體外診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于在體液中測(cè)定巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性的體外方法。 具體地，本發(fā)明涉及這樣的一種方法，其中尿硫酮（Urothione)含量和/或朱卡硫酮 (jukathione)含量在血衆(zhòng)、血清和/或尿中體外測(cè)定，以便測(cè)定疏基噪呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶 活性。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種尿硫酮和/或朱卡硫酮作為生物標(biāo)記物的體外診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶（下文主要稱為TPMT)是在各種形式的白血病和慢性炎癥 性疾病的治療的藥物代謝中的關(guān)鍵酶。TPMT將細(xì)胞抑制藥物(例如6-巰嘌呤)轉(zhuǎn)化為臨床上 不活躍的甲基化形式（例如6-甲基巰嘌呤），再經(jīng)腎排除。盡管TPMT具有下文所述的藥理學(xué) 重要性，但是它的生理底物和TPMT在人類代謝中的作用是未知的。
[0003] 巰基嘌呤，例如6-硫鳥嘌呤(6-TG)、6_巰嘌呤(6-MP)或咪唑硫嘌呤(AZA)，是廣泛 用于白血?。ɡ缂毙粤馨图?xì)胞白血?。?、自體免疫疾病（例如克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎）的治療以及用于器官移植的接受者的嘌呤拮抗物。它們是天然生成的核酸堿基鳥嘌呤 的類似物。巰基嘌呤的其他適應(yīng)癥是，例如，非霍奇金淋巴瘤，潰瘍性結(jié)腸炎，真性紅細(xì)胞增 多，銀肩病關(guān)節(jié)炎，各種自身免疫性疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，遺傳病的疾病，其他形式的 血管炎，自身免疫性肝炎，特應(yīng)性皮炎，重癥肌無(wú)力，視神經(jīng)脊髓炎(德維克氏?。?，限制性肺 病。
[0004] TPMT是甲基化巰基嘌呤化合物的酶。更具體地，TPMT催化巰基嘌呤劑的S-甲基化。 甲基供體是S-腺苷基-L-蛋氨酸，其又通過(guò)反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為S-腺苷基-L-高半胱氨酸。也就是 說(shuō)，TPMT利用S-腺苷基-L-蛋氨酸作為S-甲基供體來(lái)使巰基嘌呤劑代謝，同時(shí)形成作為副產(chǎn) 物的S-腺苷基-L-高半胱氨酸。
[0005] 影響TPMIi酶活性的遺傳多態(tài)性與巰基嘌呤藥物在患者治療中的響應(yīng)和副作用相 關(guān)。
[0006] 巰基嘌呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶（TPMT;EC 2.1.1.67)是催化巰基嘌呤藥物如硫唑嘌呤 (AZA)和6-巰基嘌呤(6-MP)的S甲基化的胞內(nèi)酶。酶活性本身顯示在紅細(xì)胞(RBC)中差異極 大，大約是200個(gè)高加索人中有1個(gè)完全缺乏，而11 %顯示中間狀態(tài)，89 %顯示正常TPMT活性 (schaeffeler et al.2004)。此外，1-2%的高加索人偏離這個(gè)多峰分布，表現(xiàn)出非常高的 水平(Schaeffeler et al. 2004)。由于巰基嘌呤為主的免疫抑制劑只提供相對(duì)有限的治療 范圍，因此TPMT多態(tài)性顯著地影響兩個(gè)甲基化代謝物6-甲基巰嘌呤（甲基嘌呤核糖核苷酸） 和硫鳥嘌呤核苷酸(所謂的6-TGN)的比值，從而確定巰基嘌呤在患炎癥性腸病、急性淋巴細(xì) 胞白血病和其他疾病(summarized in Teml et al.2007)的病人中治療的有效性和毒性。 例如硫唑嘌呤或6-MP標(biāo)準(zhǔn)劑量治療期間，具有減少或缺乏TPMT活性的個(gè)體的骨髓抑制的風(fēng) 險(xiǎn)增加，因?yàn)樵谶@些情況中存在過(guò)高的6-TGN水平。因此，這些患者需要在巰基嘌呤治療中 單獨(dú)地調(diào)整劑量(Kaskas et al Gut 2002)
[0007] 相比之下，具有非常高水平的TPMT活性的個(gè)體處于發(fā)展治療抗性（由于過(guò)低的6- TGN水平)的危險(xiǎn)之中，因?yàn)閹€基嘌呤代謝物的密集的甲基化發(fā)生在這些情況中，并且為此， 活性的6-TGN代謝物以較小的量形成。此外，肝臟損傷可由高6-甲基巰嘌呤核苷酸水平 (Dubinsky et al.2000, Nygaard et al.CPT 2008)引起。急性淋巴細(xì)胞性白血病和高水平 TPMT活性的兒科患者在標(biāo)準(zhǔn)條件下復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加 (Stanulla et al.2005)。
[0008] TPMT缺陷的分子機(jī)理很容易理解。TPMT構(gòu)成為數(shù)不多的幾個(gè)例子之一，其中藥物 遺傳現(xiàn)象被譯為對(duì)于最佳巰基嘌呤劑量的調(diào)整普遍公認(rèn)的診斷性的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。這些建議最 近得到了更新(Relling et al.2013)，盡管現(xiàn)在仍不知TPMT的內(nèi)源性底物。
[0009] TPMT活性通常在紅細(xì)胞(RBCs)中測(cè)定。非常低的、中間的和正常的活性的截?cái)嘀?被限定，所述截?cái)嘀祻?qiáng)烈依賴于所使用的測(cè)量方法例如福射化學(xué)測(cè)定(Weinshilboum et al. 1978)或基于HPLC的方法(Kroplin et al. 1998)。
[0010] 在1980年代，TPMT缺陷的遺傳基礎(chǔ)被提出（Weinshilboum et al. 1980)。現(xiàn)在，與 變異的TPMT活性相關(guān)的27種單核苷酸多態(tài)性(SNP)被描述(Appell et al.2013)。共同發(fā)明 人Dr. Schaef feler和Dr. Schwab研究了在大型的健康、自愿測(cè)試主體的人群中的TPMT基因 型-表型關(guān)系（1222個(gè)人）。他們能夠證實(shí)TPMT表型的三峰分布，并發(fā)現(xiàn)個(gè)體的0.6% (1:180) 有TPMT缺陷，10.2%為TPMT活性中等水平，以及89.2%是正常的或高水平(Schaeffeler et al Pharmcogenetics 2004)。
[0011]當(dāng)使用基因分析預(yù)測(cè)正確的TPMT表型時(shí)，TPMT基因型和表型之間的一致性是 98.4 %，對(duì)于陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)的敏感性和特異性大于90 %。雖然如此，在RBCs中的活性測(cè)定 和臨床常規(guī)TPMT基因檢測(cè)中有很大的局限性：（1)因疾病相關(guān)的貧血在最近的6-8周內(nèi)接受 輸血的患者中的正確TPMT表型的測(cè)定有誤分類的高風(fēng)險(xiǎn)（Cheung et al.2003;F〇rd et al.2004，Schwab et al.2001)。因此，進(jìn)一步的基因分析在所有的這些情況中都是極其重 要的。（2)在日常生活中，TPMT基因型的基因分析還未通過(guò)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行，因而僅僅檢測(cè)已 知的慣常突變。因此，由于很少出現(xiàn)的等位基因未被分析而導(dǎo)致的誤分類可能發(fā)生。
[0012] 基于上述理由，專一地被TPMT甲基化的內(nèi)源性底物的識(shí)別對(duì)于改善的臨床診斷來(lái) 說(shuō)具有最重大的意義和最大價(jià)值。這樣的直接生物標(biāo)記物將消除所有的上述限制，并將不 僅在血液中，在尿中也是可檢測(cè)的，這會(huì)顯著地簡(jiǎn)化臨床診斷。
[0013] 因?yàn)樵趯?duì)患急性淋巴細(xì)胞白血病兒童采用6-MP處理的常規(guī)治療（Relling et al.2013)中TPMT分析是必需的，所以在這組患者中，更簡(jiǎn)單的尿分析實(shí)際上將非常有利。此 外，大約1-2%的個(gè)體的特點(diǎn)是TPMT活性增加；目前仍然不知道潛在的遺傳成因。TPMT的內(nèi) 源性反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定也將有效地識(shí)別非常高水平的TPMT活性的患者（Schaeffeler et al. 2004)，從而降低或消除硫唑嘌呤或6-MP治療由于過(guò)低的劑量導(dǎo)致的較差的響應(yīng)的風(fēng) 險(xiǎn)。
[0014] 此外，TPMT缺陷與順鉑的毒性相關(guān)，因此，還建議在順鉑治療之前進(jìn)行TPMT的基因 分析(Ross et al. 2009)。這些患者也將從內(nèi)源性TPMT產(chǎn)物的簡(jiǎn)便快速測(cè)定中獲益。
[0015] 由于副作用的風(fēng)險(xiǎn)，治療前，通過(guò)基因和酶分析檢查兒科白血病患者的TPMT活性。 目前這些檢驗(yàn)涉及許多努力，因而通常僅僅在特別瀕危的病人組如兒科患者中常規(guī)進(jìn)行， 然而其他病人組，例如慢性炎癥性疾病的患者，最為常見的是首先用次優(yōu)劑量，以便避免毒 性。除其他以外，通過(guò)在具有降低的和非缺少的TPMT活性的患者中增加劑量，以經(jīng)驗(yàn)為主地 逐步接近患者可忍受的最大的巰基嘌呤劑量。在這個(gè)過(guò)程中，一方面，因藥量過(guò)大總是有嚴(yán) 重的或甚至致命的副作用的危險(xiǎn)，另一方面有藥量不足的危險(xiǎn)，其危害治療的成功。
[0016]非專利文獻(xiàn)
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