一種透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄 糖醛酸(GlcA)二糖重復(fù)單位通過(guò)β-(1-4)糖苷鍵和β-(1-3)糖苷鍵構(gòu)成的無(wú)分支結(jié)構(gòu)的 高分子酸性黏多糖，廣泛分布于動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的莢膜中。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)ΗΑ 的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等方面研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)ΗΑ有多種生物功能，如參與肺和 血管疾病及胚胎形成的信號(hào)傳導(dǎo)，傷口愈合等，使其在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域有廣泛而 獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。研究也發(fā)現(xiàn)，ΗΑ發(fā)揮生理作用與其分子量的大小密切相關(guān)，低分子量ΗΑ 寡糖促進(jìn)血管生成，而高分子量ΗΑ則抑制血管生成。ΗΑ寡糖作為拮抗劑可與CD44受體結(jié) 合，加速CD44的裂解，從而減弱了耐藥作用，抑制腫瘤的耐藥性。ΗΑ寡糖通過(guò)促進(jìn)腫瘤抑制 基因（ΡΤΕΝ)的表達(dá)，抑制ΡΙ3Κ/ΑΚΤ信號(hào)傳導(dǎo)通路而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，ΗΑ寡糖可 以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，寡糖與蛋白質(zhì)等生物分子作用發(fā)揮生理功能的過(guò)程中，寡糖的聚合度 以及還原端或非還原端糖殘基的種類(lèi)與其活性密切相關(guān)。因此，制備結(jié)構(gòu)新穎、聚合度明確 的透明質(zhì)酸寡糖，對(duì)于透明質(zhì)酸寡糖構(gòu)效關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸寡糖新的活性與作用 方式具有重要的意義。
[0004] 目前公開(kāi)的低分子量透明質(zhì)酸的制備方法主要有酶解法、物理法和化學(xué)法。其中 以酶法制備低分子量透明質(zhì)酸最多，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公布號(hào)：CN 102690847 Α， CN101294179A，CN 102876748 A，CN 103255187 A，CN 104178539 A，CN101020724A)公開(kāi)了 酶法制備低分子量的方法。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(公布號(hào):CN104059166A，CN103993022A)公開(kāi)了從 透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法?；瘜W(xué)方法制備透明質(zhì)酸也有報(bào)道，中國(guó)專(zhuān)利申 請(qǐng)（公布號(hào):CN102174122A，公開(kāi)號(hào):CN1563108A)利用透明質(zhì)酸熱和酸不穩(wěn)定特性，制備低 分子量透明質(zhì)酸。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公布號(hào):CN102850467A)公開(kāi)了在有機(jī)溶劑中堿催化制備 低分子量透明質(zhì)酸的方法。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公開(kāi)號(hào):CN101429255A)公開(kāi)了在有機(jī)溶劑中酸 催化制備低分子透明質(zhì)酸鈉的方法。機(jī)械方法制備低分子量透明質(zhì)酸的報(bào)道有，中國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)（公布號(hào):CN101942037A)公開(kāi)了機(jī)械研磨法制備分子量低于1萬(wàn)的低分子量透明質(zhì)酸 的方法。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公布號(hào):CN102630231A)公開(kāi)了利用活性炭分解制備低分子量透明 質(zhì)酸的方法。這些方法所制備的低分子量透明質(zhì)酸均為混合物，分子量分布范圍寬，結(jié)構(gòu)不 明確。雖然中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公布號(hào)：CN102304193A)公開(kāi)了酸性溶液中制備聚合度為1-4的 透明質(zhì)酸寡糖方法，但該方法制備的透明質(zhì)酸寡糖結(jié)構(gòu)不明確，且寡糖聚合度小，應(yīng)用范圍 受到限制。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（公布號(hào):CN103484513A)利用水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶制備四糖、 六糖、八糖和十糖的方法，該方法制備的透明質(zhì)酸寡糖聚合度為偶數(shù)，且其寡糖結(jié)構(gòu)序列不 清楚。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單工藝、規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿?、結(jié)構(gòu)明確的系列奇數(shù)透明質(zhì)酸寡糖單 體的方法仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)目前透明質(zhì)酸寡糖單體制備中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種透明質(zhì) 酸奇數(shù)寡糖單體及其酸降解制備方法，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足。本發(fā)明為解決制 備特定奇數(shù)聚合度的新的透明質(zhì)酸寡糖，采用稀酸或固相酸水解，結(jié)合低壓凝膠色譜一次 分離制備系列透明質(zhì)酸寡糖，且產(chǎn)品結(jié)構(gòu)明確、無(wú)雜質(zhì)殘留，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 一種透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體，它的結(jié)構(gòu)通式如下所示：
其中所述結(jié)構(gòu)式中n=0~10，R=H或Na或K或NH4，所述透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體的還原端 和非還原端均為葡萄糖醛酸或葡萄糖醛酸的金屬鹽或銨鹽。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述的透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體的制備方法，它包括以下步驟： (1) 酸降解:將分子量為50~lOOOkDa的高分子量透明質(zhì)酸水溶液在加熱攪拌下用稀 酸降解或用氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂降解，所述稀酸的體積比用量為透明質(zhì)酸質(zhì)量的5~20倍， 所述氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的質(zhì)量為透明質(zhì)酸質(zhì)量的1~5倍，過(guò)濾，濾液冷卻后用堿中和，濃 縮，加入有機(jī)溶劑沉淀，離心后上清液減壓濃縮得到酸水解寡糖混合物； (2) 凝膠柱分離:將步驟(1)所述酸水解寡糖混合物用低壓凝膠色譜柱分離，以鹽溶液 為洗脫劑，示差檢測(cè)器在線檢測(cè)，按照洗脫峰收集，分別減壓真空濃縮后冷凍干燥，得不同 聚合度的透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體。
[0008] 進(jìn)一步的：所述步驟（1)中酸降解時(shí)高分子量透明質(zhì)酸溶于水的質(zhì)量體積比濃度 為5%~20%。
[0009] 進(jìn)一步的:所述步驟(1)中酸降解的溫度為50°C~100°C，反應(yīng)時(shí)間0.5h~12h。
[0010] 進(jìn)一步的：所述步驟（1)中稀酸為鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、檸檬酸或三 氟乙酸中的至少一種，所述稀酸的終濃度為0. 〇lmol/L~2. Omol/L。
[0011] 進(jìn)一步的：所述步驟（1)中氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù) 脂。
[0012] 進(jìn)一步的:所述步驟(1)中堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉或氫氧化銨 中的至少一種。
[0013] 進(jìn)一步的:所述步驟(1)中有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮，有機(jī)溶劑的體積 比終濃度為30%~80%。
[0014] 進(jìn)一步的：所述步驟(2)中低壓凝膠色譜柱填料為Superdex 30、Bio Gel P10、Bio Gel P6或Bio Gel P4。
[0015] 進(jìn)一步的:所述步驟(2)中洗脫劑為0.05mol/L~0.5mol/L碳酸氫銨或醋酸銨的水 溶液。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是： (1)本發(fā)明采用凝膠柱色譜分離制備透明質(zhì)酸寡糖單體，一次分離即可獲得聚合度3 ~23的透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體，無(wú)需再用離子交換色譜法進(jìn)一步分離，極大的簡(jiǎn)化了工藝 操作，提高了寡糖單體制備的效率。
[0017] (2)本發(fā)明采用碳酸氫銨或醋酸銨為洗脫液凝膠柱分離制備透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖 單體，所獲寡糖單體經(jīng)過(guò)反復(fù)減壓濃縮或冷凍干燥即可除去流動(dòng)相中的鹽，克服了寡糖單 體尤其是低聚合度寡糖單體脫鹽困難的問(wèn)題，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)。
[0018] (3)本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸寡糖聚合度均為奇數(shù)，填補(bǔ)了透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖制備 的空白，且所制備的寡糖還原端與非還原端均為GlcA，用于透明質(zhì)酸寡糖構(gòu)效關(guān)系的研究 具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0019] (4)本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體結(jié)構(gòu)新穎，性質(zhì)穩(wěn)定，可用于制備寡糖 標(biāo)準(zhǔn)試劑，或作為生物活性物質(zhì)或中間體進(jìn)一步制備成寡糖保健品或寡糖藥物。
[0020] (5)本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體具有制備工藝簡(jiǎn)單，無(wú)害，無(wú)污染，容易 產(chǎn)業(yè)化的特點(diǎn)。
[0021] 結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】后，本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將變得更加清 晰。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體的低壓凝膠柱色譜分離圖。
[0023]圖2為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸三糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0024]圖3為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸五糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0025] 圖4為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸七糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0026] 圖5為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸九糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0027]圖6為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸^^一糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0028]圖7為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸十三糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
[0029]圖8為本發(fā)明制備透明質(zhì)酸十五糖的ESI/MS質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0031]實(shí)施例1:透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體稀酸降解制備 本實(shí)施例所述透明質(zhì)酸奇數(shù)寡糖單體的稀酸降解制備方法包括以下步驟： 1、取分子量為600 kDa透明質(zhì)酸75g加入1500mL蒸餾水中加熱攪拌使其完全溶解，加硫 酸使其終濃度達(dá)到〇.〇lmol/L~2mol/L(本發(fā)明中稀酸加入的體積單位為mL，透明質(zhì)酸質(zhì)量 的單位為g)，60°C~100°C水浴攪拌水解0.5h~5h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，用氫 氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，加入3倍體積乙醇后離心分離，上清液減壓真空濃縮，冷凍干 燥后得透明質(zhì)酸寡糖混合物。
[0032] 2、取所述寡糖混合物加水溶解后用Superdex 30凝膠色譜柱分離，以0.3 mol/L醋 酸銨為洗脫液，示差檢測(cè)器在線檢測(cè)，根據(jù)洗脫峰合并收集，減壓濃縮后冷凍干燥獲得不同 聚合度透明質(zhì)酸寡糖單體。
[0033]本實(shí)施例所述的硫酸可改用鹽酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、檸檬酸或三氟乙酸;所 述的氫氧化鈉可改用氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉或氫氧化銨;所述的乙醇可改用甲醇、丙 酮或異丙醇;所述的Superdex 30凝膠填料可改用Bio Gel P10，Bio Gel P6或Bio Gel P4; 所述的〇. 3mol/L醋酸銨洗脫液可改用水或0.05