一種基于免疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組snp位點檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種SNP檢測方法，具體涉及一種基于免 疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組SNP位點檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由基因組單個核苷 酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性，是在不同個體的同一條染色體或同一位點的核 苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象。SNP在人類基因組中可 達到300萬個，平均約每1250個堿基對就會有一個SNP位點。研究表明SNP與多種疾病的 發(fā)生相關(guān)，而快速、簡便的檢測這些具有生物學(xué)意義的SNP是準確醫(yī)療診斷的基礎(chǔ)和前提。 一方面，SNP檢測可參考已有的基因組序列進行，目的相對明確。但另一方面，SNP鑒定需檢 測基因組DNA序列上特定核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失情況，對檢測靈敏度、通量以及 準確性等都有特殊的要求。
[0003] 截至目前，已報導(dǎo)的SNP檢測方法將近百種。其中較常用的方法有以下幾大類：首 先，是1995年Livak研究小組報導(dǎo)TaqmMan探針SNP分型法，這種通過將熒光發(fā)色團和淬 滅基團偶聯(lián)在SNP探針的兩端，通過對SNP區(qū)域的RT-PCR實現(xiàn)對探針切割，從而通過檢測 RT-PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號種類區(qū)分等位基因的SNP類型。這種方法具有分析簡單的 特點，已被廣泛應(yīng)用于多樣本單一 SNP位點的檢測，但其探針較為昂貴。其次，是以凝膠電 泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法，如：限制性片段長度多態(tài)性法PCR-RFLP、單鏈構(gòu)象多態(tài) 性法 PCR-SSCP、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 〇 另外，隨機擴增多態(tài)性（RAPD)和寡核苷酸連接分析（OLA)也是較為常用的方法，這幾種方 法檢測信息準確，但都較為煩瑣。再次，是近些年來發(fā)展起來的，高通量、自動化程度較高的 檢測SNP的方法，例如：DNA測序法、DNA芯片檢測、飛行質(zhì)譜儀（MALDI-T0FMS)檢測、變性 高效液相色譜（DHPLC)法等等的高通量分析，其中直接測序是最容易實施的SNP檢測方法， 而MALDI-T0FMS是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價結(jié)合后，在硅芯片 上進行引物的退火、延伸，突變位點配對的堿基與正常配對的堿基不同，在質(zhì)譜儀上顯示不 同峰而檢測SNP。
[0004] 這些方法各具優(yōu)勢，具有操作簡便、檢測特異性高、高通量或高精度等特點，但對 實驗儀器均有特殊要求和較高的依賴性，局限了其應(yīng)用的靈活性和范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于免疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組SNP位點檢測方法，該方 法能夠分析基因 SNP信息，并具有特異性高及儀器依賴性小的優(yōu)點。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種基于免疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組SNP位點檢測方法，包括以下步驟：
[0008] 1)依照待檢測SNP位點相鄰序列，設(shè)計帶有5'-生物素標記的特異性引物和帶有 5' -地高辛標記的特異性SNP探針組；
[0009] 2)將帶有5' -生物素標記的特異性引物與提取出的待檢測基因組DNA進行變性 雜交，然后去除未與待檢測基因組DNA結(jié)合的帶有5'-生物素標記的特異性引物，得到純化 后的與引物雜交的基因組DNA ;
[0010] 3)在PCR反應(yīng)體系中對純化后的與引物雜交的基因組DNA進行單次短時間延伸， 然后通過基因組DNA純化除去PCR反應(yīng)體系，得到帶有生物素標記的延伸產(chǎn)物；
[0011] 4)將帶有生物素標記的延伸產(chǎn)物分別與帶有5' -地高辛標記的特異性SNP探針 組中的不同SNP探針進行變性雜交，使全部或部分帶有生物素標記的延伸產(chǎn)物與SNP探針 互補結(jié)合，然后通過基因組DNA純化分離出與延伸產(chǎn)物結(jié)合的SNP探針、游離引物、多余SNP 探針和其他存在于反應(yīng)體系中的核酸短序列；
[0012] 5)用磁珠捕獲所有帶有生物素標記的與延伸產(chǎn)物結(jié)合的SNP探針及其他帶有生 物素標記的核酸短序列，然后經(jīng)DNA內(nèi)切酶處理，除去與延伸產(chǎn)物不完全互補的SNP探針及 其他帶有生物素標記的核酸短序列，再重新收集磁珠，得到與延伸產(chǎn)物完全互補的SNP探 針；
[0013] 6)用地高辛標記免疫酶聯(lián)反應(yīng)對得到的與延伸產(chǎn)物完全互補的SNP探針進行檢 測，根據(jù)是否發(fā)生顯色判斷SNP的分型，其中基因組SNP位點即為與出現(xiàn)顏色反應(yīng)的SNP探 針相同的核苷酸。
[0014] 所述的帶有5'-生物素標記的特異性引物由基因組SNP位點相鄰上游區(qū)域的基因 序列確定，該特異性引物的長度為20~28bp，該特異性引物的基因序列與基因組SNP位點 相鄰上游區(qū)域的基因序列相同，該特異性引物的3' -端核苷酸緊鄰但不包含基因組SNP位 點，該特異性引物的5' -端帶有生物素修飾基團。
[0015] 所述的帶有5' -地高辛標記的特異性SNP探針組由若干SNP探針組成，其中所有 SNP探針均為與基因組SNP位點相鄰并包含基因組SNP位點的基因序列，該基因序列具體包 括四部分：SNP探針5'-端與特異性引物互補的基因序列、與基因組SNP位點核苷酸互補或 不互補的核苷酸、與基因組SNP位點3' -端相鄰的IObp核苷酸的互補基因序列、以及SNP 探針5' -端的地高辛標記；其中含有與基因組SNP位點核苷酸不互補的核苷酸的SNP探針 為陰性對照探針。
[0016] 所述步驟2)中變性雜交的具體操作條件為：先在95°C水浴中熱變性5min，再在 (Tm - 4) °C水浴中雜交5min，其中Tm為帶有5' -生物素標記的特異性引物的退火溫度，退 火溫度在60~70 °C。
[0017] 所述步驟2)中在變性雜交后，通過E.Z.N. A. Blood DNA kit基因純化試劑盒對基 因組進行純化，去除未與待檢測基因組DNA結(jié)合的帶有5' -生物素標記的特異性引物。
[0018] 所述步驟3)中單次短時間延伸的具體操作條件為：在（Tm-4) °C水浴中反應(yīng) 10~30秒，其中Tm為帶有5' -生物素標記的特異性引物的退火溫度，退火溫度在60~ 70。。。
[0019] 所述步驟4)中變性雜交的具體操作條件為：先在95°C水浴中熱變性5min，再在 (Tm - 4) °C水浴中雜交5min，其中Tm為帶有5' -生物素標記的特異性引物的退火溫度，退 火溫度在60~70 °C。
[0020] 所述步驟5)中的磁珠為鏈霉素親和生物素磁珠，其可與延伸產(chǎn)物上的生 物素標記結(jié)合，從而達到分離延伸產(chǎn)物的目的；所述的DNA內(nèi)切酶為T7核酸內(nèi)切酶 I (T7Endonuclease I)，用于特異性切割不完全配對的dsDNA。
[0021] 所述步驟6)中的地高辛標記免疫酶聯(lián)反應(yīng)，是通過抗地高辛-HRP偶聯(lián)抗體結(jié)合 帶有5' -地高辛標記的SNP探針，催化HRP底物進行顯色反應(yīng)，其中HRP底物為TMB (3, 3' ，5, 5' -tetramethylbiphenyl，3, 3' 5, 5' -四甲基聯(lián)苯雙酸二縮水甘油醚）顯色底物，終止 反應(yīng)液為2mol/L的H2SO40
[0022] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0023] 本發(fā)明提供的基于免疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組SNP位點檢測方法，首先針對基因組 SNP位點設(shè)計帶有5' -生物素標記的特異性引物及帶有5' -地高辛標記的特異性SNP探 針組，然后將引物與提取的基因組DNA進行雜交，再對與引物雜交的基因組DNA進行單次短 時間延伸，然后將延伸產(chǎn)物分別與特異性SNP探針組中的SNP探針進行變性雜交和退火，使 全部或部分延伸產(chǎn)物與SNP探針結(jié)合；再用磁珠捕獲帶有生物素標記的與延伸產(chǎn)物結(jié)合的 SNP探針，通過DNA內(nèi)切酶處理，切除與延伸產(chǎn)物不完全互補的SNP探針；最后用地高辛標 記免疫酶聯(lián)反應(yīng)對結(jié)果進行檢測，根據(jù)是否發(fā)生顯色判斷SNP的分型：基因組SNP即為與出 現(xiàn)顏色反應(yīng)的SNP探針相同的核苷酸。本發(fā)明屬于PCR非依賴性方法，雖然只包括單次延 伸反應(yīng)，但通過3次特異性篩選和1次信號放大過程，保證了結(jié)果的特異性和靈敏度。其中， 3次特異性篩選過程為：①通過特異性引物與模板的結(jié)合與單次延伸合成出被檢測序列和 非特異延伸的雜片斷；②通過磁珠捕獲去除基因組、基因組降解短片斷及未與延伸產(chǎn)物結(jié) 合的多余SNP探針，此時捕獲產(chǎn)物中僅為與SNP探針結(jié)合的被檢序列和非特異序列；③通 過T7內(nèi)切酶I對不完全互補的序列（包括所有雜序列和非同型SNP探針序列）進行切割， 剩余序列中只有可以與延伸產(chǎn)物SNP性質(zhì)相同的地高辛標記得以保留，保證了反應(yīng)的特異 性。1次信號放大過程為：通過地高辛免疫酶聯(lián)反應(yīng)放大信號，提高反應(yīng)的靈敏度。另外， 本發(fā)明提供的方法中包含的試劑及操作工具均較輕便，可由發(fā)明試劑盒提供，依賴的外在 設(shè)備僅為加熱裝置，即：具有實驗儀器及環(huán)境要求低的優(yōu)點，可在不具備專業(yè)儀器的實驗環(huán) 境或野外操作環(huán)境下進行檢測?？赡茉谖磥砑膊〉某醪胶Y查、刑偵初步判斷等領(lǐng)域得以應(yīng) 用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明提供的基于免疫酶聯(lián)反應(yīng)的基因組SNP位點檢測方法的流程示意 圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0026] 本發(fā)明公開了一種SNP檢測方法，該方法基于生物素標記引物的Taq酶單向延伸、 DNA限制性酶切、地高辛偶聯(lián)核酸探針的免疫酶聯(lián)反應(yīng)實施。該方法包括：針對基因組SNP 位點設(shè)計帶有5' -生物素標記的特異性引物及帶