水貂綠膿桿菌血清b型菌株及其滅活疫苗和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及水貂綠脈桿菌，尤其設(shè)及一株水貂綠脈桿菌血清B型SD004菌株，本發(fā) 明進一步設(shè)及用該菌株制備的預防水貂出血性肺炎的滅活疫苗，屬于水貂綠脈桿菌的分離 和應用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水貂出血性肺炎是由綠脈桿菌(又稱銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa)感 染引起的一種高度致死性傳染病，多發(fā)于每年9至11月份，該菌可通過患病水貂形成的飛沫 及氣溶膠傳播。發(fā)病急、死亡快，所W又稱銅綠假單胞菌肺炎，W呼吸困難、口鼻出血、突發(fā) 性死亡為主要特征，死后典型癥狀為口鼻流出血樣泡沫，剖檢肺臟呈彌漫性出血。
[0003] 綠脈桿菌，屬于丫變性菌口假單胞菌科，為需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性桿菌。 目前對綠脈桿菌分型常用方法是血清學分型，國際血清分型系統(tǒng)根據(jù)菌體0抗原將其分為 20個不同的血清型。日本科學家化mma根據(jù)0抗原將綠脈桿菌分為A~N群，并且根據(jù)此系統(tǒng) 形成的試劑盒在國際社會形成廣泛應用。
[0004] 綠脈桿菌為條件致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，接種疫苗是預防該病的有效方法，同 時避免了使用抗生素導致菌株產(chǎn)生耐藥性。中國于上世紀80年代初首次報道了水貂出血性 肺炎病例，此后相繼有該病報道，調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國各地水貂出血性肺炎B型菌株流行情況為 8%~50%不等，由于各血清型之間無交叉保護，制備的單苗具有針對性。因此，研制一種防 治水貂出血性肺炎的安全性好、保護效力高的滅活疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供一株致病力好、穩(wěn)定性高的水貂綠脈桿菌血清B型菌株；
[0006] 本發(fā)明的目的之二是將所分離的水貂綠脈桿菌血清B型菌株應用于防治水貂出血 性肺炎。
[0007] 本發(fā)明的目的之Ξ是提供一種制備防治水貂出血性肺炎的滅活疫苗的方法。
[000引本發(fā)明的上述目的是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明從多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺臟中，通過分離、鑒定和篩 選等方法最終得到一株水貂綠脈桿菌血清B型SD004株，已將分離的菌株提交專利認可的機 構(gòu)進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 11761;分類命名為：銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa。保藏單位：中國微生物保藏管理委員會普通微生物中屯、;保藏時 間是2015年11月30日：保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路巧院3號，中國科學院微生物研 究所。
[0010] 本發(fā)明無菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺臟，接種2%牛血清肉湯 瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取疑似單菌落劃線接種綠脈素測定用培養(yǎng)基(PDP)，37°C培養(yǎng) 24小時，挑取陽性菌落接種5ml 2 %牛血清肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，記為F0代。經(jīng)過PCR 鑒定、16S rRNA基因序列進行分析，結(jié)果表明：PCR鑒定為陽性，測序結(jié)果與預期相符，符合 片段大小為956bp。然后對其形態(tài)、生化特性、培養(yǎng)特性進行分析，結(jié)果表明，分離株符合綠 脈桿菌的形態(tài)、生化及培養(yǎng)特性，初步鑒定為陽性的菌液。對初步鑒定為陽性的菌液進行血 清型鑒定檢測，篩選出8株血清B型菌株。然后對血清B型菌株進行純化，得到編號SD001、 DL002、SD003、SD004、FK005、SD006、SD007和SD008菌株。然后，對上述8株血清B型菌株的致 病力進行篩選，得到致病力較好的2株:SD004和SD007。進一步對將綠脈桿菌血清B型SD004 株和SD007株的穩(wěn)定性進行篩選，最終得到了穩(wěn)定性高的綠脈桿菌血清B型SD004株。
[0011]為了驗證本發(fā)明綠脈桿菌血清B型SD004株的免疫保護效力，本發(fā)明對綠脈桿菌血 清B型SD004株的毒力和免疫原性進行測定，毒力測定表明：綠脈桿菌血清B型SD004株對小 鼠的LDso為1.5 X 105CFU;對2~5月齡水貂LDso為6.41 X 105CFU。免疫原性測定表明：用該分 離株F1代制備的疫苗免疫2~5月齡水貂5只，免后21日，WlOLDso進行攻毒，免疫組保護率為 5/5,對照組保護率為0/5。W上結(jié)果表明綠脈桿菌血清B型SD004株分離株F1代免疫原性良 好。
[0012]進一步的，本發(fā)明將綠脈桿菌血清B型SD004株制備成Ξ批滅活疫苗，對非祀動物、 對祀動物單劑量和超劑量進行安全性試驗，結(jié)果表明：非祀動物、祀動物臨床表現(xiàn)均正常、 注射局部和全身無不良反應，全部存活。對滅活疫苗的效力進行試驗，結(jié)果表明：對于水貂： B型滅活疫苗免后21日攻毒，Ξ批疫苗免疫組水貂保護率均不小于4/5,對照組水貂全部死 亡;對于小鼠：免后21日攻毒，Ξ批疫苗免疫組小鼠保護率均不小于9/10,對照組水貂全部 死亡。對免疫持續(xù)期進行試驗，結(jié)果表明：B型滅活疫苗對水貂抗綠脈桿菌SD004株的保護期 為6個月，免疫保護率均不小于4/5。W上說明血清B型SD004株安全性較好，能夠提供好的臨 床保護。
[0013] 本發(fā)明還提供了血清B型SD004株在制備防治水貂出血性肺炎的應用。
[0014] 為此，本發(fā)明提供了一種防治水貂出血性肺炎的疫苗組合物，包括:預防或治療上 有效量本發(fā)明所分離的綠脈桿菌血清B型SD004菌株W及藥學上可接受的佐劑。
[0015] 本發(fā)明進一步提供了一種制備所述防治水貂出血性肺炎的疫苗組合物的方法，該 方法包括：
[0016] (1)培養(yǎng)綠脈桿菌血清B型SD004株，得到菌液；
[0017] (2)向菌液中加入滅活劑，將菌液滅活；
[0018] (3)滅活后的菌液與佐劑混合均勻，配苗，即得。
[0019]步驟（1)中將血清B型SD004株接種含2%牛血清肉湯瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑 取單個典型菌落進行擴大培養(yǎng)，按培養(yǎng)基總量的1 %接種TSB培養(yǎng)基，37°C通氣攬拌培養(yǎng)；
[0020] 步驟（2)中向菌液中加入的滅活劑是甲醒，加入甲醒至其終濃度為菌液總量的 0.1%，滅活24小時。
[0021] 步驟(3)中，所述的佐劑為氨氧化侶膠，其中，氨氧化侶膠為體積百分比為30%氨 氧化侶膠。
[00剖本發(fā)明所設(shè)及到的術(shù)語定義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術(shù)語"疫苗"意指將病原微生物(如細菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過 人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。
[0025] 術(shù)語"佐劑"意指非特異性免疫增強劑，當與抗原一起注射或預先注入機體時，可 增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。
[0026] 術(shù)語"免疫"意指機體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應答排除抗原性 異物，W維持機體生理平衡的功能。
[0027] 術(shù)語"免疫原性"意指能夠刺激機體形成特異抗體或致敏淋己細胞的能力，即指抗 原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應物質(zhì)抗體和致 敏淋己細胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋己細胞的特 異性免疫反應。
【附圖說明】
[0028] 圖1為分離株16S rRNA基因片段PCR擴增結(jié)果，其中:M:DL 2000Marker;l:分離株； 2:陽性對照;3:陰性對照；
[0029] 圖2為綠脈桿菌血清B型SD004、SD007的F1代在傳代過程中菌體含量變化。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和 形式進行修改或替換，但運些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 1、試驗材料
[0032] 1.1主要試劑
[0033] rTaq、dNTP、DL2000DNA Marker、pMD18-T載體和D冊α均購自寶生物工程（大連）有 限公司；膠回收試劑盒和小劑質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；瓊 脂糖購自生工生物工程（上海）有限公司；氨節(jié)（Amp+)購自Sigma公司；甘油、甲醒溶液和 NaCl均購自國藥集團。
[0034] 1.2培養(yǎng)基
[0035] LB培養(yǎng)基、LB瓊脂平板、2 %牛血清肉湯培養(yǎng)基、2 %牛血清肉湯瓊脂平板和TSB培 養(yǎng)基。
[0036] 1.3陽性血清
[0037] 綠脈桿菌分型用標準血清系列，購自日本生研株式會社。
[003引 1.4試驗動物
[0039] 18~20g清潔級昆明小鼠購自哈