一種利用赤霉菌CA3-1合成11α,15α-diOH-4-AD的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用一株赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化底物雄烯二酮(4-AD)為11 α，15 α -d1H-4-AD的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雄烯二酮(4-AD)是一種重要的留體激素藥物中間體，可以用于合成睪丸酮、甲基睪丸酮、雌留酚酮和副腎上腺皮質(zhì)激素等多種留體激素藥物的中間體。其在生物體內(nèi)能被氧化生成9 a -0H-4-AD、11 a -0H-4-AD和11 α，15 α -d1H-4-AD等多種羥基化產(chǎn)物，其中關(guān)于9 a -0H-4-AD的報道較多。9 a -0H-4-AD可用于合成皮質(zhì)激素、抗雄性激素、抗雌性激素及避孕功能藥物，是一種非常重要的留體激素中間體。而目前對其11α、15α雙羥基產(chǎn)物鮮有報道。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法相比，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)具有反應(yīng)步驟少、條件溫和、立體選擇性高、以及環(huán)境友好等眾多優(yōu)勢。利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，可選擇性的在雄烯二酮母核的不同位點引入一個或多個輕基，合成多種留體醫(yī)藥中間體，用于生產(chǎn)多種抗炎藥物。由于甾體化合物獨特的生物活性和藥用價值，國家已把留體激素藥物新資源開發(fā)作為醫(yī)藥行業(yè)近期技術(shù)發(fā)展的方向和重點之一。
[0003]近些年來，科研工作者已經(jīng)找到了多株對雄烯二酮具有轉(zhuǎn)化能力的菌株，如諾卡氏菌(Nocardia)、紅球菌(Rhodococcus)、棒桿菌(Corynebacterium)及Cylindrocarpon radicicola等。其均能高效轉(zhuǎn)化4-AD為9 a -0H-4-AD，而未見轉(zhuǎn)化生成11 α，15 α -d1H-4-AD 的報道，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1 可以轉(zhuǎn)化4-AD為11 α，15 a -d1H-4_AD。11 α，15 α -d1H-4-AD的合成為甾體藥物及其中間體的研究提供了更多元化的前體，而且Clla、15α雙羥化反應(yīng)作為一種新的留體羥化反應(yīng)類型，為留體藥物合成開辟了新的途徑，具有一定的研究價值和市場意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的4-AD雙羥基化產(chǎn)物(11 α，15 α -d1H-4-AD)以及其轉(zhuǎn)化合成方法。通過兩步轉(zhuǎn)化法，利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化底物4-AD為lla，15a-di0H-4_AD。該菌株保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.4903，保藏日期為2011年5月24日，分類命名為Gibberella intermedia。
[0005]采用上述微生物轉(zhuǎn)化4-AD為11 α，15 α -d1H-4-AD的方法，其具體步驟如下:
[0006](1)以赤霉菌CA3-1為生產(chǎn)菌株，25?35°C，150?220r/min條件下活化培養(yǎng)得到種子液，然后將種子液稀釋涂布到PDA平板上；
[0007](2)制備CA3-1菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物:挑取步驟(1)的PDA固體培養(yǎng)基上的CA3-1菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有50?100mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25?35°C，置搖床上以180?220r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12?20h至對數(shù)生長中后期，即得到CA3-1菌株的種子培養(yǎng)液；
[0008](3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟⑵中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4%?8% (v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為250mL錐形瓶中裝25?50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)20?24h，得發(fā)酵液；
[0009](4)生物轉(zhuǎn)化:準(zhǔn)確稱取適量的底物4-AD，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使其終濃度為4?8g/L，在轉(zhuǎn)化溫度28°C，200?220r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化48?60h，即得轉(zhuǎn)化液；
[0010](5)產(chǎn)物檢測:將步驟(4)的轉(zhuǎn)化液在8000?12000r/min下離心5?lOmin，上清用等體積乙酸乙酯抽提3次，菌體用適量乙醇抽提3次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙睛復(fù)溶晶體并通過0.22 μπι的有機(jī)膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析 4-AD、11 α，15 α -d1H-4-AD 的含量；
[0011]其中步驟⑴中所述的PDA培養(yǎng)基的成分及配比為:土豆200?500g/L ;葡萄糖20?50g/L;酵母粉2?10g/L;瓊脂粉10?20g/L;pH自然，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;步驟⑵中所述的種子培養(yǎng)基的成分及配比為:葡萄糖10?30g/L ;酵母粉5?15g/L ；NaCl 0.5 ?2g/L ；KH2P041 ?5g/L ;調(diào) pH 至 7.0，121°C 高壓蒸汽滅菌 15 ?20min ；步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:葡萄糖10?30g/L ;酵母粉5?15g/L ;玉米楽1?5g/L ；pH自然，121°C高壓蒸汽滅菌15?20min。
[0012]本發(fā)明所述的利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化4-AD為11 α , 15α -d1H-4-AD 為首次提出。
【附圖說明】
[0013]圖1 為赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1 在發(fā)酵培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化 4-AD(4g/L)為11 α，15 α -d1H-4-AD的過程研究。
【具體實施方式】
[0014]實施例1 赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1 轉(zhuǎn)化 4-AD
[0015](1)制備赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1 菌株的種子液
[0016]挑取固體PDA培養(yǎng)基上的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株一環(huán)，接種在裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20?24h至對數(shù)期，即制得CA3-1的種子液；
[0017](2)將種子培養(yǎng)液以4%的接種量接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的搖瓶中，以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)20小時，得到菌體發(fā)酵液；
[0018](3)將4-AD投入到菌體發(fā)酵液中，投料濃度為4.0g/L，相同條件下轉(zhuǎn)化60小時，提取產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，計算得到4-AD轉(zhuǎn)化率為99.3%，11 α，15 α -d1H-4-AD的得率為68.
[0019]實施例2
[0020](1)種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1。
[0021](2)將4-AD投入到菌體發(fā)酵液中，投料濃度為6.0g/L，相同條件下轉(zhuǎn)化60小時，提取產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，計算得到4-AD轉(zhuǎn)化率為80.4%，11 α，15 α -d1H-4-AD的得率為
52.
[0022]實施例3
[0023](1)種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1。
[0024](2)將4-AD投入到菌體發(fā)酵液中，投料濃度為8.0g/L，相同條件下轉(zhuǎn)化60小時，提取產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，計算得到4-AD轉(zhuǎn)化率為61.3%，11 α，15 α -d1H-4-AD的得率為41.
【主權(quán)項】
1.一株轉(zhuǎn)化4-AD生成11 α，15 α -d1H-4-AD的菌株，該菌株為赤霉菌(Gibberellaintermedia) CA3-1，保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4903，保藏日期為2011年5月 24 日，分類命名為 Gibberella intermedia。2.一種利用赤霉菌轉(zhuǎn)化4-AD為11 α，15 α -d1H-4-AD的方法，其特征為: (1)將赤霉菌CGMCCN0.4903作為生產(chǎn)菌種從PDA平板上接入到種子培養(yǎng)基中，25?35°C，150?220r/min條件下培養(yǎng)12?20h，得到種子液；種子培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖 10 ?30g/L ;酵母粉 5 ?15g/L ；NaCl 0.5 ?2g/L ；KH2P04 1 ?5g/L ;調(diào) pH 至 7.0，121 °C高壓蒸汽滅菌15?20min ； (2)將種子液以體積百分比4%?8%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為250mL錐形瓶中裝25?50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25?35 °C，在150?220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20?24h，得發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖10?30g/L ;酵母粉5?15g/L ;玉米漿1?5g/L ；pH自然，121°C高壓蒸汽滅菌15?20min ； (3)稱取一定量的4-AD加入到菌體發(fā)酵液中，轉(zhuǎn)化48?60h，即得轉(zhuǎn)化液。
【專利摘要】本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化底物4-AD為11α,15α-diOH-4-AD的方法。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC？No.4903。赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1能轉(zhuǎn)化4-AD為11α,15α-diOH-4-AD，在底物投料濃度為4g/L時，4-AD轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.3％，11α,15α-diOH-4-AD的得率為68.7％。11α,15α-diOH-4-AD的合成為甾體藥物及其中間體的研究提供了更多元化的前體，具有一定的研究價值和市場意義。CGMCC No.490320110524
【IPC分類】C12N1/14, C12P33/06, C12R1/645
【公開號】CN105420126
【申請?zhí)枴緾N201610019209
【發(fā)明人】許正宏, 李會, 史勁松, 孫錦
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月12日