尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物體糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖(UDPG)。
[0003]目前尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的測(cè)定方法主要是酶偶聯(lián)法，提取方法不盡相同，很多文獻(xiàn)報(bào)道的提取方法繁瑣，成分復(fù)雜，測(cè)定體系大，操作不夠簡(jiǎn)便快捷?，F(xiàn)需要專(zhuān)門(mén)研制一種試劑盒，可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的對(duì)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶進(jìn)行測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒及其方法，可快速準(zhǔn)確的對(duì)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性進(jìn)行測(cè)定。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒，包括以下試劑:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由一定量的Tr i s、蒸餾水、HC1、乙二胺四乙酸二鈉鹽、DTT和蔗糖混勻后制成；
試劑一，液體25mL X 1瓶，4°C避光保存，由一定量的所述提取液、蒸餾水、MgCl2、UDPG混勻后制成；
試劑二，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的NADP組成；
試劑三，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的6-磷酸葡萄糖脫氫酶組成；
試劑四，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的磷酸葡萄糖變位酶組成；
試劑五，液體5mLX 1瓶，4°C保存，由一定量的PPi與蒸餾水溶解后制成。
[0006]進(jìn)一步的，所述提取液，是由63mL蒸餾水溶解0.38g Tris，加HC1調(diào)pH為7.5后，取其中50mL該混合溶液，加入18.6mg乙二胺四乙酸二鈉鹽、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混勻后制成；
進(jìn)一步的，所述試劑一，是由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸饋水、10.2mg MgCb和16mg UDPG混勻后制成；
進(jìn)一步的，所述試劑二中，NADP的質(zhì)量為21mg;
進(jìn)一步的，所述試劑三中，6_磷酸葡萄糖脫氫酶的質(zhì)量為12.5mg；
進(jìn)一步的，所述試劑四中，磷酸葡萄糖變位酶的質(zhì)量為5mg;
進(jìn)一步的，所述試劑五中，PPi的質(zhì)量為44.6mg，蒸饋水的體積為5mL。
[0007]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反應(yīng)生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0008]—種采用上述試劑盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定方法，包括以下步驟:
步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備；
天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制；
所述試劑二在臨用前加5mL蒸餾水充分溶解，制成試劑二水溶液；
所述試劑三在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑三水溶液；
所述試劑四在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑四水溶液；
步驟3樣本中粗酶液的提??；
1)組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴勻漿后于4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測(cè)；
2)細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為(500?1000 ): 1的比例，冰浴超聲波破碎細(xì)胞，然后4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測(cè)；
3)液體:直接檢測(cè)；
步驟4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的測(cè)定操作；
1)分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸饋水調(diào)零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述試劑一、lOOyL所述試劑二水溶液、lOOyL所述試劑三水溶液、lOOyL所述試劑四水溶液、lOOyL所述試劑五和lOOyL所述粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值A(chǔ)jP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步驟5尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的計(jì)算；
1)按照組織樣本蛋白濃度計(jì)算:
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
2)按照組織樣本質(zhì)量計(jì)算:
酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位； UGP(U/g)=AA^(eXd)XV^^(ff XV樣+%?) +T=321.54X ΔA+W;
3)按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:
酶活單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位；UGPCU/104。611)=厶八+(￡\(1)\￥反總 + (%\細(xì)胞數(shù)量 + %總)+T = 321.54ΧΔΑ+細(xì)胞數(shù)量；
4)按照液體體積計(jì)算；
酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位； UGP(U/mL)= Δ A+ (ε X d) X細(xì)+乂樣+Τ=321.54 X Δ A;
其中，VM^=lmL，表示反應(yīng)體系總體積；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩爾消光系數(shù)；
d=1 cm，表示比色皿光徑；
^m=l mL，表示加入提取液體積；
V樣=0.lmL，表示加入樣本體積；
T=5min，表示反應(yīng)時(shí)間； w表示樣本鮮重，單位為g ；
Cpr表示樣本蛋白濃度，單位為mg/mL。
[0009]進(jìn)一步的，步驟三中，冰浴超聲波破碎細(xì)胞的方法為將功率設(shè)置為300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
1、使用本發(fā)明的試劑盒測(cè)定尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是所用到的儀器和用品相對(duì)較為普遍，對(duì)測(cè)定條件的要求也較低，符合普通實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定條件。
[0011 ] 2、本發(fā)明的方法在現(xiàn)有的酶偶聯(lián)法基礎(chǔ)上，將提取液成分及提取步驟簡(jiǎn)化，提取液成分及濃度的調(diào)整達(dá)到了提取更加充分的效果，并且在低溫保存時(shí)間延長(zhǎng)。
[0012]3、本發(fā)明的測(cè)定體系較小，所需樣本量以及測(cè)定試劑量少，適用于珍貴樣本測(cè)定。
[0013]4、本發(fā)明的檢測(cè)過(guò)程中大部分試劑使用體積一致，且檢測(cè)時(shí)間較短，達(dá)到了測(cè)定過(guò)程的簡(jiǎn)單化和快捷化效果。
[0014]5、本發(fā)明的方法大大降低了檢測(cè)成本，并且檢測(cè)結(jié)果靈敏可靠。
[0015]上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】由以下實(shí)施例詳細(xì)給出。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面將結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0017]一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定試劑盒，包括以下試劑:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由0.38g Tris與63mL蒸餾水溶解，加HC1調(diào)pH為7.5后配制成混合溶液，取其中50mL該混合溶液，加入18.6mg EDTA.2Na、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混勾后制成；
試劑一，液體25mL X 1瓶，4°C避光保存，由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸餾水、10.2mg MgCh和 16mg UDPG混勻后制成；
試劑二，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由2 lmg NADP組成；
試劑三，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由12.5mg 6-磷酸葡萄糖脫氫酶組成；
試劑四，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由5mg磷酸葡萄糖變位酶組成；
試劑五，液體5mLX 1瓶，4°C保存，由44.6mg PPi與5mL蒸餾水溶解后制成。
[0018]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反應(yīng)生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0019]—種采用上述試劑盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測(cè)定方法，通過(guò)如下三種實(shí)施例來(lái)說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例一
步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備；
天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制；
所述試劑二在臨用前加5mL蒸餾水充分溶解，制成試劑二水溶液； 所述試劑三在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑三水溶液；
所述試劑四在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑四水溶液；
步驟3組織樣本中粗酶液的提??；
按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴勻漿后于4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測(cè)；
步驟4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的測(cè)定操作；
1)分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸饋水調(diào)零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述試劑一、lOOyL所述試劑二水溶液、lOOyL所述試劑三水溶液、lOOyL所述試劑四水溶液、lOOyL所述試劑五和lOOyL所述粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值A(chǔ)jP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步驟5按照組織蛋白濃度計(jì)算尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性；
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
其中，VM^=lmL，表示反應(yīng)體系總體積；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩爾消光系數(shù)；
d=1 cm，表示比色皿光徑；
V樣=0.lmL，表示加入樣本體積；
T=5min，表示反應(yīng)時(shí)間；
Cpr表示樣本蛋白濃度，單位為mg/mL。
[0021]
實(shí)施例二
步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備；
天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制