要措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對目前國產(chǎn)首猜雖然有著更適宜國內(nèi)種植的優(yōu)勢，但是面臨著單產(chǎn)低、結(jié)瘤率 低的情況，本發(fā)明提供了一株首猜根瘤菌及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -株首猜根瘤菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏 編號為CGMCC No.11589,保藏日期為2015年11月25日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路1號 院3號。該菌從黑龍江省大慶市鹽堿±地上分離篩選獲得。經(jīng)鑒定，是一株首猜中華根瘤菌 (Sinorhizobi皿meliloti)，命名為SD101。在需氧環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)基表層生長，菌落性狀 大致呈圓形，白色，邊緣不規(guī)則，表面粘液較多。革蘭氏陰性細菌，桿菌鏡檢照片如圖1。
[0007] 本發(fā)明的首猜根瘤菌菌劑和保護劑的配合使用將會顯著提高國產(chǎn)紫花首猜的結(jié) 瘤率和產(chǎn)量，特別是顯著提高國產(chǎn)首猜幼苗期的結(jié)瘤率。幼苗期結(jié)瘤率的提高說明本發(fā)明 可W提高接種菌劑的占瘤率和競爭性。同時，隨著結(jié)瘤率的提高，固氮效率也隨之提高，株 高及產(chǎn)量也得到了顯著增高。
[000引保藏信息：
[0009] 分類命名：首猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti);
[0010] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、；
[001U 保藏編號：CGMCC No. 11589;
[001^ 保藏日期：2015年11月25日；
[0013] 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰路1號院3號。
【附圖說明】
[0014] 圖1為首猜根瘤菌SD101鏡檢照片；
[0015] 圖2為同源性比對結(jié)果；
[0016] 圖3為教漢在賠石上生長的結(jié)瘤數(shù)；
[0017] 圖4為教漢在伽馬射線±中的結(jié)瘤數(shù)；
[0018] 圖5為教漢在野生±樣中的結(jié)瘤數(shù)；
[0019] 圖6為龍牧801在賠石上生長的結(jié)瘤數(shù)；
[0020] 圖7為龍牧801在伽馬射線±中的結(jié)瘤數(shù)；
[0021] 圖8為龍牧801在野生±樣中的結(jié)瘤數(shù)；
[0022] 圖9為教漢在賠石中生長的株高；
[0023] 圖10為教漢在伽馬射線±中生長的株高；
[0024] 圖11為教漢在野生±樣中生長的株高；
[00巧]圖12為龍牧801在賠石中生長的株高；
[00%]圖13為龍牧801在伽馬射線±中生長的株高；
[0027]圖14為龍牧801在野生±樣中生長的株高；
[002引圖15為田間試驗設(shè)計圖；
[0029] 圖16為教漢和龍牧801在田間試驗中的總結(jié)瘤數(shù)情況；
[0030] 圖17為教漢和龍牧801在田間試驗中的平均株高情況；
[0031] 圖18為教漢和龍牧801在田間試驗中的平均干草重情況。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0033] 本發(fā)明提供了一株首猜根瘤菌及其應(yīng)用，具體包括W下兩部分內(nèi)容：
[0034] -、首猜根瘤菌的篩選鑒定：
[0035] 1、本發(fā)明所述菌株是一株從黑龍江省大慶市鹽堿±地上分離篩選出來的首猜根 瘤菌。該菌經(jīng)鑒定，是一株首猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，命名為SD101。在需 氧環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)基表層生長，菌落性狀大致呈圓形，白色，邊緣不規(guī)則，表面粘液較多。 革蘭氏陰性細菌，桿菌鏡檢照片如圖1。
[0036] 使用YMA或TY固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)斜面和菌劑，配制方式：
[0037] YMA培養(yǎng)基：甘露醇lOg/l;酵母粉0.4g/l;NaCl 0.1g/l;K2冊〇4〇.5gA;MgS〇4 · 7出ο 0.2g/l;瓊脂粉 18-20g，加水至 1000mL，12rC滅菌即可。pH6.8-7;28°C。
[003引 TY培養(yǎng)基：蛋白腺5g/l;酵母粉3g/l;CaCb 0.87g;瓊脂粉18-20g，加水至lOOOmL， 12rc 滅菌即可。抑 6.8-7;28。(3。
[0039] 首猜根瘤菌的篩選方法:取新鮮的根瘤洗凈，經(jīng)常規(guī)表面滅菌，將根瘤夾破，于加 結(jié)晶紫的中性YMA固體培養(yǎng)基上劃線分離，挑取單菌落反復(fù)劃線分離，肉眼觀察比較純的單 菌落，挑取少量菌體革蘭氏染色，置于Olympus顯微鏡下鏡檢，再進行下一步生物學(xué)鑒定。
[0040] 2、首猜根瘤菌菌株SD101的生物學(xué)鑒定：
[0041] 通過采用16S rDNA測序方法進行首猜根瘤菌菌株SD101的生物學(xué)鑒定。由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。經(jīng)鑒定SD101為首猜中華根瘤菌。DNA序列如SEQ ID N0.1所 示，同源性比對結(jié)果如圖2所示。
[0042] 二、首猜根瘤菌的應(yīng)用
[0043 ] 1、SD101與保護劑在盆栽試驗中的應(yīng)用效果
[0044] (1)材料和研究方法：
[0045] 表種不同基質(zhì)
[0046]
[0051] 本發(fā)明選用兩個常見國產(chǎn)首猜品種:教漢和龍牧801，保護劑由阿根廷利索公司提 供。
[0052] 氮肥施用方式:基肥。200g尿素 lm3±或惰性基質(zhì)。
[0053] 首猜根瘤菌SD101施用方式：可搖瓶培養(yǎng)首猜根瘤菌SD101至ODsdd值達到0.8到 1.0，W8mL/kg種子的施用量與4mL/kg種子的施用量的保護劑預(yù)先混合，再與國產(chǎn)首猜種子 拌種，適當驚干即可播種。運種方法不但可W延長首猜根瘤菌劑SD101的存活時間，更可W 提高接種效率，大大增加了國產(chǎn)首猜的結(jié)瘤率和產(chǎn)量。
[0054] 處理數(shù):3種培養(yǎng)基質(zhì)*3個接種處理*8個平行巧個首猜品種=144盆。
[0055] (2)接種菌劑和保護劑在盆栽試驗中對國產(chǎn)首猜結(jié)瘤數(shù)的影響
[0056] 如圖3-8所示，接種了 SDlOl和保護劑的教漢品種在不同基質(zhì)上都有很好的結(jié)瘤 率，達到了顯著水平，比不接種高兩倍左右。Ξ種基質(zhì)相比較而言，賠石比野生±樣的接種 率要高，野生±樣中出現(xiàn)了不接種也有結(jié)瘤的現(xiàn)象主要是±著根瘤菌的影響。而接種的處 理比±著根瘤共生結(jié)瘤率高，說明施用的SD101有著更明顯的競爭優(yōu)勢。尿素處理的結(jié)果表 明，施用氮肥有抑制豆科植物與根瘤菌共生結(jié)瘤的效果。教漢與龍牧801在不同基質(zhì)中的情 況相似，但是教漢比龍牧801有著更穩(wěn)定的結(jié)瘤率。
[0057] (3)接種菌劑和保護劑在盆栽試驗中對國產(chǎn)首株高的影響
[0058] 由于盆栽首猜生長緩慢，所W收獲測定時仍然較小，因此生長性狀指標中只測定 了株高。由圖9-14可見在惰性基質(zhì)中，接種SD101和保護劑與增施尿素都會增高植物的株， 接種SD101及保護劑相比之下有著更顯著的增高，而尿素處理也好于不接種處理。在±樣 中，施用尿素的處理都對植株的增高沒有正向影響，運可能跟±樣的±質(zhì)有關(guān)。雖然不成顯 著影響，但在兩種±樣中施用SD101和保護劑都對增加植物的株高有作用。
[0059] 2、SD101與保護劑在田間試驗中的應(yīng)用效果
[0060] (1)材料和研究方法：
[OOW] 共18個小區(qū)，每小區(qū)6平方米，共立個重復(fù)。苗間距20cm，重復(fù)間距Im，區(qū)間道0.5m， 試驗設(shè)在星火牧場，播種量為每公頃15kg，尿素播撒量為每畝15kg。田間小區(qū)設(shè)計圖如圖15 所示。
[0062] A:不接種;B:尿素;C:接種SD101及保護劑。
[0063] 1:教漢;2:龍牧 801。
[0064] (2)接種菌劑和保護劑在田間試驗中對國產(chǎn)首猜結(jié)瘤數(shù)的影響
[0065] 由圖16可見，首猜總結(jié)瘤數(shù)情況與盆栽試驗相似，接種SD101和保護劑的處理好于 不接種的處理，不接種的處理好于尿素處理，但是效果不顯著。運說明±著根瘤菌發(fā)揮了一 定的作用，尿素對根瘤菌定殖有一定的抑制作用，接種SD101和保護劑仍然具有很強的競爭 性。
[0066] (3)接種菌劑和保護劑在田間試驗中對國產(chǎn)首猜平均株高的影響
[0067] 由圖17可見，因收獲期是花期，所種處理的株高差別不大。差別較大的時期是 生長期。接種菌劑或者施用尿素的處理進入生殖期較早。
[0068] (4)接種菌劑和保護劑在田間試驗中對國產(chǎn)首猜平均干草重的影響
[0069] 干草產(chǎn)量代表了首猜產(chǎn)量的好壞，是評價接種效果和施肥效果的一個重要指標。 從圖18中可見，雖然未達到顯著差異，運主要是由于±著根瘤菌的競爭作用，但從數(shù)據(jù)上 看，接種SD101和保護劑可W有效提高首猜的產(chǎn)量，并且比±著根瘤菌有著更強的競爭優(yōu) 勢。
【主權(quán)項】
1. 一株苜蓿根瘤菌，分類命名為苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti，保藏編號 為CGMCC No.11589。2. 權(quán)利要求1所述苜蓿根瘤菌和保護劑配合使用用于提高國產(chǎn)紫花苜蓿的結(jié)瘤率和產(chǎn) 量。
【專利摘要】苜蓿根瘤菌及其應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用領(lǐng)域。所述苜蓿根瘤菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.11589，保藏日期為2015年11月25日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路1號院3號。本發(fā)明的苜蓿根瘤菌菌劑和保護劑的配合使用將會顯著提高國產(chǎn)紫花苜蓿的結(jié)瘤率和產(chǎn)量，特別是顯著提高國產(chǎn)苜蓿幼苗期的結(jié)瘤率。幼苗期結(jié)瘤率的提高說明本發(fā)明可以提高接種菌劑的占瘤率和競爭性。同時，隨著結(jié)瘤率的提高，固氮效率也隨之提高，株高及產(chǎn)量也得到了顯著增高。CGMCC No. 1158920151125
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105543135
【申請?zhí)枴緾N201610008598
【發(fā)明人】石杰, 高宇, 孫宇峰, 劉宇峰, 張正海, 劉淑霞, 樊川, 殷博, 楊旭升, 姬妍茹, 楊慶麗
【申請人】黑龍江省科學(xué)院大慶分院
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月7日