白酶消化:每份心肌勻漿液加入250ml胃蛋白酶溶液，心肌勻漿液與胃蛋白酶溶液之間的體積比為1:5 ;胃蛋白酶溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，配制組份和量:胃蛋白酶5.2g，NaCl10.0g,6NHCl 28ml,清水 1000ml，PH=1，
將加入胃蛋白酶溶液的心肌勻漿液置于37°C的恒溫水浴搖床中l(wèi)h即可。
[0014](4)過濾離心:將消化好的心肌勻漿液用一次性紗布過濾并分裝，用常溫低速離心機(jī)離心，離心條件:(1200g, lOmin, 25°C )。
[0015](5)調(diào)PH:向(4)離心沉淀物中緩慢加入1.2%的碳酸氫鈉酚紅溶液并震蕩，直至溶液顏色由紅色變?yōu)殚冱S色，此時(shí)PH接近中性。
[0016](6)加雙抗:將(5)得到的橘黃色液體再次離心(1200g lOmin，25°C )除去上清液，加入與沉淀等體積的青鏈霉素混合液，室溫靜置約20min即得心肌消化液；青鏈霉素混合液的配比為:青霉素200U/ml，鏈霉素200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接種心肌消化液
選取健康的昆明小鼠10只，并對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，每一只小鼠背部皮下接種lml的心肌消化液，緩慢推針，緩慢退針，以防止接種液溢出。
[0017]D、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理
接種后的小鼠需要每日動(dòng)態(tài)觀察體態(tài)特征，如果在一周內(nèi)出現(xiàn)被毛逆立，蜷縮惡動(dòng)，食欲下降等不良癥狀，要及時(shí)皮下注射抗生素，改善日糧提高營養(yǎng)供給，抗生素配比為:青霉素 200U/ml，鏈霉素 200ug/ml ；
E、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測
接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，采取常規(guī)剖檢，摘取肺臟做組織研磨涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有香蕉狀的弓形蟲速殖子即可判別為弓形蟲陽性小鼠；五周內(nèi)未死亡的小鼠采血獲取血清，做弓形蟲抗體檢測，檢測結(jié)果陽性的即可判定為弓形蟲陽性，同時(shí)五周內(nèi)未死亡的小鼠做大腦壓片，檢測是否含有弓形蟲包囊；
F、弓形蟲陽性昆明小鼠分離蟲株的獲得接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，經(jīng)肺部研磨涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)香蕉狀弓形蟲速殖子的，可將小鼠肺部研磨接種于細(xì)胞培養(yǎng)，采用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02,連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個(gè)弓形蟲速殖子；五周后的小鼠經(jīng)弓形蟲抗體檢測結(jié)果為陽性的，可將其大腦或心臟研磨，將研磨液接種于細(xì)胞培養(yǎng)(Vero細(xì)胞，37°C，5%C02,連續(xù)培養(yǎng)21天)，即可獲得105個(gè)弓形蟲速殖子。
[0018]弓形蟲分離蟲株的驗(yàn)證:形態(tài)特征為香蕉狀，3-5um;生長特性為在Vero細(xì)胞可連續(xù)傳代；PCR方法鑒定B1基因陽性；WeStern blot方法鑒定SAG1蛋白陽性。
[0019]整個(gè)技術(shù)實(shí)施環(huán)節(jié)要注意以下幾點(diǎn):
1、要保持陽性樣品的新鮮性，提高蟲體的存活率；
2、避免大量樣品處理時(shí)的交叉污染；
3、接種小鼠要極力減少有害細(xì)菌的引入，減少小鼠的應(yīng)激；
4、保障飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，供給有效的營養(yǎng)日糧；
5、技術(shù)實(shí)施環(huán)節(jié)要嚴(yán)格做好記錄。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法，包括以下步驟:A、弓形蟲陽性動(dòng)物樣品的獲得，B、弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液的獲得，C、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液，E、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理，F(xiàn)、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測；其特征在于: A、弓形蟲陽性動(dòng)物樣品的獲得 針對弓形蟲病流行區(qū)域的動(dòng)物進(jìn)行采血，將采集的血液離心獲得動(dòng)物血清，采用弓形蟲檢測試劑對血清弓形蟲抗體進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果為陽性的動(dòng)物個(gè)體標(biāo)記為弓形蟲抗體陽性動(dòng)物，并摘取該陽性動(dòng)物的心臟、肌肉、大腦，隨機(jī)選取三個(gè)部位剪取心臟、肌肉、大腦，三部位總重至少為50克，即獲得的弓形蟲陽性動(dòng)物心肌樣品； B、弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液的獲得: (1)用剪刀將弓形蟲陽性動(dòng)物心肌剪碎； (2)弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿:將剪碎后的弓形蟲陽性動(dòng)物心肌置于勻漿機(jī)內(nèi)，加入生理鹽水勻漿后倒出勻漿液，再用生理鹽水沖洗勻漿機(jī)，勻漿液和沖洗液合為一體為弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液，并用廣口瓶盛放并貼上標(biāo)簽，體積之比為:弓形蟲陽性動(dòng)物心肌:生理鹽水=1:5 ； (3 )胃蛋白酶消化:向弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液內(nèi)加入胃蛋白酶溶液，加入量按體積比為:弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液:胃蛋白酶溶液=1:0.8—1 ;將加入胃蛋白酶溶液的弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液置于37°C的恒溫水浴搖床中l(wèi)h ； (4)過濾離心:將消化好的弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液用一次性紗布過濾并分裝，用常溫低速離心機(jī)離心； (5)調(diào)PH:向(4)離心沉淀物中緩慢加入1.2%的碳酸氫鈉酚紅溶液并震蕩，直至溶液顏色由紅色變?yōu)殚冱S色，此時(shí)PH接近中性； (6)加雙抗:將(5)得到的橘黃色液體再次離心除去上清液，向沉淀中加入與沉淀等體積的青鏈霉素混合液，室溫靜置后即得弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液；青鏈霉素混合液中，青霉素 200U/ml，鏈霉素 200ug/ml ； C、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液 選取健康的昆明小鼠若干，并對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，每一只小鼠背部皮下接種1ml的得弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液； D、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測 接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，采取常規(guī)剖檢，摘取肺臟做組織研磨涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有香蕉狀的弓形蟲速殖子即判別為弓形蟲陽性小鼠；五周內(nèi)未死亡的小鼠采血獲取血清，做弓形蟲抗體檢測，檢測結(jié)果陽性的即判定為弓形蟲陽性，同時(shí)五周內(nèi)未死亡的小鼠做大腦壓片，檢測是否含有弓形蟲包囊； E、弓形蟲陽性昆明小鼠分離蟲株的獲得 接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，經(jīng)肺部研磨涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)香蕉狀弓形蟲速殖子的，將小鼠肺部研磨接種于細(xì)胞培養(yǎng)，采用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02，連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個(gè)弓形蟲速殖子；五周后的小鼠經(jīng)弓形蟲抗體檢測結(jié)果為陽性的，將其大腦或心臟研磨，將研磨液接種于細(xì)胞培養(yǎng)，用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02,連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個(gè)弓形蟲速殖子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法，其特征在于: A、弓形蟲陽性動(dòng)物樣品的獲得 針對弓形蟲病流行區(qū)域的動(dòng)物進(jìn)行采血量為:大動(dòng)物2-3ml/個(gè)體，小動(dòng)物1ml/個(gè)體，將采集的血液離心時(shí)，轉(zhuǎn)速為:5000rpm/min，時(shí)間為5min，溫度為25°C，獲得動(dòng)物血清lOOul，采用弓形蟲檢測試劑對血清弓形蟲抗體進(jìn)行檢測后，摘取該陽性動(dòng)物的心臟；即獲得的弓形蟲陽性動(dòng)物心臟樣品； B、弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液的獲得: 所述(1)心臟處理:剔除心臟的被膜、筋膜、結(jié)締組織、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀將弓形蟲陽性動(dòng)物心臟剪碎； 所述(2)弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿:將剪碎后的弓形蟲陽性動(dòng)物心臟置于勻漿機(jī)內(nèi)15sec后，再加生理鹽水勻漿； 所述(3)胃蛋白酶消化:向弓形蟲陽性動(dòng)物心臟勻漿液內(nèi)加入250ml胃蛋白酶溶液，力口入量按體積比為:弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液:胃蛋白酶溶液=1:0.8-1 ;將加入胃蛋白酶溶液的弓形蟲陽性動(dòng)物心肌勻漿液置于37°C的恒溫水浴搖床中l(wèi)h ;胃蛋白酶溶液配制:胃蛋白酶 5.2g，NaCl 10.0g,6NHCl 28ml,蒸餾水 1000ml，PH=1 ; 所述(4 )過濾離心:將消化好的弓形蟲陽性動(dòng)物肌肉勻漿液用一次性紗布過濾并分裝，用 Μ溫低速尚;1_1、機(jī)尚;1_1、，1200 g, lOmin, 25 C ； 所述(6)加雙抗:將(5)得到的橘黃色液體再次離心，1200g, lOmin, 25°C，除去上清液，向沉淀中加入與沉淀等體積的青鏈霉素混合液，室溫靜置約20min即得弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液；青鏈霉素混合液中:青霉素200U/ml，鏈霉素200ug/ml ； C、昆明小鼠皮下接種心得弓形蟲陽性動(dòng)物肌肉消化液 選取健康的昆明小鼠若干10只，并對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，每一只小鼠背部皮下接種1ml的得弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液，緩慢推針，緩慢退針； D、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理 接種后的小鼠需要每日動(dòng)態(tài)觀察體態(tài)特征，如果在一周內(nèi)出現(xiàn)被毛逆立，蜷縮惡動(dòng)，食欲下降等不良癥狀，要及時(shí)皮下注射抗生素:青霉素200U/ml，鏈霉素200ug/ml ； E、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測 接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，采取常規(guī)剖檢，摘取肺臟做組織研磨涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有香蕉狀的弓形蟲速殖子即可判別為弓形蟲陽性小鼠；五周內(nèi)未死亡的小鼠采血獲取血清，做弓形蟲抗體檢測，檢測結(jié)果陽性的即可判定為弓形蟲陽性，同時(shí)五周內(nèi)未死亡的小鼠做大腦壓片，檢測是否含有弓形蟲包囊； F、弓形蟲陽性昆明小鼠分離蟲株的獲得 接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，經(jīng)肺部研磨涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)香蕉狀弓形蟲速殖子的，將小鼠肺部研磨接種于細(xì)胞培養(yǎng)，采用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02，連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個(gè)弓形蟲速殖子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法，其特征在于: 接種五周后的小鼠經(jīng)弓形蟲抗體檢測結(jié)果為陽性的，將其大腦或心臟研磨，將研磨液接種于細(xì)胞培養(yǎng)，用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02,連續(xù)培養(yǎng)21天，即獲得105個(gè)弓形蟲速殖子。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法，包括以下步驟：A、弓形蟲陽性動(dòng)物樣品的獲得，B、弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液的獲得，C、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動(dòng)物心肌消化液，E、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理，F(xiàn)、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測；本發(fā)明投入成本較低；能夠有大范圍高效地篩選弓形蟲陽性動(dòng)物樣品；分離出新型弓形蟲蟲株的程序簡單，效果顯著，便于常規(guī)條件操作；能夠更方便地為弓形蟲疫苗研究提供新型弓形蟲蟲株；本發(fā)明采用胃蛋白酶消化的方法，可以接種50克或超過50克的組織；背部接種小鼠降低了小鼠的死亡率。
【IPC分類】C12N1/10, C12R1/90
【公開號】CN105420112
【申請?zhí)枴緾N201510951547
【發(fā)明人】楊玉榮, 王英華, 馮永杰, 付曉瑩, 馬超鋒, 郭鋒, 李尚超, 陸瑤瑤
【申請人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月17日