一種從轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中分離人乳鐵蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于乳制品分離領(lǐng)域，特別涉及一種從轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中分離人乳鐵蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳鐵蛋白分子的主體是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為80000的單肽鏈，并連接1-2個(gè)配糖體。乳鐵蛋白廣泛分布于哺乳動(dòng)物乳汁和其他多種組織及其分泌液中(包括淚液、精液、膽汁、滑膜液等內(nèi)、外分泌液和嗜中性粒細(xì)胞)，人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0-3.2mg/ml,是牛乳中的10倍(牛乳中含量為0.02-0.35mg/ml)，占普通母乳總蛋白的20%，在泌乳期間，乳鐵蛋白含量隨著泌乳時(shí)間的不同而發(fā)生變化，如人初乳中乳鐵蛋白可達(dá)6-14mg/ml，常乳期降至lmg/ml。
[0003]乳鐵蛋白的主要作用功效是:
[0004]1.促進(jìn)人體對(duì)鐵的吸收。寶寶吮吸母乳后，在他的消化道內(nèi)母乳中的乳鐵蛋白會(huì)高親和性地與鐵結(jié)合，將鐵運(yùn)到小腸細(xì)胞內(nèi)并釋放出鐵，以供給寶寶全身的需求。
[0005]2.乳鐵蛋白另有一種特殊功能是具有抑菌、殺菌與抗病毒的作用，且對(duì)人體內(nèi)的益生菌(如雙歧桿菌)卻并無害處。
[0006]3.乳鐵蛋白還有促進(jìn)和增強(qiáng)人體內(nèi)的中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的免疫作用，并且乳鐵蛋白還對(duì)機(jī)體抗體的生成起調(diào)節(jié)完善作用，甚至有研究顯示乳鐵蛋白還可促進(jìn)腦細(xì)胞和骨骼的生長，還有抗氧化的功能等等。
[0007]乳鐵蛋白由于其強(qiáng)大的功能在嬰幼兒配方產(chǎn)品、保健食品和發(fā)酵乳制品等領(lǐng)域的應(yīng)用在許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)為大家了解。乳鐵蛋白作為食品添加劑在許多國家已被允許用于功能性食品中，并有試驗(yàn)證明其安全可靠，無副作用。美國食品藥品管理局證實(shí)，乳鐵蛋白不但可用于普通人群，而且可用于對(duì)牛奶過敏的特殊人群。
[0008]乳鐵蛋白已經(jīng)在一些發(fā)達(dá)國家如新西蘭和澳大利亞實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，通過運(yùn)用超濾和冷凍干燥等技術(shù)，可以得到乳鐵蛋白純度超過90%的產(chǎn)品，同時(shí)保持產(chǎn)品的生物活性且不會(huì)有苦澀的味道，使之能夠成功應(yīng)用于保健食品和功能性食品中。
[0009]目前關(guān)于提純?nèi)殍F蛋白(LF)的報(bào)道較多，最常用的方法是陽離子交換層析法，將奶制品離心脫脂，酸化脫酪或是凝乳酶脫酪，過層析柱，或用合適濃度的鹽洗脫。然而各個(gè)方法結(jié)果之間有較大差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種快速有效、成本低、純度高、回收率高，從轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中工業(yè)化分離人乳鐵蛋白的方法。
[0011]在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種從轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中分離人乳鐵蛋白的方法，包括步驟:
[0012](1)對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊乳汁進(jìn)行離心處理和過濾處理，從而得到脫脂乳清；
[0013](2)對(duì)步驟(1)得到的脫脂乳清與弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行攪拌吸附，從而得到吸附在該陽離子交換樹脂上的脫脂乳清；
[0014](3)對(duì)步驟(2)得到的吸附在陽離子交換樹脂上的脫脂乳清用洗滌劑洗滌，從而得到經(jīng)洗滌的吸附在陽離子交換樹脂上的脫脂乳清；
[0015](4)對(duì)步驟(3)得到的經(jīng)洗滌的吸附在陽離子交換樹脂上的脫脂乳清用洗脫劑進(jìn)行洗脫，從而得到含人乳鐵蛋白的洗脫液；
[0016](5)對(duì)步驟(4)得到的含人乳鐵蛋白的洗脫液進(jìn)行過濾，收集濾液；
[0017](6)對(duì)步驟(5)得到的濾液進(jìn)行濃縮。
[0018]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的離心處理為在45_60°C下，8000_10000r/min，離心15-30分鐘；和/或步驟(1)中，所述的過濾處理為用紗布過濾。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的離心處理為在50-60°C下，8000-10000r/min，離心15-30分鐘。
[0020]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，所述的弱酸性陽離子交換樹脂為724樹脂；和/或步驟(2)中，所述的弱酸性陽離子交換樹脂和脫脂乳清的重量比為1:3 — 1:1 ;較佳地，為
3:7。
[0021]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，所述的攪拌吸附進(jìn)行4-8小時(shí)；和/或步驟(2)中，所述的攪拌吸附是在4-20°C下進(jìn)行；和/或步驟(2)中，所述的攪拌吸附是在50-200r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行。
[0022]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，所述洗滌劑為0.1-0.5mol/L NaCl溶液；較佳地，所述洗滌劑為0.1-0.5mol/L NaCl磷酸鹽緩沖液。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述洗滌劑為0.1-0.5mol/L NaCl磷酸鹽緩沖液，pH7.4。
[0024]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，在用洗滌劑洗滌之前，先用純水對(duì)步驟(2)得到的吸附在陽離子交換樹脂上的脫脂乳清進(jìn)行洗脫，至溶液澄清。
[0025]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，所述洗滌劑為1-5倍(優(yōu)選為3倍)于樹脂體積的
0.lmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，ρΗ7.4。
[0026]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，洗脫1-5次；較佳地，洗脫4次。
[0027]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，每次洗脫10-60分鐘；較佳地，每次洗脫30分鐘。
[0028]在另一優(yōu)選例中，步驟⑷中，所述洗脫液為8 % ± 4 % NaCl溶液或5 % ± 2 %硫酸銨溶液；較佳地，所述洗脫液為8% ±4% NaCl磷酸鹽緩沖液或5% ±2%硫酸銨水溶液。
[0029]在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中，所述洗脫液為等樹脂體積的8%NaCl磷酸鹽緩沖溶液或等樹脂體積的5 %硫酸銨水溶液。
[0030]在另一優(yōu)選例中，步驟⑷中，洗脫1-5次；較佳地，洗脫4次。
[0031]在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中，每次洗脫10-60分鐘；較佳地，每次洗脫40分鐘。
[0032]在另一優(yōu)選例中，步驟(5)中，對(duì)步驟(4)得到的含人乳鐵蛋白的洗脫液先用0.22微米的濾膜過濾，再用截留分子量為30000D的膜超濾，收集超濾液。
[0033]在另一優(yōu)選例中，步驟￠)中，對(duì)步驟(5)得到的濾液進(jìn)行濃縮脫鹽。
[0034]在另一優(yōu)選例中，在步驟(6)之后，還包括步驟:將對(duì)濃縮后的產(chǎn)品進(jìn)行凍干。
[0035]在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)和步驟(2)之間，還包括對(duì)弱酸性陽離子交換樹脂的預(yù)處理步驟:對(duì)弱酸性陽離子交換樹脂依次經(jīng)水、堿性溶液、酸性溶液、堿性溶液以及磷酸鹽緩沖液處理。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述堿性溶液為0.5-5% (較佳地，為3%或4% )的NaOH水溶液。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述酸性溶液為1-5% (較佳地，為4% )的HC1水溶液。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述磷酸緩沖液為0.05-0.5mol/L (較佳地，為0.2mol/L)的磷酸鹽緩沖液，pH = 6.5。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述磷酸緩沖液包括:0.2mol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，pH = 6.5。
[0040]在另一優(yōu)選例中，對(duì)弱酸性陽離子交換樹脂依次進(jìn)行如下處理:
[0041]先用水洗；
[0042]再用0.5-5 % (較佳地，為3 % )的NaOH水溶液攪拌浸泡4_6h，用純水洗滌至流出液的 pH 值 7.5 ±0.2 ;
[0043]再用1-5 % (較佳地，為4% )的HC1水溶液攪拌浸泡4_6h，用純水洗滌至流出液的 pH 值 5.5±0.2 ；
[0044]再用0.5-5 % (較佳地，為4 % )的NaOH水溶液攪拌浸泡4_6h，用純水洗滌至流出液的pH值7.5±0.2 ;和
[0045]最后用0.05-0.5mol/L (較佳地，為0.2mol/L)的磷酸鹽緩沖液，pH = 6.5，處理lh0
[0046]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0047]圖1為從轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中工業(yè)化提取人乳鐵蛋白的工藝流程示意圖。
[0048]圖2為實(shí)施例2中，724樹脂分離過程的SDS-PAGE電泳圖；其中，泳道Μ為蛋白分子量Marker ;泳道1為上樣脫脂脫酪乳清；2是724樹脂吸附后的洗脫液；3是用5%硫酸銨溶液洗脫后的洗脫液；泳道4是超濾后純化的rhLF。
[0049]圖3為對(duì)比例1中，732樹脂純化過程的SDS-PAGE電泳圖；其中，泳道Μ為蛋白分子量Marker ;泳道1是上樣脫