一種隱綠原酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種有機酸的制備方法，具體涉及一種隱綠原酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隱綠原酸即4-咖啡酰奎寧酸，屬于單咖啡?？鼘幩犷惢衔?，是綠原酸(3-咖啡?？鼘幩?同分異構(gòu)體。近年來，國內(nèi)外學(xué)者就咖啡酰奎寧酸類化合物藥理活性進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有一些重要生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抑制平滑肌收縮、降血脂等，極具臨床應(yīng)用價值，有望在治療病毒性肝炎及宮頸癌疾病中發(fā)揮重要的作用。但由于目前此類化合物僅停留在是實驗室研究階段，還未見規(guī)模制備的方法技術(shù)，這樣很大地限制了此類化合物的深入研究開發(fā)。因此，對于此類化合物包括隱綠原酸的規(guī)模分離、純化及制備成為其深入開發(fā)的關(guān)鍵問題。
[0003]國內(nèi)外關(guān)于隱綠原酸的分離純化僅少數(shù)文獻報道，許小方(許小方，李會軍，李萍，馮煦，袁昌齊.灰氈毛忍冬花蕾中的化學(xué)成分[J]，中國天然藥物，2006,4(1):45-47.)從15kg灰氈毛忍冬中通過D101大孔樹脂、SephadexLH-20、RP-C18和重結(jié)晶等方法分離得到200mg隱綠原酸。王琦(王琦.金銀花的化學(xué)成分研究[D].沈陽藥科大學(xué)，2008.)采用萃取、反復(fù)硅膠柱層析、SephadexLH-20和重結(jié)晶等方法從280g金銀花浸膏中分離得到隱綠原酸30mg。王岱杰(王岱杰.忍冬葉化學(xué)成分及其抗H5亞型禽流感病毒研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.)從10kg忍冬葉中通過MCI樹脂、SephadexLH-20及制備液相等手段分離得到13mg隱綠原酸。然而，上述研究中普遍存在一個問題，隱綠原酸都是在化學(xué)成分研究過程中發(fā)現(xiàn)的，這些方法并不是針對隱綠原酸的分離、純化和制備，具有隨機性、重現(xiàn)性差，而且分離純化步驟較繁瑣，不適合大規(guī)模分離制備。另外，由于隱綠原酸在植物中含量低，通過植物化學(xué)手段來分離得到的量非常小，無法滿足動物實驗的研究應(yīng)用。同時，也有報道國外學(xué)者采用化學(xué)合成隱綠原酸(張亞梅.咖啡?？鼘幩犷惢衔锏暮铣裳芯縖J].江西中醫(yī)藥，2012，8
(43):78.),但隱綠原酸通過奎寧酸選擇性酯化合成收率很低，且成本高，污染很大，未進入規(guī)模化生產(chǎn)，而國內(nèi)無人問津，所有以上均制約了其進一步的開發(fā)應(yīng)用。
[0004]因此，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，研究開發(fā)一種制備效率高，產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，具有很好應(yīng)用前景的隱綠原酸的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，經(jīng)過大量實驗篩選，提供優(yōu)選的隱綠原酸的制備方法。本發(fā)明提供的隱綠原酸的制備方法，以綠原酸為原料，采用優(yōu)選的酸處理工藝使綠原酸穩(wěn)定的、高效的轉(zhuǎn)化為隱綠原酸，并通過優(yōu)選的工業(yè)制備色譜純化方法，將性質(zhì)較接近的綠原酸和隱綠原酸等分離純化，制備得到純度高的隱綠原酸，工藝簡單，步驟簡便，制備效率高，得率高，制備得到的隱綠原酸純度高，整個過程生產(chǎn)成本低，可操作性強，適合大規(guī)模制備，具有很好的應(yīng)用前景。
[0006]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種隱綠原酸的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](1)取綠原酸，加5?10倍量體積濃度為50 %?80 %甲醇溶解，加10?20倍量的1?2mol/L鹽酸，于60°C水浴上攪拌反應(yīng)6?8h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，得反應(yīng)液；
[0009](2)反應(yīng)液中加1?2mol/LNaOH溶液調(diào)pH至中性，50°C以下減壓濃縮至干，加甲醇溶解，析出白色固體濾過，濾液在50°C以下減壓濃縮至干，加少量水溶解，濾過，得濾液；
[0010](3)取濾液經(jīng)反相Ci8柱預(yù)處理，水洗，收集水洗液濃縮，離心，過0.45μπι濾膜，反相工業(yè)制備色譜法制備得到隱綠原酸。
[0011]作為優(yōu)選方案，以上所述的隱綠原酸的制備方法，步驟(1)中，取綠原酸，加10倍量體積濃度為50 %甲醇溶解，然后加20倍量的lmol/L鹽酸，然后于60°C水浴上攪拌反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。
[0012]作為優(yōu)選方案，以上所述的隱綠原酸的制備方法，反相工業(yè)制備色譜法的色譜條件為:色譜柱為反相C18色譜柱(30?150X250?600111111))，流速為15?1000111171^11，波長為326nm，流動相為乙腈(A)-0.5%甲酸溶液⑶，梯度洗脫，進樣量1.0?20.0g。
[0013]實驗例
[0014](一)酸反應(yīng)優(yōu)選試驗:
[0015]由于綠原酸結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易發(fā)生變化，本發(fā)明通過大量實驗篩選轉(zhuǎn)化條件，在60°C水浴下進行反應(yīng)。
[0016]1、考察60°C下，綠原酸的轉(zhuǎn)化實驗:
[0017](1)0.lmol/L鹽酸反應(yīng)8個小時，每隔2h取樣，以綠原酸為對照進行HPLC檢測。
[0018](2)0.lmol/L氫氧化鈉反應(yīng)8個小時，每隔2h取樣，以綠原酸為對照進行HPLC檢測。
[0019]檢測結(jié)果:在酸性條件下，綠原酸可轉(zhuǎn)化為隱綠原酸;但是在堿性條件下，無隱綠原酸生成。
[0020]因此，本發(fā)明選擇酸性條件下進行隱綠原酸的轉(zhuǎn)化。
[0021 ] 2、考察60°C下，在不同濃度的酸性條件下綠原酸的轉(zhuǎn)化實驗:
[0022](1 )0.0lmol/L鹽酸反應(yīng)8個小時，每隔2h取樣，以綠原酸為對照進行HPLC檢測。
[0023](2)0.lmol/L鹽酸反應(yīng)8個小時，每隔2h取樣，以綠原酸為對照進行HPLC檢測。
[0024](3)lmol/L鹽酸反應(yīng)8個小時，每隔2h取樣，以綠原酸為對照進行HPLC檢測。
[0025]檢測結(jié)果:
[0026]a、0.0lmol/L鹽酸反應(yīng)條件下，反應(yīng)終點隱綠原酸生成量很少。
[0027]b、0.lmol/L鹽酸反應(yīng)6h有微量隱綠原酸生成，8h有少量隱綠原酸生成。
[0028]c、lmol/L鹽酸反應(yīng)4h有少量隱綠原酸生成，6h有大量隱綠原酸生成，8h的生成雜質(zhì)較多。
[0029]因此，本發(fā)明優(yōu)選的隱綠原酸的最佳轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為:濃度為lmol/L鹽酸下，反應(yīng)6h0
[0030](二)工業(yè)制備色譜法制備條件的優(yōu)選
[0031]1、檢測波長:本發(fā)明通過全波長掃描和3D等高線檢測，優(yōu)選出最佳的檢測波長為326nm，在該波長下隱綠原酸有最大吸收，故選擇檢測波長為326nm。
[0032]2、流動相的組成，本發(fā)明以甲醇-水，甲醇-0.5%甲酸溶液，乙腈-水和乙腈-0.5%甲酸溶液分別為流動相，實驗結(jié)果表明，以甲醇-水，甲醇-0.5 %甲酸溶液，乙腈-水為流動相時，系統(tǒng)分離效果較差，洗脫速度慢，峰形不佳，因此本發(fā)明選擇乙腈(A)-0.5%甲酸溶液(B)為洗脫劑。
[0033]3、洗脫程序篩選:由于隱綠原酸和綠原酸極性接近，在色譜柱上完全分離具有較大的難度，并且綠原酸和隱綠原酸的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，因此，本發(fā)明通過大量實驗篩選梯度洗脫條件，優(yōu)選得到最佳的梯度洗脫程序為:0?30min，8%?30%A;30?35min，30%?100%Ao
[0034]本發(fā)明提供的隱綠原酸的制備方法，采用優(yōu)選的酸性條件下轉(zhuǎn)化后，再用優(yōu)選濃度的堿將過量的酸進行中和，通過實驗篩選，采用1?2mol/LNa0H溶液不僅可以將反應(yīng)體系中過量的酸中和，并且不會影響隱綠原酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可防止隱綠原酸結(jié)構(gòu)再次轉(zhuǎn)化，保證產(chǎn)率。
[0035]經(jīng)過酸性轉(zhuǎn)化和堿性中和后，反應(yīng)體系中存有一定的雜質(zhì)和未反應(yīng)完的綠原酸等，為了提高后續(xù)制備液相的純化效率，本發(fā)明通過大量實驗篩選，將堿中和后的反應(yīng)液先經(jīng)反相C18柱預(yù)處理，可以將反應(yīng)體系中的部分雜質(zhì)去掉，大大提高后續(xù)工業(yè)制備色譜的制備效率和提高隱綠